仪器分析高效液相色谱法.ppt

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1、高效液相色谱法高效液相色谱法 high performance liquid chromatography 1p以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。与实验方法，发展而成的分离分析方法。p以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等的优点。度快、应用范围广等的优点。第一节第一节 概述概述 2与气相色谱法对比与气相色谱法对比pGC 快速、分离效率高、样品用量少。在约快速、分离

2、效率高、样品用量少。在约300万个有机化合物中，可以直接用该法分析的万个有机化合物中，可以直接用该法分析的占占20%。pHPLC 快速、分离效率高、样品不受挥发性及快速、分离效率高、样品不受挥发性及热稳定性的约束，因而分析对象广。热稳定性的约束，因而分析对象广。3与经典液相色谱法的比较与经典液相色谱法的比较LCHPLC固定相粒度固定相粒度(m)70590%310柱柱长长（cm）101001030柱内径（柱内径（cm）250.10.5柱效（柱效（n）10100103105样样品用量（品用量（g）11010-710-2分析分析时间时间（h）1200.051装置装置非非仪仪器化器化仪仪器化器化4第一

3、节第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的主要类型和原理pLLC和和LSCp分配、吸附、离子交换和空间排阻分配、吸附、离子交换和空间排阻p化学健合相色谱法化学健合相色谱法 ISC和和PIC/IPC5二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法p将固定液的官能团键合在载体的表面构成化学键将固定液的官能团键合在载体的表面构成化学键合相。合相。p以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱法。法。p键合相色谱法是应用最广的色谱法。键合相色谱法是应用最广的色谱法。6键合相色谱法键合相色谱法p正相色谱法p反相色谱法RHPLC ISCPIC or IPC7

4、（一）正相键合相色谱法（一）正相键合相色谱法p 固定相：氰基、氨基化学键合相。氨基键固定相：氰基、氨基化学键合相。氨基键 合相合相色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱。色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱。p 流动相：烷烃（底剂）流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂极性调节剂p 分离机制：范德华作用力（定向力、诱导力或分离机制：范德华作用力（定向力、诱导力或氢键）氢键）流动相的极性与容量因子的关系：流动相的极性与容量因子的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k，tR 8（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法p常用固定相：十八烷基硅烷（常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS）p常用流动相：甲

5、醇常用流动相：甲醇水，乙腈水，乙腈水水p分析对象：非极性、中等极性的分子型化合分析对象：非极性、中等极性的分子型化合物物p分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。保留是溶质分子与极性分子间的排斥力。9反相键合相色谱法反相键合相色谱法影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素影响保留行为的因素pp溶质的分子结构溶质的分子结构溶质的分子结构溶质的分子结构 极性极性，疏水性，疏水性，k，tR pp流动相流动相流动相流动相 与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的流

6、动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度影响溶质的离解程度，离解程度，k pp固定相固定相固定相固定相 随碳链延长，键合相疏水性随碳链延长，键合相疏水性，k 碳链一定时，键合相浓度碳链一定时，键合相浓度，k 10离子抑制色谱法离子抑制色谱法 ISCpISC调节调节RLLC流动相流动相pH值以抑制组分的离解值以抑制组分的离解 p抑制剂：弱酸抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱、弱碱(NH3 H2O)或缓冲液或缓冲液 p分离机制：调节流动相分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以，抑制组分的理解，以中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配平衡。平衡。p分析对象

7、：分析对象：pKa 的弱酸的弱酸 7.0 pKa 的弱碱的弱碱 两性化合物两性化合物 11ISC p容量因子及其影响因素容量因子及其影响因素 对于弱酸：流动相对于弱酸：流动相pH 组分组分pKa，k，tR p流动相流动相pH范围范围2 8p固定相与反相键合相一致固定相与反相键合相一致 12（三）反相离子对色谱法（三）反相离子对色谱法pRPIC在一般在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。流动相中加入离子对试剂。p常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸用四丁基季胺盐。用四丁基季胺盐。p分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离分离机制：离子对试剂

8、与被分析的离子形成中性离子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。p分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物 13保留机制保留机制-离子对模型离子对模型 B+H BH+RSO3NaRSO3-+Na+BH+RSO3-固定相BH+RSO3-14影响容量因子的因素影响容量因子的因素pp离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度离子对试剂的种类和浓度 分析酸性类物质分析酸性类物质分析酸性类物质分析酸性类物质 季铵盐季铵盐季铵盐季铵盐 分析碱性类物质分析碱性类物质分析碱性类物质分析碱性类物质 烷基磺酸盐

9、或硫酸盐烷基磺酸盐或硫酸盐烷基磺酸盐或硫酸盐烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC PIC试剂碳链试剂碳链试剂碳链试剂碳链 ，k k 在低于胶束浓度时，在低于胶束浓度时，在低于胶束浓度时，在低于胶束浓度时，PICPIC试剂浓度试剂浓度试剂浓度试剂浓度 ，k k pp流动相的流动相的流动相的流动相的pHpH 影响影响影响影响PICPIC试剂和组分的离子化试剂和组分的离子化试剂和组分的离子化试剂和组分的离子化15小结小结色谱类型色谱类型(Mode)固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)主要适用范围主要适用范围(Compound Separated)正相色谱(N

