紫外分光光度法测定氨茶碱的含量.ppt

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1、实验四：紫外分光光度法测实验四：紫外分光光度法测 定氨茶碱的含量定氨茶碱的含量紫外紫外-可见分光光度法（可见分光光度法（药典相关规定药典相关规定）1.1.对溶剂的要求对溶剂的要求 含杂原子的有机溶剂，通常具有末端吸收。因此，它含杂原子的有机溶剂，通常具有末端吸收。因此，它们的适用范围不能小于截止波长。例如们的适用范围不能小于截止波长。例如甲醇、乙醇的截止使甲醇、乙醇的截止使用波长为用波长为205nm205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定样品前，应先收。因此，在测定样品前，应先检查所用溶剂在样品所用波检查所用溶剂在样品所用波长附近是否

2、符合要求长附近是否符合要求，即将溶剂置，即将溶剂置1cm1cm石英吸收池中，以空石英吸收池中，以空气为空白测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度在气为空白测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度在220-220-240nm240nm范围内不超过，在范围内不超过，在241-250nm241-250nm范围内不得超过，范围内不得超过，在在251-300nm251-300nm范围内不得超过，在范围内不得超过，在300nm300nm以上时不得超过以上时不得超过0.05.0.05.测定法测定法 应以配制样品溶液的同批溶剂为空白对照，应以配制样品溶液的同批溶剂为空白对照，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长吸收峰波长

3、应在该品种项下规定的波长2nm2nm以内，以内，并以吸光度最大的波长为测定波长。并以吸光度最大的波长为测定波长。含量测定含量测定（1 1）对照品比较法）对照品比较法（2 2）吸收系数法）吸收系数法（3 3）计算分光光度法）计算分光光度法（4 4）比色法）比色法 样品本身在紫外样品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为避免干扰或提高灵敏度，可加外区虽有吸收但为避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定。入适当的显色剂显色后测定。药物其他分析定量方法药物其他分析定量方法l标准曲线法标准曲线法 也称外标法或直接比较法也称外标法或直接比较法，是一种简便、快

4、速的定量，是一种简便、快速的定量方法。与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测方法。与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测组分的标准样品绘制标准曲线。组分的标准样品绘制标准曲线。l内标法内标法标准曲线法标准曲线法l 标准曲线的标准曲线的横坐标横坐标(X)(X)表示可以表示可以精确测量的变量精确测量的变量(如标准溶液的浓度如标准溶液的浓度)，称为普通变量，纵坐标，称为普通变量，纵坐标(Y)(Y)表表示示仪器的响应值仪器的响应值(也称测量值，如吸光度、电极电位也称测量值，如吸光度、电极电位等等)，称为随机变量。当，称为随机变量。当X X取值为取值为X1,X2,XnX1,X2,Xn时，时，

5、仪器测得的仪器测得的Y Y值分别为值分别为Y1,Y2,YnY1,Y2,Yn。将这些测量。将这些测量点点Xi,YiXi,Yi描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示X X与与Y Y之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。l 用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，包括试祥中被测物质的含量，标准曲线不能任意延长标准曲线不能任意延长。l标准曲线法的优点是：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当定工作就变得相当简单，

6、简单，可直接从标准工作曲线可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别上读出含量，因此特别适合于大量样品适合于大量样品的分析。的分析。l标准曲线法的缺点是：标准曲线法的缺点是：每次样品分析的每次样品分析的色谱色谱条件条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）进样量，柱效等）很难完全相同很难完全相同，因此容易出现，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品）用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给

7、测，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。量带来一定的误差。内标法内标法l内标法内标法 internal standard method internal standard method 是色谱分析中一种比是色谱分析中一种比较准确的定量方法，较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时尤其在没有标准物对照时，此方法更，此方法更显其优越性。它尤其广泛的应用于高效液相色谱中。这种显其优越性。它尤其广泛的应用于高效液相色谱中。这种方法方法可以抵消仪器和操作过程带来的误差。可以抵消仪器和操作过程带来的误差。l内标法是内标法是将一定重量的纯物质将一定重量的纯物质作为内标物作为内标物加到一

8、定量的被加到一定量的被分析样品混合物分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，内标物在色谱图上得到分离的峰。根据已知对校正因子，内标物在色谱图上得到分离的峰。根据已知含量的内标物的峰面积和样品的峰面积，计算组分的百分含量的内标物的峰面积和样品的峰面积，计算组分的百分含量。含量。内标物的选择要符合以下要求：内标物的选择要符合以下要求：（1 1）内标物的峰与组分峰能）内标物的峰与组分峰能完全分离完全分离。（2 2）内标物峰内标物峰在色谱图上出现

9、的在色谱图上出现的位置位置，最好在欲定量组分，最好在欲定量组分 峰的邻近位置。如果样品中有几个组分需要定量，并峰的邻近位置。如果样品中有几个组分需要定量，并 且他们的且他们的kk值差别较大，这时就需要用几个内标物来值差别较大，这时就需要用几个内标物来 作定量测定。作定量测定。（3 3）内标物的）内标物的性质和浓度性质和浓度尽量与预测定峰的接近。尽量与预测定峰的接近。（4 4）内标物内标物是样品中不存在的，与样品各组分、柱填料和是样品中不存在的，与样品各组分、柱填料和 移动相移动相不发生化学反应不发生化学反应。内标法优缺点内标法优缺点l优点：内标法能够消除大部分的误差，如优点：内标法能够消除大部

