《高效毛细管电泳》PPT课件.ppt

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1、第十章 高效毛细管电泳法 电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下，以电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离分析的方种现象对化学和生物化学组分进行分离分析的方法称之为电泳法。法称之为电泳法。传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的高电压所引起的电介质离子流的自热，或称高电压所引起的电介质离子流的自热，或称焦耳热焦耳热,从而导致区带展宽，影响迁移，降从而导致区带展宽，影响迁移，降低效率低效率,因此极大地限制了高压的使用因此极大地限制了高压的使用.当然

2、当然也就难以加快整个过程的速度。也就难以加快整个过程的速度。1 毛细管电泳（毛细管电泳（capi1lary electrphoresis，CE）和传统电泳的根本区）和传统电泳的根本区别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改善分离质量。全面改善分离质量。20世纪世纪3040年代年代 蒂塞利乌斯蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建建立了移动界面电泳，将立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术电泳发展成分离技术 获得获得1948年诺贝尔化年诺贝尔化学奖学奖2l967年年

3、Hjerten最先提出在高电场强度，直最先提出在高电场强度，直径为径为3mm的毛细管中作自由溶液的毛细管的毛细管中作自由溶液的毛细管区带电泳，开创了区带电泳，开创了CE的先河。的先河。n1981年，实验上和理论上为毛细管电泳的发实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。展奠定了基础。n198889年，商品化的毛细管电泳仪推出，年，商品化的毛细管电泳仪推出，毛细管电泳法迅速发展起来。毛细管电泳法迅速发展起来。第一节第一节 毛细管电泳的特点和分类毛细管电泳的特点和分类一、电泳和色谱一、电泳和色谱1.分离原理分离原理3 电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生定

4、向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不定向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不同，导致不同的迁移速度而分离。色谱是不同组同，导致不同的迁移速度而分离。色谱是不同组分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。但分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。但某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离机制。机制。2.分离过程分离过程 电泳和色谱的分离过程都是差速迁移过程，可电泳和色谱的分离过程都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述。色谱中所用的一些名词概用相同的理论来描述。色谱中

5、所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论、速率理论念和基本理论，如保留值、塔板理论、速率理论等均可借用于毛细管电泳中。等均可借用于毛细管电泳中。43.仪器流程仪器流程5二、毛细管电泳的特点二、毛细管电泳的特点1.柱效高柱效高 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到米，特殊柱子可以达到数百万。数百万。色谱仪和电泳仪（色谱仪和电泳仪（HPLC和和CE），都包括进），都包括进样部分、分离柱、检测器和数据处理等。样部分、分离柱、检测器和数据处理等。2.消耗低消耗低 CE所需样品为所需样品

6、为nl级级,流动相用量也只需几毫流动相用量也只需几毫升升,而而HPLC所需样品为所需样品为l级级,流动相则需几百流动相则需几百毫升乃至更多。毫升乃至更多。63.速度快速度快一般几十秒至十几分，最多半小时，即可完成一一般几十秒至十几分，最多半小时，即可完成一个试样的分析。个试样的分析。4.应用广泛应用广泛 通过改变操作模式和缓冲液的成分，通过改变操作模式和缓冲液的成分，CE有有很大的选择性，可以根据不同的分子性质，对很大的选择性，可以根据不同的分子性质，对极广泛的对象进行有效的分离。极广泛的对象进行有效的分离。CE分离有机分子、药物分子，特别是手分离有机分子、药物分子，特别是手性分子和生物大分子

7、方面的能力，对性分子和生物大分子方面的能力，对HPLC地位提出了严峻的挑战。地位提出了严峻的挑战。7三、毛细管电泳的分类三、毛细管电泳的分类按分离模式分类，常用的技术有六种：按分离模式分类，常用的技术有六种：毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱，毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱，毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦，毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳毛细管等速电泳，毛细管电色谱，毛细管电色谱 毛细管区带电泳是毛细管区带电泳是CE中最基本、应用最普遍中最基本、应用最普遍的一种模式。的一种模式。第二节第二节 基本原理基本原理一、电泳和电泳淌度一、电泳和电泳淌度1.电泳与电泳速度电泳与电泳速度

8、8 在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电场力为场力为q:溶质离子所带的有效电荷溶质离子所带的有效电荷 E:电场强度电场强度带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力为带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力为是电泳速度是电泳速度9 f为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、形状以及介质粘度有关。对于球形离子，形状以及介质粘度有关。对于球形离子，f=6；对于棒状离子，；对于棒状离子

