细胞工程1植物细胞.ppt

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1、生物工程概论生物工程概论第三章第三章 细胞工程细胞工程-植物细胞工程植物细胞工程College of Chemical Engineering,GuiZhou University OutlineOutline 1 1 概述概述 2 2 植物细胞工程植物细胞工程一、植物组织培养一、植物组织培养二、植物细胞培养二、植物细胞培养三、人工种子三、人工种子四、植物细胞融合四、植物细胞融合 19721972年卡尔森等通年卡尔森等通过两个过两个烟草品烟草品种种之之间间原生原生质质体的融合，体的融合，获获得了第一得了第一个个体体细细胞胞杂种杂种。19781978年梅尔年梅尔彻彻斯斯(Melchers)(Me

2、lchers)等首次等首次获获得了番得了番茄和茄和马铃马铃薯的薯的属间属间体体细细胞胞杂种杂种“Potamato”“Potamato”。目前，已得到栽培烟草目前，已得到栽培烟草与与野生烟草、栽野生烟草、栽培大豆培大豆与与野生大豆、野生大豆、籼籼稻稻与与野生稻、野生稻、籼籼稻稻与与粳稻、小粳稻、小麦与鹅麦与鹅冠草等冠草等细细胞胞杂种杂种及其后代，及其后代，获获得了有价得了有价值值的新品系或育的新品系或育种种上有用的新材上有用的新材料。料。白菜白菜白菜白菜甘蓝甘蓝甘蓝甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝1 1 概述概述 一、细胞工程的概念一、细胞工程的概念 是指在细胞水平上，以细胞生物学理论和技术

3、为基础，结合现代工程技术手段以及其他学科的科学原理和技术，研究、开发和利用细胞的现代生物技术。细细胞胞工工程程 植物组织和细胞培养技术植物组织和细胞培养技术 干细胞技术干细胞技术动物组织和细胞培养技术动物组织和细胞培养技术 细胞融合技术细胞融合技术 细胞核移植技术细胞核移植技术 胚胎移植技术胚胎移植技术细胞工程细胞工程:P54:P54微生物细胞工程、微生物细胞工程、植物细胞工程和植物细胞工程和动物细胞工程动物细胞工程根据研究对象不同，根据研究对象不同，可将细胞工程分为可将细胞工程分为（一）基本（一）基本概概念及念及研研究究进进展展 1.1.定定义义 植物植物组织组织培培养养：是指是指将将植物机

4、体的某一部分植物机体的某一部分(包包括器官、括器官、组织组织等等)取出，使其在无菌和人取出，使其在无菌和人为为控制外因控制外因（养养分、光照、分、光照、温温度、度、湿湿度等）度等）条条件下件下进进行培行培养养，从从而使其分化、而使其分化、发发育出整体植株的技育出整体植株的技术术。2 2 植物细胞工程植物细胞工程 一、植物组织培养一、植物组织培养2.2.研究进展研究进展植物植物组织组织培培养养的理的理论论依据主要有依据主要有两两点：点：1 19 9世世纪纪3 30 0年年代代施施莱莱登登和和施施旺旺提提出出的的细细胞胞学学说说，即即细细胞胞是是生生物物有有机机体体的的基基本本结结构构单单位位这这

5、一一理理论论，使使人人们们想想到到并并试试图图应应用用无无菌菌培培养养方方法法来来培培养养植植物物的的离离体体部部分分,在在人人工工控控制制条条件件下下来来研研究究其其生生长长、发发育育和和分分化化的的规规律律。1902年，德年，德国国植物植物学学家家Haberlandt提出了提出了植物植物细细胞胞全能性全能性学说学说。植物的器官和。植物的器官和组织组织可以不可以不断断分割，直至分分割，直至分到到单个细单个细胞而不影胞而不影响细响细胞增胞增殖的殖的观观点。点。并设并设想离体想离体细细胞胞具有再生完整植株的潜力。具有再生完整植株的潜力。19341934年美国的年美国的WhiteWhite，利利用