10、分的误差，如仪器造成的。外标法无法消除，需要求仪仪器造成的。外标法无法消除，需要求仪器不产生误差。器不产生误差。l缺点：操作复杂。缺点：操作复杂。实验目的实验目的Y 了解紫外分光光度法检测药物含量的原理；了解紫外分光光度法检测药物含量的原理；Y 熟悉紫外分光光度计的基本构造和功能；熟悉紫外分光光度计的基本构造和功能；Y 掌握紫外分光光度法检测药物含量基本过程掌握紫外分光光度法检测药物含量基本过程;Y 掌握标准曲线的建立方法。掌握标准曲线的建立方法。实验原理实验原理 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）

11、成正比，即与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，即朗朗伯伯-比尔定律，比尔定律，这是吸收光谱法定量的理论依据，其关系这是吸收光谱法定量的理论依据，其关系式如下式如下A=ECLA=ECL式式(3-1)(3-1)式中式中A A为吸收度为吸收度 ；E E为吸收系数，即单位浓度、单位为吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度的吸收度数值；液层厚度的吸收度数值；C C为溶液浓度；为溶液浓度；L L为液层厚度。为液层厚度。紫外紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-200-760nm760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立的光谱分析方这一范围的电磁波的吸收

12、特性所建立的光谱分析方法。其主要特点为：灵敏度高，可达法。其主要特点为：灵敏度高，可达10-4g/ml10-4g/ml10-10-7g/ml7g/ml；准确度高，相对误差为；准确度高，相对误差为2 2-5-5。中药中有紫外吸。中药中有紫外吸收的成分或本身有颜色的成分，在一定的浓度范围内，其收的成分或本身有颜色的成分，在一定的浓度范围内，其溶液的吸收度与浓度符合朗伯溶液的吸收度与浓度符合朗伯-比尔定律，均可用此法进比尔定律，均可用此法进行分析。行分析。实验仪器与材料实验仪器与材料S实验仪器：紫外分光光度计、精密天平、实验仪器：紫外分光光度计、精密天平、石英比色皿、石英比色皿、50ml50ml烧杯

13、、玻璃棒、称量纸、烧杯、玻璃棒、称量纸、10ml10ml容量瓶、容量瓶、25ml25ml容量瓶、洗瓶。容量瓶、洗瓶。S实验材料：氨茶碱原料、氨茶碱标准品、实验材料：氨茶碱原料、氨茶碱标准品、蒸馏水、氢氧化钠。蒸馏水、氢氧化钠。S0.01M 0.01M NaOHNaOH溶液的配制：称取氢氧化钠溶液的配制：称取氢氧化钠，用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至1000ml1000ml，即得。，即得。实验方法实验方法标准品溶液的制备：精密称取氨茶碱对照品标准品溶液的制备：精密称取氨茶碱对照品置于置于25mL25mL容量瓶中，容量瓶中，先用少量先用少量的的NaOHNaOH溶液振摇使溶解，溶液振摇使溶解，再用该溶液

14、定容至刻度，配成浓度为再用该溶液定容至刻度，配成浓度为的标准储备液；的标准储备液；样品溶液的制备：精密称取氨茶碱原料药样品溶液的制备：精密称取氨茶碱原料药，置于，置于25ml25ml容量瓶中，用容量瓶中，用0.01M 0.01M NaOHNaOH溶液溶解并定容至刻溶液溶解并定容至刻度，摇匀，再从中取出度，摇匀，再从中取出定容至定容至10ml10ml，即得氨茶碱样，即得氨茶碱样品溶液。品溶液。一、标准曲线的建立一、标准曲线的建立 精密吸取氨茶碱标准储备液分别为精密吸取氨茶碱标准储备液分别为100100、150150、200200、250250、300l300l于于10mL10mL容量瓶中，容量瓶

15、中，然后用的然后用的NaOHNaOH溶液定容至刻度，摇匀，照溶液定容至刻度，摇匀，照紫外分光光度法在紫外分光光度法在275nm275nm波长处测定吸光度，波长处测定吸光度，并以并以浓度浓度为横坐标，为横坐标，吸光度值吸光度值为纵坐标，为纵坐标，进行线性回归，并建立标准曲线。进行线性回归，并建立标准曲线。二、氨茶碱样品含量测定二、氨茶碱样品含量测定 取已配制好的氨茶碱样品溶液适量，取已配制好的氨茶碱样品溶液适量，置于石英比色皿中，采用紫外分光光光度置于石英比色皿中，采用紫外分光光光度法在法在275nm275nm波长处测定溶液中氨茶碱吸光度，波长处测定溶液中氨茶碱吸光度，最后通过标准曲线计算样品中氨茶碱的含最后通过标准曲线计算样品中氨茶碱的含量。量。实验结果实验结果1.1.标准曲线方程、相关系数及绘图。标准曲线方程、相关系数及绘图。2.2.氨茶碱样品含量。氨茶碱样品含量。思考题：思考题：1.1.标准曲线方程中对相关系数标准曲线方程中对相关系数r r值有何要求？值有何要求？2.2.标准曲线制备中，各点浓度取值范围是根标准曲线制备中，各点浓度取值范围是根据什么确定的？据什么确定的？3.3.实验中为什么选择用的实验中为什么选择用的NaOHNaOH溶液作为溶剂溶液作为溶剂来溶解氨茶碱。来溶解氨茶碱。