9、，f=4。式中，。式中，是是溶质离子的动力学半径，溶质离子的动力学半径，是电泳介质的粘度。是电泳介质的粘度。平衡时，电场力和摩擦力相等，即平衡时，电场力和摩擦力相等，即qE=fvep 电泳速度为电泳速度为10不同物质在同一电场中，由于它们的有效电荷、不同物质在同一电场中，由于它们的有效电荷、形状大小的差异，它们的电泳速度不同，所以可形状大小的差异，它们的电泳速度不同，所以可能实现分离能实现分离 我们把溶质在给定溶液中和单位电场强度下的我们把溶质在给定溶液中和单位电场强度下的电泳速度称为电泳淌度，用电泳速度称为电泳淌度，用ep表示。表示。2 2电泳淌度电泳淌度 11所以淌度不同是电泳分离的内因和

10、前提。所以淌度不同是电泳分离的内因和前提。溶质粒子的电泳速度决定于粒子淌度和电场强溶质粒子的电泳速度决定于粒子淌度和电场强度的乘积，度的乘积，vep epE在一定条件下，不同粒子的形状、大小以及所在一定条件下，不同粒子的形状、大小以及所带电量都可能有差别，则电泳淌度也可能不同。带电量都可能有差别，则电泳淌度也可能不同。（1）绝对淌度（）绝对淌度（ab）是在无限稀释时单位电场强度下离子的平是在无限稀释时单位电场强度下离子的平均迁移速度，它是该离子在一定溶液中的均迁移速度，它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。一个特征物理常数。12（2）有效淌度（）有效淌度（ef）我们不可能在无限稀释而又没有

11、其它离子、我们不可能在无限稀释而又没有其它离子、酸度等影响下进行工作，有效淌度是实际酸度等影响下进行工作，有效淌度是实际的离子电泳淌度。的离子电泳淌度。（3）表观淌度（）表观淌度（ap）在有电渗存在下，测得的实际离子淌度称为表在有电渗存在下，测得的实际离子淌度称为表观淌度或净淌度，是有效淌度观淌度或净淌度，是有效淌度ef和电渗淌度和电渗淌度os的矢量和。的矢量和。ap=osef13二、电渗和电渗流二、电渗和电渗流1电渗现象电渗现象 当固体与液体相接触时，如果固体表面因当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电

12、荷，当液体两端施加一定电压时，液体带相反电荷，当液体两端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫做电渗。象叫做电渗。14 高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲液缓冲液PH2时，管壁的硅醇基（时，管壁的硅醇基（SiOH）离解成）离解成硅醇基阴离子（硅醇基阴离子（SiO），使管壁带负电荷，溶），使管壁带负电荷，溶液液带正电荷带正电荷，在管壁和溶液之间形成双电层。，在管壁和溶液之间形成双电层。Zeta电位电位15 由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，在外在外

13、电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，将将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。电泳中的电渗现象。2。电渗流（。电渗流（electroosmotic flow，EOF）电渗现象中整体电渗现象中整体移动着的液体叫移动着的液体叫电渗流。电渗流。163.电渗流的大小和方向电渗流的大小和方向电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度vos表示，其大小表示，其大小决定于电渗淌度决定于电渗淌度os和电场强度和电场强度E。即。即 、分别是电泳介质的介电常数和粘度分别是电泳介质的介电常数和粘度,毛细

14、管壁的毛细管壁的Zeta电位，它近似等于扩散层与紧电位，它近似等于扩散层与紧密层界面上的电位。该界面内净电荷数（正电荷密层界面上的电位。该界面内净电荷数（正电荷数）越多、扩散层越厚，数）越多、扩散层越厚，Zeta电位越大电位越大.17 Lef毛细管有效长度；毛细管有效长度；tos电渗流标记物电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。（中性物质）的迁移时间。电渗流的速度是电泳速度的电渗流的速度是电泳速度的57倍。倍。一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细管内壁改性，比如在在内壁

15、表面涂渍或键合一层管内壁改性，比如在在内壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电渗流带负电荷，向正极移动。渗流带负电荷，向正极移动。VOS可通过实验测定可通过实验测定18 在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。4.电渗流的流形电渗流的流形19 H