6、番茄根建立了第一个用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，活跃生长的无性繁殖系，发现发现B B族维生素对培养的族维生素对培养的离体根生长具有重要作离体根生长具有重要作用。用。创立了创立了WhiteWhite培养基。培养基。1943年年White发表了植物组织培养手册的专著，发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。19391939年，年，GautheretGautheret连续培养胡萝卜根形连续培养胡萝卜根形成层首次成功成层首次成功1948年，年，Skoog和崔徵通和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织过对烟草茎切段和髓培养组织的研

7、究，的研究，确定了腺嘌呤生长确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。主要条件之一。1956年年Miller等发现了激动素。控制等发现了激动素。控制器官分器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。指出其能有力诱导愈伤组织分化指出其能有力诱导愈伤组织分化,促进组培发展。促进组培发展。1958年，英国科学家年，英国科学家Steward等用进行悬浮培养，成功诱导出胚等用进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，状体并分化为完整的小植株，首次首次获获得植株再生成功得植株再生成功。使细胞全使细胞全能性理论得到证实

8、，这是植物组培的第一次突破。能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。细胞全能性细胞全能性 已已经经分化的体分化的体细细胞具有使后代胞具有使后代细细胞形成完整胞形成完整个个体的潜能，体的潜能，细细胞的胞的这种这种特性叫做特性叫做细细胞的全能胞的全能性。性。生物体的每一生物体的每一个个体体细细胞都包含有胞都包含有该该物物种种所特有所特有的全套的全套遗传遗传信息，都有信息，都有发发育成育成为为完整完整个个体所必需的全体所必需的全部基因。部基因。受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再次是体细胞次是体细胞 在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界在离体时，在一

9、定的营养物质、激素、其他外界条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。植物组织培养的一般程序：植物组织培养的一般程序：脱分化再分化诱导根、芽顶诱导根、芽顶端分生组织端分生组织通过悬浮液培养分散成单细胞通过悬浮液培养分散成单细胞离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽小植株小植株脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养植物组织培养胚状体胚状体小植株小植株再分化再分化单细胞单细胞通过悬浮培养分散成通过悬浮培养分散成包以人工包以人工种皮，形种皮，形成人工种成人工种子子1.1.预备阶段段2.2.诱导去分化去分化阶段段3.

10、3.继代增殖代增殖阶段段4.4.生根成芽生根成芽阶段段5.5.移栽成活移栽成活阶段段（二）植物（二）植物组织组织培培养养的操作技的操作技术术 P56P56切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽诱导去分化阶段诱导去分化阶段再分化再分化预备阶段预备阶段继代增殖阶段继代增殖阶段生根成芽阶段生根成芽阶段移栽成活阶段移栽成活阶段A Microspores isolated from banana anthers.Bar 14 m.B Development of callus from anthers after 5 mont

11、hs on induction medium.Bar 2 mm.C Androgenic embryos formed on calli.Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers.Bar 3 cmAssani et al.Plant Cell Rep 2003,21,5115161.1.预备阶段段（1 1）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。（2 2）除去病原菌和杂菌。）除去病原菌和杂菌。外植体表面消毒、培外植

12、体表面消毒、培养养基基灭灭菌菌-在超在超净净台上接台上接种种 、灼、灼烧烧接接种种工具、在火焰附近操作等工具、在火焰附近操作等外植体外植体自来水多次漂洗自来水多次漂洗消毒剂处理消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干由由于于物物种种的的不不同同、外外植植体体的的差差异异，组组织织培培养养的的培培养养基基也也是是多多种种多多样样，但，但它们它们通常都包括以下通常都包括以下三大三大类组类组成成分成成分：含含量量丰丰富富的的基基本本成成分分，如如蔗蔗糖糖或或葡葡萄萄糖糖高高达达每每升升30g，以及以及氮氮、磷、磷、钾钾、镁镁等。等。微量无机物，如微量无机物，如铁铁、锰锰、硼酸等

