细胞染色体显示和分带技术.ppt

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1、第10章 细胞染色体显示和分带技术及其应用体外培养的细胞是研究细胞遗传最便利、最有体外培养的细胞是研究细胞遗传最便利、最有效的方法和对象，也是揭示培养细胞性状的效的方法和对象，也是揭示培养细胞性状的重要方面。重要方面。第一节 性染色质检测 在间期细胞核中，女性X染色质和男性Y染色质均可用特殊染色法显示出来,性染色质检查方法如下:一、X染色质显示法女性：X染色质染色质：Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色 结果：细胞质不着色，细胞核染成紫红色，核内Barr 小体呈三角形/半月形。二、Y染色质显示法男性：Y染色质染色质：盐酸阿的平染色法结果：Y染色质呈

2、特别明亮的黄绿色荧光园点，可位于核内任何位置，但多见于中央部位，第二节 培养细胞染色体显示法一、原理一、原理显示染色体要选择分裂中期细胞，因细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。获得多量的中期分裂相及染色体分散均匀的理想分裂相可采取的措施如下:1提高细胞分裂相数提高细胞分裂相数（1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞应选择对数生长期的细胞。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。（2）阻抑中期分裂 用秋水仙素(Colchicine)，现常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)来破坏细胞有丝分裂中的纺锤丝，以发挥阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并

3、无干扰，因此随时间延长可截获很多中期分裂相，一般的用量：秋水仙素培养液，秋水仙胺培养液。作用时间为26小时。2促染色体分散措施促染色体分散措施（1）低渗处理 一般用，在37水浴中将上述细胞处理2040分钟，可使细胞体积胀大，染色体松散。（2）固定 常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用时现用现配。显示染色体方法很多，以下几种方法较为常用。二、传代细胞染色体检查二、传代细胞染色体检查一、原理：秋水仙碱可使细胞停止在分裂中期，染色体长短恰倒好处。二、方法：细胞类型：传代细胞系，外周血LC，羊水，绒毛细胞等方法：秋水仙素 低渗固定染色镜检末梢血培养法，Giemsa染色法显示人染色体第三节第三节 染色体结构

4、显示和检测染色体结构显示和检测一、染色体显带原理和种类一、染色体显带原理和种类二、染色体显带方法要点二、染色体显带方法要点三、原理三、原理四、四、常用染色体显带法常用染色体显带法五、姐妹染色单体分化染色五、姐妹染色单体分化染色一、染色体显带原理和种类（一）原理染色体显带是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有A-T多的染色体节段，相反，G-C多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近

5、2000个G带。（二）种类染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同的横纹。根据显带方法不同可分为：用奎吖因(QM)、阿的平(QD)荧光染色的带，称“Q”带；用Giemsa染色显带称“G”带；用Giemsa染色显示异染色质部分称“C”带；用特殊方法处理后，显现出与Q带和G带相反的带型称“K”带等。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。二、染色体显带方法要点二、染色体显带方法要点“老化”处理：将染色体制片后存放310分钟或86干燥2030分钟 显Q带法：用奎吖因(QM)或阿的平(QM)染色显带Giemsa显G带：胰酶消化 Giemsa染色显带显C带法：在预热至65的5%Ba(

6、OH)2液中15分钟 Giemsa染色15分钟显带注意：1、标本片老化处理很重要；2、胰酶浓度和消化时间要事先熟知，消化要充分但不能过度；3、中期分裂相要多而均匀，稍长一些为佳1中期染色体为了获得满意的显带效果，需制备质量好的中期染色体标本，即须达到以下要求：长度适宜，一般稍长一些，能显出更多的条带，这与加入秋水仙素的浓度和作用时间有关，要控制好。染色体分散均匀无重叠，这与低渗有关，低渗不足染色体易发生重叠，过度易流失。无严重单体分叉。2特殊处理中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤：（1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以310天为宜。（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预

7、处理后的标本不必再老化。常用80干燥2030分钟。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。三、常用染色体显带法1显Q带法 （1）将标本片于缓冲液中浸510分钟后，再转浸入用Soresen氏缓冲液(pH6.0)配制的0.2%的QD或QM染液中染色510分钟(见表12-3-1)。（2）用的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。（3）在荧光显微镜下观察。表表12-3-1 Soresen(100ml)缓冲液缓冲液PHPHNaNa2 2HPOHPO4 4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2POPO4 4(1/15m0l/(1/15m0l/L

8、)L)pHpHNaNa2 2HPOHPO4 4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2HPOHPO4 4(1/15m(1/15mol/L)ol/L)5.295.292.52.597.597.56.816.81505050505.595.595 595956.986.98606040405.915.91101090907.177.17707030306.246.24202080807.387.38808020206.476.47363674747.737.73909010106.646.64404060608.048.0495955 52胰酶一Giemsa显G带法(1)将中期染

9、色体标本于6080烘箱中烘24小时或过夜，然后再浸入磷酸缓冲液中(pH6.8)，56温浴10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。3显C带法将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，

10、待自来水冲洗后再过磷酸冲液，用Giemsa染色15分钟后镜检。附：2SCC液配方：称和枸椽酸钠液于1000mL蒸馏水中。5%Ba(OH)2：称溶于50mL生理盐水中。必须注意：胰蛋白酶消化显带过程中，消化不足，带不出现。消化过度，染色体变得膨胀和不着色。要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单易行，效果好。（见书后照片6）末梢血培养法，Giemsa染色分带法显示人染色体人染色体G带慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞PH染色体核型四、姐妹染色单体分化染色(一)原理细 胞 被 培 养 在 含 有 5-溴 脱 氧 尿 苷(5-Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷()进入细胞增殖周期，第一周期每条染色单体DNA双链都被BUdR掺入(TB、TB)，第二周期只有一条单体保留了无BUdR旧链，另一条单体双链都有BUdR(TB、TB)，经荧光染料着色时TB有强荧光，BB荧光弱。(二)方法(二)方法1.制片：细胞培养时加入BUdR，淋巴细胞于37培养4872小时后加秋水仙碱按染色体常规制片法制片。染色（1）Giemsa染色（2）用荧光染料Hoechst33258染色镜检：一条单染色体着色强（或有强荧光），另一条着色淡（或有弱荧光）高分辨人染色体人类姐妹染色体互换