16、PLC流动相的流形为抛物线形的层流，在流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的的2倍，倍，引起的谱峰展宽较大。引起的谱峰展宽较大。电渗流呈平流，电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，引起的谱峰展宽很小，是毛是毛细管电泳能获得较细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要更高分离效率的重要原因。原因。4.电渗流的作用电渗流的作用 电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的离子电泳速度的57倍。所以，各种电性物质在倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为

17、毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用表观电泳速度，用vap表示。表示。2021阳离子：阳离子：vapvos+vef阴离子：阴离子：vapvosvef中性分子：中性分子：vapvos 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是：先后流出毛细管。出峰次序是：阳离子阳离子中性分子中性分子阴离子阴离子中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。vap=apE=(osef)E22电渗流具有像电渗流具有

18、像HPLC中泵一样的作用，推动离子中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。成阳离子、阴离子和中性离子的分离。改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。中优化分离的重要因素。电渗流在电渗流在HPCE HPCE 的分离中起着极其重要的作用：的分离中起着极其重要的作用：电渗流的微小变化影响分离结果的重现性电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁（迁移时间和峰面积）移时间和峰面积）。电泳中影响电渗流的因素很

19、多，应设法控制电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。电渗流的恒定。23三、三、HPCEHPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是基的电离，特别是在在pH47范围内，影响范围内，影响更显著，此时溶液更显著，此时溶液pH值值与与EOF成近线性关系成近线性关系 243.3.电解质溶液性质的影响电

20、解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁电荷密度增加，管壁zetazeta电势增大，电渗流增大，电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大；，达到最大；pH3 pH3，完全被氢离子中和，表面，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持持pHpH稳定。稳定。（2 2）缓冲液阴离子的影响）缓冲液阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电

21、流有较大差别，产生的焦耳热不同。毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。25缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。（3）缓冲液浓度（离子强度）的影响）缓冲液浓度（离子强度）的影响26274.4.温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，

22、产生焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；的热量；HPCEHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。浓度及电场强度成正比。温度每变化温度每变化1 1度，将引起背景电解质溶液粘度度，将引起背景电解质溶液粘度变化变化2%2%3%3%；285.5.添加剂的影响添加剂的影响（1 1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K K2 2SOSO4 4，溶液离子，溶液离子强度增大，电渗流减小。强度增大，电渗流减小。（2 2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向 某些阳离子表面活性剂使电渗

23、流减小，某些阴某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDSSDS），可以），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3 3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。小，电渗流增大。2930四、柱效和分离度四、柱效和分离度（一）理论塔板数和塔板高度（一）理论塔板数和塔板高度用理论塔板数用理论塔板数n和塔板高度和塔板高度H表示柱效。表示柱效。n可可以直接由电泳图求出以直接由电泳图求出tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁为起点到谱峰最高点所对

24、应的时间，称为迁移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。组分在固定相中分配和保留。31塔板高度塔板高度H为：为：Lef为进样口到检测器的距离为进样口到检测器的距离,为有效柱长为有效柱长.检测器在柱上，检测器在柱上，Lef电泳电泳,阴离子在负极最后流出。阴离子在负极最后流出。CZE是最基本、应用最广的分离模式是最基本、应用最广的分离模式51（二）分离条件的选择（二）分离条件的选择1 1缓冲液缓冲液 电泳过程在缓冲液中进行，缓冲液的选择直电泳过程在缓冲液中进行，缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和最后的分离接影响粒子的迁移和最后的分离.

25、缓冲液的选择通常须遵循下述要求：缓冲液的选择通常须遵循下述要求：（l）在所选择的）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量；范围内有很好的缓冲容量；（2）在检测波长处无吸收或吸收值低；）在检测波长处无吸收或吸收值低；（3）为了达到有效的进样和合适的电泳淌度，）为了达到有效的进样和合适的电泳淌度，缓冲液的缓冲液的pH值至少必须比被分析物质的等电点值至少必须比被分析物质的等电点相差相差l个个pH单位。单位。52(5)只要条件允许就尽可能采用酸性缓冲液，在只要条件允许就尽可能采用酸性缓冲液，在低低pH值下，吸附和电渗流都很小，毛细管涂层值下，吸附和电渗流都很小，毛细管涂层的寿命较长。的寿命较长。在配制毛