13、。硼酸等。微量有机物，如激微量有机物，如激动动素、素、吲哚吲哚乙酸、肌醇等。乙酸、肌醇等。（3 3）配制适宜的培养基。）配制适宜的培养基。分裂素分裂素生长素生长素问问：培：培养养基的成分？基的成分？碳碳源源,氮氮源源 ,无机无机盐盐,生生长长因子因子,水水,除此，培除此，培养养基中基中还还需需加入植物激素或其加入植物激素或其类类似物似物 培养基培养基 MSMS培培养养基基:其特点是无机其特点是无机盐盐和离子和离子浓浓度度较较高；高；B5B5培培养养基基:其特点是含有其特点是含有较较低的低的铵铵；WhiteWhite培培养养基基:其特点是无机其特点是无机盐盐低，适于生根；低，适于生根；N6N6培

14、培养养基基:其特点是其特点是KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量含量较较高高,适于花适于花药药培培养养；KMKM8P8P培培养养基基:其特点是有机成分其特点是有机成分较较多，适于多，适于 原生原生质质体培体培养养。培养基多以命名人的名字命名。培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有目前，比较流行的培养基有：1.1.生长素生长素 吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA)(IAA)，2,42,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)(2,4-D)，奈乙，奈乙 酸酸(NAA)(NAA)，吲哚丁酸吲哚丁酸(IBA)(IBA)。生长素的生理作用生长素的生理作用（1）既能促进生

15、长，也能抑制生长；（2）既能促进发芽，也能抑制发芽；（3）既能防止落花落果，也能疏花疏果。浓度较低浓度较低,促进生长促进生长;浓度过高浓度过高,抑制生长甚至杀死植物。抑制生长甚至杀死植物。生长素的生理效应生长素的生理效应：使胞壁酸化，增加可塑性，导致细胞伸长变；促进RNA和蛋白质的合成，保证可持续生长。植植物物激激素素植物对生长素的敏感程度如何呢植物对生长素的敏感程度如何呢?（1 1）营养器官生殖器官）营养器官生殖器官（2 2）根芽茎）根芽茎（3 3）幼嫩细胞衰老细胞）幼嫩细胞衰老细胞（4 4）双子叶植物单子叶植物）双子叶植物单子叶植物植物生植物生长长素素错当农药错当农药 晚晚稻稻疯长疯长比人

16、高比人高当当培培养养基中基中CTKCTK/IAAIAA的比的比值值高高时时，愈愈愈愈伤组织伤组织形成芽；形成芽；当当当当CTKCTKCTKCTK/IAAIAAIAAIAA的比值的比值的比值的比值低低低低时，时，时，时，愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织形成根；形成根；形成根；形成根；如如如如二者二者二者二者的浓度的浓度的浓度的浓度相等，相等，相等，相等，则则则则愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织保持生长而不分化保持生长而不分化保持生长而不分化保持生长而不分化；所以，通过调整二者比值可诱导愈伤组织形成完整的植株所以，通过调整二者比值可诱导愈伤组织形成完整的植株。2.2.分裂素分裂素 6-6-苄基嘌呤

17、苄基嘌呤(6-BA)(6-BA)，激动素，激动素(kinetin,KTkinetin,KT)，玉米，玉米素，嘌呤衍生物素，嘌呤衍生物,6-,6-呋喃氨基嘌呤，呋喃氨基嘌呤，K N K N。19571957年斯年斯库格和米勒在格和米勒在进行烟草的行烟草的组织培培养养时发现：细胞分裂素（细胞分裂素（细胞分裂素（细胞分裂素（CTKCTKCTKCTK）吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA(IAA)，将拟南芥组织置于含生长素将拟南芥组织置于含生长素IBA和细胞和细胞分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生 生长素只促进核的分裂生长素只促进核的分裂(因促进了因促进了DNADNA的合的合成成)，

18、而与细胞质的分裂无关。，而与细胞质的分裂无关。而细胞分而细胞分裂素主要是对细胞质的分裂起作用，裂素主要是对细胞质的分裂起作用，所以，细胞分裂素促进所以，细胞分裂素促进细胞分裂的效应只有细胞分裂的效应只有在生长素存在的前提在生长素存在的前提下才能表现出来。下才能表现出来。在超在超净净工作台接工作台接种种 外植体外植体是植物是植物组织组织培培养养中用中用来进来进行离体无菌培行离体无菌培养养的离体材料，可以是器官、的离体材料，可以是器官、组织组织、细细胞和原生胞和原生质质体体等。等。组织组织培培养养的第一步就是的第一步就是让这让这些器官或些器官或组织组织切切断断去分化去分化.所谓所谓去分化（也叫脱分

