细胞培养-正常组织细胞的培养.ppt

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1、正常组织细胞的培养正常组织细胞的培养 病原学教研室病原学教研室申艳娜申艳娜2主要内容主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系3主要内容主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系4培养细胞的取材培养细胞的取材v 取材的基本要求取材的基本要求新鲜标本新鲜标本严格无菌操作严格无菌操作尽可能减少对细胞的机械损伤尽可能减少对细胞的机械损伤尽量去除血液、剔

2、除脂肪、结缔组织等尽量去除血液、剔除脂肪、结缔组织等同时保留组织学标本（光镜和电镜）同时保留组织学标本（光镜和电镜）培养细胞的取材培养细胞的取材v 基本器材和用品基本器材和用品手术器械手术器械青霉素小瓶（含培基或缓冲液）青霉素小瓶（含培基或缓冲液）小烧杯小烧杯培养皿培养皿6培养细胞的取材培养细胞的取材v 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材v 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材v 血细胞取材血细胞取材v 骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材v 其他组织的取材其他组织的取材培养细胞的取材培养细胞的取材v 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材上皮细胞的来源上皮细胞的来源方法似外科

3、断层皮片手术方法似外科断层皮片手术面积一般面积一般2-3mm2-3mm2 2，取材尽量薄，取材尽量薄可用高浓度抗生素漂洗可用高浓度抗生素漂洗人类角质形成细胞人类角质形成细胞8培养细胞的取材培养细胞的取材v内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材常用的细胞培养材料常用的细胞培养材料内脏除肠道外多无菌内脏除肠道外多无菌实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌9培养细胞的取材培养细胞的取材v血细胞取材血细胞取材染色体分析染色体分析淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗v 骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材无需特别处理，离心后直接接种无需

4、特别处理，离心后直接接种10主要内容主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系组织材料的分离组织材料的分离v 机械法机械法v 化学法化学法组织材料的分离组织材料的分离v 细胞悬液的分离细胞悬液的分离低速离心低速离心 500-1000rpm 10 min 500-1000rpm 10 min13组织材料的分离组织材料的分离v 组织块的分离组织块的分离机械分散法机械分散法机械分散法机械分散法注射器针芯挤压注射器针芯挤压不锈钢滤网不锈钢滤网剪切分离法剪切分离法14组织材料的分

5、离组织材料的分离v 组织块的分离组织块的分离机机械械分分散散法法15组织材料的分离组织材料的分离v 组织块的分离组织块的分离消化分离法消化分离法胰蛋白酶胰蛋白酶 适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。pH pH、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化效果。效果。浓度为，浓度为，pH 8.0.pH 8.0.与与EDTAEDTA混合使用。混合使用。16组织材料的分离组织材料的分离v 组织块的分离组织块的分离消化分离法消化分离法 胶原酶胶原酶 分为分为、四种类型。四种类型。根据分离组织类型选择相应型的胶原酶。根据分离组织类型选择相应型

6、的胶原酶。对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性组织、上皮和癌组织。组织、上皮和癌组织。浓度为。浓度为。17主要内容主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系18原代细胞培养原代细胞培养v 原代培养原代培养定义：是从供体取得组织细胞后在体定义：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。外进行的首次培养。优点：生物特性未发生很大变化，最优点：生物特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。接近和反映体内生长特性。原代细胞培养原代细

7、胞培养v 培养方法培养方法组织块法组织块法消化法消化法20原代细胞培养原代细胞培养v 可能遇到的问题可能遇到的问题完全无细胞游出或移动；完全无细胞游出或移动；有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；胞长时间处于停滞状态以致难以传代；有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；退死亡；21原代细胞培养原代细胞培养v 可能遇到的问题可能遇到的问题传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。生长

8、的肿瘤传代细胞系。22原代细胞培养原代细胞培养v 问题的解决方法问题的解决方法加入适宜底物加入适宜底物把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。23原代细胞培养原代细胞培养v 问题的解决方法问题的解决方法加入生长因子加入生长因子应用促细胞生长因子，向培养液中增加一应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。氢化可的松、雌激素以及其它生长

9、因子。24主要内容主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系v表皮细胞表皮细胞在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。的一些添加物。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例无菌切取皮肤标本，用无菌切取皮肤标本，用DBSSDBSS

10、冲洗冲洗3 35 5遍。遍。将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴中，加数滴PBSPBS使之湿润，用弯剪尽可能除使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm1cmX2cm的小块。的小块。用无用无Ca2+Ca2+、Mg2Mg2+的的PBS PBS 冲洗标本至少冲洗标本至少3 3次，次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶IIII中，中，44放置放置15-48h15-48h，或，或37 1-3h37 1-3h。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例几种