26、细管电泳用的缓冲液时，必须使用高在配制毛细管电泳用的缓冲液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂，另外用前要用的滤器过滤以纯蒸馏水和试剂，另外用前要用的滤器过滤以除去颗粒等。除去颗粒等。（4）自身的淌度低，即分子大而荷电小，）自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生以减少电流的产生 53名名 称称pKa名名 称称pKa磷酸磷酸柠柠檬酸檬酸 甲酸甲酸盐盐2-羟羟基异丁酸基异丁酸琥珀酸琥珀酸盐盐 谷氨酸谷氨酸乙酸乙酸盐盐2-N-吗吗啉啉乙磺酸乙磺酸N-2-乙乙酰酰氨基氨基-2-亚亚氨基双乙酸氨基双乙酸L,3-双双三（三（羟羟甲基）甲氨基甲基）甲氨基丙丙烷烷哌嗪哌嗪-N,N-双双乙磺酸乙磺酸 2-（2

27、-氨基氨基-2-氧代乙基）氨基氧代乙基）氨基乙磺酸乙磺酸3-N-吗吗咪咪-2-羟羟基丙磺酸基丙磺酸咪咪唑唑3-N-吗吗啉啉-丙磺酸丙磺酸2.l23.063.753.974.l94.324.756.156.606.806.806.906.907.007.20.N-三三羟羟甲基甲基甲基甲基-2-氨基乙磺酸氨基乙磺酸N-2-羟羟乙基乙基哌嗪哌嗪-N-2-乙磺酸乙磺酸N-2-羟羟乙基乙基哌嗪哌嗪-N-2-羟羟丙磺酸丙磺酸N-（2-羟羟甲基）乙基甲基）乙基甘氨酸甘氨酸甘氨甘氨酰酰胺，胺，盐盐酸化物酸化物N-甘氨甘氨酰酰甘氨酸甘氨酸三（三（羟羟甲基）甲基）氯氯基甲基甲烷烷N,N-双双2-羟羟乙基乙基甘氨酸

28、甘氨酸吗吗啉啉硼酸硼酸盐盐2-N-环环己氨基己氨基乙磺酸乙磺酸3（3-胆胆酰酰胺丙基）胺丙基）-二甲基二甲基铵铵-2-羟羟基基-1-丙磺酸内丙磺酸内盐盐3-环环己氨基己氨基-1-丙磺酸丙磺酸7.507.558.008.158.208.258.308.358.499.249.509.6010.40 一些常用缓冲溶液及其一些常用缓冲溶液及其pKa值值542添加剂添加剂 在在CZE分离中，常常还在缓冲溶液中添加某种试分离中，常常还在缓冲溶液中添加某种试剂，通过它与管壁或与样品溶质之间的相互作用，剂，通过它与管壁或与样品溶质之间的相互作用，改变管壁或溶液相物理化学特性，进一步优化分改变管壁或溶液相物理

29、化学特性，进一步优化分离条件，提高分离选择性和分离度。离条件，提高分离选择性和分离度。常用添加剂有表面活性剂、有机溶剂、中性常用添加剂有表面活性剂、有机溶剂、中性盐类、两性物质和手性选择剂等，盐类、两性物质和手性选择剂等，3工作电压工作电压 电压是控制柱效电压是控制柱效n、分离度、分离度Rs和迁移时间和迁移时间tm的重的重要因素。在焦耳热可以忽略的条件下，外加电压要因素。在焦耳热可以忽略的条件下，外加电压增大，分离时间缩短、柱效和分离度提高增大，分离时间缩短、柱效和分离度提高.55但电压升高，产生的焦耳热增多，在不能有效但电压升高，产生的焦耳热增多，在不能有效地驱散所产生的焦耳热情况下，柱温显

30、著升高，地驱散所产生的焦耳热情况下，柱温显著升高，工作电流增大，柱效和分离度降低。工作电流增大，柱效和分离度降低。除了采取有效的散热措施外，选择一种合适的除了采取有效的散热措施外，选择一种合适的条件，使在此条件下允许使用较高电压，而不条件，使在此条件下允许使用较高电压，而不致产生过高的电流和过多的焦耳热，是非常重致产生过高的电流和过多的焦耳热，是非常重要的。要的。一般通过作一般通过作IV曲线来选择体系的最佳外加曲线来选择体系的最佳外加电压值。电压值。565758二、胶束电动毛细管色谱（二、胶束电动毛细管色谱（MECCMECC或或MEKCMEKC）胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液