19、化）去分化（也叫脱分化）是指离体的植是指离体的植物组织器官或细胞，在物组织器官或细胞，在外源的生长素类物质的外源的生长素类物质的诱导下重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，形诱导下重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，形成一团结构疏松、颜色浅而透明的、高度液泡成一团结构疏松、颜色浅而透明的、高度液泡化的、呈无定形状态的薄壁细胞群的愈伤组织化的、呈无定形状态的薄壁细胞群的愈伤组织的过程。的过程。2.2.诱导去分化去分化阶段段愈伤组织细胞的状态愈伤组织细胞的状态愈伤组织愈伤组织 是指在离体培养过程中形成的是指在离体培养过程中形成的具有分生能力具有分生能力的的一团不规则细胞，一团不规则细胞，它具有它具有再分化再

20、分化成为完整植物体成为完整植物体的潜能，一般在的潜能，一般在外植体的切面处外植体的切面处产生。产生。愈伤组织：愈伤组织：在人工培养基上由外植在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。列疏松、无规则）。分化程度低，属分化程度低，属于胚胎干细胞。于胚胎干细胞。分化程度高，属分化程度高，属于组织干细胞。于组织干细胞。Arabidopsis Tobacco3.0 mg/L 2,4-DGenotypic Effects on Callus Morphology拟南芥拟南芥2,42,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)(2,4

21、-D)Medium Effects on Tobacco Callus Morphology0.1 mg/L kinetin3.0 mg/L 2,4-D3.0 mg/L 2-iP2.0 mg/L IAAfriable calluscompact callus异戊烯基腺嘌异戊烯基腺嘌呤，属于细胞呤，属于细胞分裂素分裂素愈伤组织的形态发生主要有愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式不定芽方式和和胚状体胚状体方式两种。方式两种。不定芽方式不定芽方式是在某些是在某些条条件下，愈件下，愈伤组织伤组织中的分生中的分生细细胞胞发发生分化，形成不同的器官原基，再逐生分化，形成不同的器官原基，再逐渐渐形成芽形成芽和

22、根。和根。胚胚状状体方式体方式是由愈是由愈伤组织细伤组织细胞胞诱导诱导分化出具有胚芽、分化出具有胚芽、胚根、胚胚根、胚轴轴的胚的胚状结构状结构，进进而而长长成完整植株。成完整植株。这种这种由愈由愈伤组织伤组织中的薄壁中的薄壁细细胞不胞不经过经过有性生殖有性生殖过过程，直程，直接接产产生生类类似于胚的似于胚的结构结构，叫做叫做胚胚状状体体。不定芽方式和胚状体方式是植物组织培养中最常见和最重要的两种方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。继代培代培养养是愈是愈伤组织在培在培养养基上生基上生长一段一段时间后，后，营养养物枯竭，水分散失，物

23、枯竭，水分散失，并并已已经积累了一累了一些代些代谢产物，此物，此时需要需要将将这些些组织转移到新的培移到新的培养养基上，基上，这种种转移移称称为继代培代培养养。3.3.继继代增殖代增殖阶阶段段愈愈伤伤组组织织只只有有经经过过重重新新分分化化才才能能形形成成胚胚状状体体，继继而而长长成成小小植植株株。再再分分化化是是指指愈愈伤伤组组织织继继续续培培养养，又又可可以以重重新分化成根或芽等器官的新分化成根或芽等器官的过过程。程。4.4.生根成芽生根成芽阶段段再分化阶段再分化阶段（形芽和根）（形芽和根）5.5.移栽成活移栽成活阶段段生长于人工照明玻璃瓶生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽中的小苗，