10、ormal-Phase)硅胶，氨基、氰基、二醇基键合硅胶烷烃/极性调节剂 在水中不溶解的物质或同分异构体反相色谱(Reversed-Phase)C18、氨基、氰基键合硅胶水/有机溶剂中性、弱酸性、弱碱性物质离子抑制色谱(Ion Suppression)C18、C8键合硅胶水/有机溶剂弱酸、弱碱缓冲盐弱酸、弱碱、两性化合物离子对色谱(Ion-Pair)C18、C8键合硅胶水/有机溶剂离子对试剂有机酸、碱、盐及两性化合物16三、其他高效液相色谱法三、其他高效液相色谱法pp离子色谱法（离子色谱法（离子色谱法（离子色谱法（ion chromatographyion chromatography）pp手

11、性色谱法（手性色谱法（手性色谱法（手性色谱法（chial chromatographychial chromatography）pp亲和色谱法（亲和色谱法（亲和色谱法（亲和色谱法（affinity chromatographyaffinity chromatography）17离子色谱法（离子色谱法（ion chromatography）p离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法 p抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）分离柱分离柱 交换反应：交换反应：ROH+NaX RX+NaOH洗脱反应：洗脱反应：RX+NaOHROH+NaX抑制柱抑制柱 与组分反应：与组分反应：RH+NaXRNa+

12、HX与洗脱剂反应：与洗脱剂反应：RH+NaOHRNa+H2O18第二节第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择的固定相和流动相及其选择固定相应满足下列要求固定相应满足下列要求p颗粒细、均匀颗粒细、均匀p传质快传质快p机械强度高，耐高压机械强度高，耐高压p化学稳定性好，与流动相不发生反应化学稳定性好，与流动相不发生反应19一、化学健合相的固定相一、化学健合相的固定相（chemically bonded phase)pp用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上所形成

13、的填料称为化学键合相。表面上所形成的填料称为化学键合相。表面上所形成的填料称为化学键合相。表面上所形成的填料称为化学键合相。pp按极性分为非极性、中等极性和极性三类。按极性分为非极性、中等极性和极性三类。按极性分为非极性、中等极性和极性三类。按极性分为非极性、中等极性和极性三类。20（一）（一）键合相的种类键合相的种类1.非极性键合相非极性键合相p表面基团表面基团-C18H37 -C8H17OHSiOSiOHOSiOHOSiOSiOHOH硅胶表面硅胶表面212.弱极性、极性键合相弱极性、极性键合相p弱极性键合相：弱极性键合相：O 正相和反相均可正相和反相均可p 极性键合相：极性键合相：CN N

14、H2 一般作正相一般作正相OSiCH3CNCH3(CH )2 nSi 22（二）键合相的性质和特点（二）键合相的性质和特点p键合反应键合反应p含碳量和覆盖度含碳量和覆盖度 键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大，键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大，容量因子增加。容量因子增加。p键合相的特点键合相的特点 不流失、稳定、载样量大不流失、稳定、载样量大p注意点注意点 pH适用范围适用范围23二、二、化学键合相的化学键合相的流动相流动相对流动相的基本要求对流动相的基本要求p不与固定相发生化学反应。不与固定相发生化学反应。p对样品有适宜的溶解度。有合适的对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。值。p

15、溶剂应与检测器相匹配，溶剂应与检测器相匹配，溶剂的截止波长溶剂的截止波长流动相极性流动相极性p固定相：极性键合相固定相：极性键合相 p流动相：烷烃（底剂）流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂极性调节剂 p正相洗脱时，依靠组分的极性差别而分离正相洗脱时，依靠组分的极性差别而分离p出峰顺序：极性小的组分先出峰。出峰顺序：极性小的组分先出峰。31（三）反相键合相色谱法的分离条件（三）反相键合相色谱法的分离条件p流动相极性流动相极性固定相极性固定相极性p固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相 p流动相：甲醇流动相：甲醇-水、乙腈水、乙腈-水水，常加入弱酸、弱碱或常加入弱酸、弱碱或缓冲盐调节流动相缓冲盐调

16、节流动相pH以抑制组分离解，增加保留以抑制组分离解，增加保留 反相洗脱时，反相洗脱时，出峰顺序：极性大的组分先出峰。出峰顺序：极性大的组分先出峰。32（四）反相离子对色谱法的分离条件p离子对试剂的选择离子对试剂的选择p流动相流动相pH的选择的选择p有机溶剂及其浓度的选择有机溶剂及其浓度的选择33四、其他固定相四、其他固定相p键合型离子交换剂键合型离子交换剂p手性固定相手性固定相 分析、分离对映体的最重要分析、分离对映体的最重要手段。制备单一构型的活性异构体是世界制手段。制备单一构型的活性异构体是世界制药业的大方向。药业的大方向。p亲和色谱固定相亲和色谱固定相 虽然并非新方法，但近年虽然并非新方法，但近年来有了长足的发展。利用亲合反应的专属性，来有了长足的发展。利用亲合反应的专属性，该法已成为生化药物纯化、分析的重要手段。该法已成为生化药物纯化、分析的重要手段。34亲和色谱固定相举例亲和色谱固定相举例2OCHSiNH3()2O2)(CHOCNHNNOHOHCH2POOOCOOO氨丙基硅胶氨丙基硅胶 间隔臂间隔臂 CMP固定相可用于细胞色素固定相可用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶、核糖核酸酶、溶菌酶等多种蛋白质的纯度分析。菌酶等多种蛋白质的纯度分析。35