31、中加入浓是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分离中起到了准固定相的作用，是电泳技术与色谱离中起到了准固定相的作用，是电泳技术与色谱技术的结合。技术的结合。把离子型表面活性剂把离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠如十二烷基硫酸钠)加到加到缓冲液中缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就形成有一当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电,但电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度但电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束故胶束将慢速向负极移动。将慢速向负极移动。（一）分离原理

32、（一）分离原理 5960 中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液（流动相）和胶束（流动相）和胶束（准固定相）准固定相）之间分配。之间分配。疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分配到缓冲溶液中的多。当溶质进入胶束时，配到缓冲溶液中的多。当溶质进入胶束时，以胶束的速度慢速迁移；溶质进入缓冲溶液以胶束的速度慢速迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度快速前移。分配系数越大时，以电渗的速

33、度快速前移。分配系数越大的粒子，在柱中迁移速度慢，从而使疏水性的粒子，在柱中迁移速度慢，从而使疏水性稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。61 MECC的突出优点是除能分离离子化合物外，的突出优点是除能分离离子化合物外，还能分离不带电荷的中性化合物。还能分离不带电荷的中性化合物。（二）分离条件的选择（二）分离条件的选择 胶束准固定相对胶束准固定相对MECC分离过程起着重要作用。分离过程起着重要作用。准固定相为各类表面活性剂，对其要求是：准固定相为各类表面活性剂，对其要求是：胶束的粘度小；胶束的粘度小；水溶性好水溶性好形成的胶束必须均匀、透明，不吸收形成的胶束必

34、须均匀、透明，不吸收UV光光 临界胶束浓度临界胶束浓度CMC不宜太高不宜太高胶束具有足够的稳定性胶束具有足够的稳定性62类类 型型表面活性表面活性剂剂CMC（10-3mol/L）阴离子表面活性阴离子表面活性剂剂十二十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠（SDS）8.1十四十四烷烷基硫酸基硫酸钠钠（STS）2.1N-月桂月桂酰酰-N-甲基牛磺酸甲基牛磺酸钠钠（LMT）8.7聚氧乙聚氧乙烯醚烯醚基十二基十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠2.8两性离子表面活性两性离子表面活性剂剂N-十二十二酰酰基基-L-氨酸氨酸钠钠（SDVal）5.7 阳离子表面活性阳离子表面活性剂剂十二十二烷烷基三甲基基三甲基氯氯化化铵铵（DTAC）1

35、6十二十二烷烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵铵（DTAB）15十四十四烷烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵铵（TTAB）3.5十六十六烷烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵铵（CTAB）0.92一些常用的表面活性剂及其临界浓度一些常用的表面活性剂及其临界浓度 6364三、毛细管凝胶电泳（三、毛细管凝胶电泳（CGECGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细长的网状多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的长的网状多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的作用。电荷作用。电荷/质量比相等但大小不同的分子，在电质量比相等但大小不同的分子，在电场力的作用下发生迁移，其运动速度受到凝胶网

36、状场力的作用下发生迁移，其运动速度受到凝胶网状结构的阻碍。大分子受到的阻力大，移动速度慢，结构的阻碍。大分子受到的阻力大，移动速度慢，小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它们得小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它们得以分离。以分离。蛋白质、蛋白质、DNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无质量比与分子大小无关，在关，在CZE模式中，淌度几乎没有差别，很难分离，模式中，淌度几乎没有差别，很难分离，采用采用CGE能获得良好分离，是研究能获得良好分离，是研究DAN排序的重要排序的重要手段。手段。65酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离66四、毛细管电色谱（四、毛细管电色谱（CECCEC）将细粒径

37、固定相填充到毛细管中或在毛细管将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁键合固定相，毛细管两端施加高电压，以电内壁键合固定相，毛细管两端施加高电压，以电渗流驱动操作缓冲液。它也包含了电泳和色谱两渗流驱动操作缓冲液。它也包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据它们在流动相和固定相中的分种机制，溶质根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身淌度的差异得以分离。配系数不同和自身淌度的差异得以分离。电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学层流轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比动力学层流轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。高效液相色谱法高。目前反相毛细管电色谱研究应用最多。目前反相毛细管电色谱研究应用最多。67