24、要适时移栽室外以利生长。室外以利生长。去分化去分化再分化再分化形成植株形成植株愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织分化出芽分化出芽形成试管苗形成试管苗实例：非洲紫罗兰的组织培养实例：非洲紫罗兰的组织培养决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么?影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，而两者不同的浓度配比在再分化过程中，分别对诱导而两者不同的浓度配比在再分化过程中，分别对诱导根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素

25、与生长素浓度比根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。胚状体是怎样形成的？培养胚状体有何意义？胚状体是怎样形成的？培养胚状体有何意义？愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进而发育成完整植株。诱导离体的植物组织

26、形成具有生根发芽能而发育成完整植株。诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮制成人工种子可以解力的胚状结构，包裹上人造种皮制成人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。马铃薯块茎外植体直接分化芽马铃薯块茎外植体直接分化芽植物细胞的大规模培养植物细胞的大规模培养植物细胞植物细胞(组织组织)培养培养植物组织培养与有性生殖相比，有什植物组织培养与有性生殖相比，有什么么优势：优势：繁殖速度快；繁殖速度快；保持保持亲亲本的本的优优良性良性状状（因（因为为是无性生殖）；是无性生殖）；培育无病毒的植株培育无病

27、毒的植株 不受自然生不受自然生长长季季节节的限制（因的限制（因为为在具有一定在具有一定人工人工设设施的室施的室内内生生产产）。）。二、植物细胞培养二、植物细胞培养是是指指在在离离体体条条件件下下，将将愈愈伤伤组组织织或或其其他他容容易易分分散散的的组组织织置置于于液液体体培培养养基基中中，进进行行振振荡荡培培养养，得得到到分分散散成成游游离离的的悬悬浮浮细细胞胞，通通过过继继代代培培养养使使细细胞胞增增殖殖，从从而而获获得得大大量量的的细细胞胞群群体体及及相相关产关产物的一物的一种种技技术术。植物细胞培养植物细胞培养p58植物植物细细胞（胞（组织组织）培）培养养流程流程悬悬浮浮细细胞培胞培养养

28、提取提取纯纯化化产产物物收集收集细细胞胞通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、人参皂甙等人参皂甙等药药物制物制剂剂植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法 植植物物细细胞胞培培养养的的方方法法，根根据据培培养养对对象象，植植物物细细胞胞培培养养主主要要有有悬悬浮浮细细胞胞培培养养（单单细细胞胞培培养养）、单单倍倍体体培培养养、原原生生质质体体培培养养等等。按按照照培培养养系系统统可可分分为为悬悬浮浮培培养养系系统统、固固定定化化培培养养系系统统等。等。单单倍倍体体培培养养：主主要要是是指指花花药药培培养养，即即将将花花药药在在人

29、人工工培培养养基基上上进进行行培培养养，从从小小孢孢子子（雄雄性性生生殖殖细细胞胞）直直接接发发育育成成胚胚状状体体，然然后后长长成成单单倍倍体体植植株株；或或通通过过组组织织诱诱导导分分化化出出芽芽和和根根，最最终终长长成成植植株株。单单倍倍体体植植株株经经人为加倍后可得到完全纯合的个体。人为加倍后可得到完全纯合的个体。原原生生质质体体培培养养：是是将将植植物物的的体体细细胞胞经经过过纤纤维维素素酶酶等等处处理理后后去去掉掉细细胞胞壁壁，获获得的原生得的原生质质体在无菌培体在无菌培养养基上上基上上长长、分裂，最、分裂，最终长终长成植株。成植株。悬悬浮浮细细胞胞培培养养：在在愈愈伤伤组组织织培

30、培养养技技术术基基础础上上发发展展起起来来的的一一种种培培养养技技术术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。一、一、悬悬浮培浮培养养系系统统（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。适于悬浮培养适于悬浮培养适于再生植株适于再生植株适于悬浮培养适于悬浮培养细细胞胞悬悬浮系的建立浮系的建立二、二、单细胞培养单细胞培养1 1、平板培、平板培养养2 2、看、

31、看护护培培养养3 3、微室培、微室培养养4 4、双层滤纸双层滤纸培培养养 悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。平板培养平板培养(plate culture)(plate culture)：将一定密度的悬浮细胞将一定密度的