11、细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例表皮层和真皮层分离时表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一时将其一如到另一10cm10cm塑料平皿，真塑料平皿，真皮向下，用皮向下，用5ml5ml血清完全培养液冲洗，血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含20ml20ml培培养液的养液的50ml50ml离心管中，反复吹打，过离心管中，反复吹打，过100100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。v滋养层细胞制备滋养层细胞制备在已形成单层的在已形成单层的3T

12、33T3细胞培养瓶中加入丝细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使裂霉素，使3T33T3细胞不在分裂增殖，即可细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。作为表皮细胞的黏附滋养细胞。v黏壁剂包被黏壁剂包被用用0.01%0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，过夜，弃上清，4040烘干，制成胶原蛋烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射白黏附膜，紫外线照射2h2h消毒备用。消毒备用。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例29几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞取健康产妇分娩正常新生儿后取健康产妇分娩正常新生儿后6 6小时

13、以内小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的的D-HanksD-Hanks液中，洗去外部血污。在超静液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹痕、扭曲、凝血工作台上剪去有钳子夹痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离出块、穿孔段后分离出10-1510-15厘米一段。厘米一段。30几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞用注射器吸取用注射器吸取 HanksHanks液，充分清洗脐静液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉管腔内缓慢注入向脐静脉管腔内缓慢注入I I型胶原酶型胶

14、原酶8-8-10ml10ml，静脉充盈后，用另一只血管钳夹，静脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入住防胶原酶返流。置入3737培养箱内消培养箱内消化化1010分钟。分钟。v以以1 15X105X105 5个细胞的密度接种在适量个细胞的密度接种在适量DMEMDMEM或或FADFAD培养液中，培养液中，3737培养培养1-31-3天，细胞贴天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细胞。壁后，冲洗未贴壁细胞。v传代培养：传代培养：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的的EDTAEDTA孵育孵育10-10-30min30min，细胞变圆后，在用，细胞变圆后，在用0.1%0.1%的胰蛋白酶的胰蛋白酶和和

15、0.05%EDTA0.05%EDTA消化，吸管吹打是细胞完全脱消化，吸管吹打是细胞完全脱壁。壁。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例32几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含化液收集到离心管中，然后注入含1010胎牛血清的胎牛血清的RPMI1640RPMI1640培基终止消化并冲培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内皮细胞。洗血管，以便获取更多的内皮细胞。33几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞将冲洗液一并

16、注入离心管，以将冲洗液一并注入离心管，以1000 rpm1000 rpm离心离心 l0l0分钟，弃上清液，加分钟，弃上清液，加RPMI 1640RPMI 1640培养液，接种于培养液，接种于50ml50ml一次性塑料培养瓶一次性塑料培养瓶中，置中，置3737培养箱内，在培养箱内，在5 5C0C02 2 24 24小时小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。胞继续培养，隔两天换液一次。34几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞35几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 脐静脉血管内皮细胞脐静

17、脉血管内皮细胞36几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 人滑膜细胞人滑膜细胞将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、链的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、链霉素的霉素的D-HanksD-Hanks洗涤两次，用眼科剪将滑洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，1200rpm/min1200rpm/min，离心，离心1010分钟。分钟。37几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 人滑膜细胞人滑膜细胞 离心后，弃上清，加入一倍体积的离心后，弃上清，加入一倍体积的IIII型胶原酶，置于型胶原酶，

18、置于37 537 5CO2CO2培养箱中培养箱中消化消化6060分钟（每分钟（每1515分钟吹打一次）。初分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，再加入一倍体次消化后，离心弃上清，再加入一倍体积的胰蛋白酶继续消化积的胰蛋白酶继续消化3030分钟。最后分钟。最后加入含加入含1515血清的血清的RPMI1640RPMI1640培养液终止培养液终止消化。消化。38几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 人滑膜细胞人滑膜细胞 消化后的细胞悬液经消化后的细胞悬液经200200目的筛网过滤目的筛网过滤并离心洗涤两次，再用含并离心洗涤两次，再用含1010小牛血清小牛血清的的RPMI1640RPMI164

19、0培养液重悬细胞，接种于培培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置于养瓶中，置于375375CO2CO2培养箱中培养培养箱中培养2424小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续培养，每培养，每3 3天换液一次天换液一次,约约1010天左右可长天左右可长满瓶底。满瓶底。39几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 人滑膜细胞人滑膜细胞 细胞长满培养瓶后即可进行传代培细胞长满培养瓶后即可进行传代培养，用胰蛋白酶养，用胰蛋白酶EDTAEDTA消化后按几消化后按几种细胞培养方法举例种细胞培养方法举例40几种细胞培养方法举例v 人滑膜细胞41几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v