32、悬浮细胞接种接种到一薄到一薄层固体培养基中进行培养的技术。层固体培养基中进行培养的技术。单细胞的分离：单细胞的分离：用于平板培养的用于平板培养的小细胞团不能超过小细胞团不能超过6 6个细个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤洗涤2 2次后，调整密度为次后，调整密度为5105105 5mlml。植板：植板：将将1 1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 4份份3535的固的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约体

33、培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约12mm12mm。封口封口：用石蜡膜封培养皿。用石蜡膜封培养皿。1 1、细胞平板培养、细胞平板培养看护培养（看护培养（nurse culturenurse culture）：）：是由是由Muir1954Muir1954年设计的。年设计的。操作方法：操作方法：在固体培养基上置入一块在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至细胞团以后，将其直接转至琼脂培

34、养基上让其迅速生长琼脂培养基上让其迅速生长2 2、看护培养、看护培养 它可对单细胞进它可对单细胞进行活体连续观察。行活体连续观察。这一方法也可用这一方法也可用于原生质体培养观察于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞细胞壁的再生和细胞分裂过程。分裂过程。3 3、微室培养、微室培养HorschHorsch等（等（19801980）将平板培养与饲养层培养技术相结）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。合，建立了双层滤纸植板培养方法。4 4、双层滤纸培养、双层滤纸培养初生代谢产物初生代谢产物次生代谢产物次生代谢产物生物大分子生物大分子 三、植物细胞规模化培养体系的建立三、植物细胞

35、规模化培养体系的建立(1(1）准确）准确选择选择能能产产生目的化合物的植物生目的化合物的植物种类种类；(2(2）尽尽量量选择选择自然自然状态状态下下产产生天然生天然产产物的物的组织组织器官器官 为为外植体；外植体；(3)(3)高高产种产种子子细细胞克隆的方法：胞克隆的方法：单细单细胞培胞培养养后，后，将单细将单细胞胞扩扩增形成的愈增形成的愈伤组织伤组织分分2 2份份，1 1份份成分含量分析，成分含量分析，另另1 1份份保留培保留培养养。1 1、种子细胞的选择、种子细胞的选择2 2、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养 种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百种子细胞增

36、殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。至体积较小的生物反应器培养。（1 1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。基后，中途不添加也不更换培养基的方式。（2 2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。的方式。(3)(3

37、)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。方式。3 3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立4 4生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统 Stirred Tank BioreactorsAn external motor is used to agitate the growth medium w

38、ith impellers.Sterile air or combinations of gases can be introduced(sparkling)植物细胞培养罐及模式图植物细胞培养罐及模式图增加溶增加溶增加溶增加溶氧氧氧氧量量量量使使使使细细细细胞胞胞胞与氧气与氧气与氧气与氧气、营养营养营养营养物物物物质质质质充分接充分接充分接充分接触触触触提取、提取、提取、提取、纯纯纯纯化有效化有效化有效化有效物物物物质质质质适宜的酸适宜的酸适宜的酸适宜的酸碱碱碱碱度度度度气压搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统Bubble Column Bioreactor(Airlift Reactor)Int

39、roduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenationInternal Loop Airlift BioreactorTube placed inside the reactor creates internal circulation loop External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 固定化细胞反应器培养固定化细胞反应器培养人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳人工种子人工种子人工种子人工种子体

40、细胞胚体细胞胚胚胚状状体体人工胚乳人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质是包埋体细胞胚的胶状介质人工种皮人工种皮是包在人工种子最外层的胶质薄膜。是包在人工种子最外层的胶质薄膜。体体细细胞胚胞胚是制作人工是制作人工种种子的起始材料。子的起始材料。它既它既可由外可由外植体的表皮植体的表皮细细胞直接胞直接产产生，也可由愈生，也可由愈伤组织伤组织的表的表层层细细胞胞产产生。生。P66三、人工种子三、人工种子任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。人工人工种种子的子的种类种类根据包被的程度可