20、 人滑膜细胞人滑膜细胞42几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 乳鼠心肌细胞乳鼠心肌细胞分步消化法分步消化法v对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔冲洗股骨腔的方法获得。的方法获得。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例实验材料实验材料v小鼠小鼠小鼠的抓法：小鼠的抓法：从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。上或报纸上。小鼠的处死：颈椎脱位法小鼠的处死：颈椎脱位法右手（左手）右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉抓住鼠尾用力向后拉，同时左手，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，（右手）拇指与

21、食指用力向下按住小鼠头部，在在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。验动物对痛觉不再敏感。股骨骨髓细胞悬液的制备股骨骨髓细胞悬液的制备v冲洗骨髓腔冲洗骨髓腔 ：用剪刀剪开股骨的用剪刀剪开股骨的一端一端，将注射器针头插入，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端另一端，用用D-HanksD-Hanks液多次冲洗骨髓腔，

22、收集细胞悬液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中液于离心管中。47主要内容v 培养细胞的取材培养细胞的取材v 组织材料的分离组织材料的分离v 原代细胞培养原代细胞培养v 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例v 建立细胞系建立细胞系48建立细胞系建立细胞系v 细胞系细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细生存的细胞系，

23、称连续细胞系或无限细胞系（胞系（Infinite Cell Line）。）。49建立细胞系建立细胞系v 细胞系细胞系无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性）无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌，但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。致瘤性，说明已恶性化。50建立细胞系建立细胞系v 细胞株细

24、胞株（Cell strainCell strain）从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，胞分离培养或通过筛选的方法，由单细由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株胞增殖形成的细胞群，称细胞株。由原细胞株进一步分离培养出与原株性由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。状不同的细胞群，亦可称之为亚株。51建立细胞系建立细胞系v ATCCATCCAmerican Type Culture CollectionAmerican Type Culture Collection美国标准菌库美国标准菌库52建立细胞系建立细胞系v

25、 细胞入库检测项目细胞入库检测项目组织来源和已传代数：应说明细胞供体组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个人性别、所属物种，来自人或动物，个人性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号等。说明临床和病理诊断及病历号等。培养条件及方法：说明使用培养基、血培养条件及方法：说明使用培养基、血清种类及用量、抗生素、适宜清种类及用量、抗生素、适宜PHPH等。等。53建立细胞系建立细胞系v 细胞入库检测项目细胞入库检测项目细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、倍增时间等。倍增时间等。冻存液。冻存液

26、。复苏后细胞生长特性。复苏后细胞生长特性。接种存活率。接种存活率。54建立细胞系建立细胞系v 细胞入库检测项目细胞入库检测项目细胞生物检测：细胞形态、特异结构、细胞生物检测：细胞形态、特异结构、细胞核型。细胞核型。物种检测：检测同工酶谱，主要为物种检测：检测同工酶谱，主要为C6PDC6PD和和LDHLDH，以证明细胞有否交叉反应。，以证明细胞有否交叉反应。55建立细胞系建立细胞系v 常用的细胞系举例常用的细胞系举例-人类肿瘤细胞人类肿瘤细胞MKN-45低分化胃癌K562慢性髓原白血病 LoVo结肠腺癌Hut-78皮肤T细胞淋巴瘤Ls-174-T结肠腺癌Hut-102皮肤T细胞淋巴瘤HCT-8回

27、盲肠腺癌NamalwaBurkitts淋巴瘤HCe-8693盲肠未分化腺癌Jurknt.Clone E6-1白血病细胞HR-8348直肠腺癌THP-1单核细胞BEL-7402肝癌U937组织细胞淋巴瘤BEL-7404肝癌Raji Burkitts淋巴瘤BEL-7405肝癌MEG-01成巨核细胞白血病HepG2肝细胞癌56建立细胞系建立细胞系v 常用的细胞系举例小鼠肿瘤细胞常用的细胞系举例小鼠肿瘤细胞EL4淋巴瘤Pcc4胚癌细胞EL4IL-2淋巴瘤P815肥大细胞瘤YAC-1淋巴瘤MFC前胃癌L1210淋巴白血病AtT20垂体瘤P388D1淋巴样瘤NS-1骨髓瘤SRS-82腹水瘤SP2/0骨髓瘤S180腹水瘤P3-X63-Ag8骨髓瘤B16黑色素瘤J774A.1单核细胞巨噬细胞