41、将人工种子分为三大类：根据包被的程度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的裸露的或休眠的繁殖体繁殖体人工种皮包被的人工种皮包被的繁殖体繁殖体水凝胶包被的繁水凝胶包被的繁殖体殖体人工种子研制的意义人工种子研制的意义人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；种，易于机械化操作；不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、有利于工厂化生产；有利于工厂化生产；有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量

42、繁殖无病毒材料物，也可大量繁殖无病毒材料;可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力；子活力；体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。在实际应用中主要有三大难题有待克服：在实际应用中主要有三大难题有待克服：1）许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。）许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。2）现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微）现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。生物的腐蚀。3）人工种子的贮藏有待进一步完善。）人工种子的贮藏有

43、待进一步完善。1.1.培培养养条条件件可可以以人人为为控控制制，免免遭遭大大自自然然灾灾害害性性气气候候的的不不利因素，且具有省地省工可直接在田利因素，且具有省地省工可直接在田间间播播种种等等优优点。点。2.2.在在人人工工种种子子制制作作中中，可可加加入入营营养养物物质质、植植物物生生长长调调节节剂剂、固固氮氮菌菌、杀杀虫虫剂剂等等，有有利利于于幼幼苗苗茁茁壮壮成成长长，提提高高作物作物产产量。量。3.3.人工人工种种子可以工子可以工业业化生化生产产，提高，提高农业农业的自的自动动化程度。化程度。4.4.用人工用人工种种子播子播种种可以可以节约节约粮食。粮食。例例如如，一一个个12 12 L

44、 L的的发发酵酵罐罐在在20d20d内内生生产产的的胡胡萝萝卜卜胚胚状状体体，可可以以制制成成10001000万万粒粒人人工工种种子子，满满足足几几千千公公顷顷农农田的田的种种植需要，植需要，与与天然天然种种子相比，大大子相比，大大节约节约了粮食。了粮食。5.5.一一些些难难以以得得到到天天然然种种子子的的珍珍稀稀植植物物或或脱脱毒毒苗苗、基基因因工工程植株，均可利用人工程植株，均可利用人工种种子技子技术术加速用于生加速用于生产产。人工种子技术确实有着诱人的前景：人工种子技术确实有着诱人的前景：用人工种皮包用人工种皮包被体细胞胚，被体细胞胚，可以制造人工可以制造人工种子种子人工种皮人工种皮：海

45、藻酸钠海藻酸钠解决有些植物解决有些植物结子困难、发结子困难、发芽率低、繁殖芽率低、繁殖困难等问题困难等问题制作过程体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中，CaCl2浓度：2.0%-2.5%时间：20min-30min无菌水漂洗20min，形成人工种子（海藻酸钙凝胶）（云杉）细细胞胞融融合合也也称称体体细细胞胞杂杂交交，又又叫叫无无性性杂杂交交，是是指指利利用用现现代代科科学学技技术术，分分别别取取出出两两种种生生物物的的单单个个细细胞胞，然然后后使使这这两两种种不不同同的的生生物物细细胞胞在在同同一一培培养养器器中中，用用无无性性的的人人工工方方法法促促使使两两者者互互相相凝凝集集

46、并并发发生生细细胞胞之之间间的的融融合合，进进而而导导致致基基因因重重组组，产产生生能能同同时时表表达两个亲达两个亲本本细细胞有益性胞有益性状状的的细细胞胞杂杂交技交技术术。四、四、植物细胞融合植物细胞融合(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体植物体细胞胞杂交交过程示意图过程示意图杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化1 1、过程、过程植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？促进融

47、合促进融合的方法？的方法？融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B去壁去壁去壁去壁纤维纤维素酶素酶果果胶胶酶酶原原生生质质体体植植物物细细胞胞原原生生质质体体融融合合离心、离心、振振动动、电电刺激、刺激、聚乙二聚乙二醇醇再再生生细细胞胞壁壁杂杂种种细细胞胞去去分分化化愈愈伤伤组组织织杂杂种种植植株株激素激素筛筛选选等量等量激素激素再再分分化化植物体细胞杂交植物体细胞杂交过程示意图过程示意图(一一)原生质体的制备原生质体的制备方法：方法：取材与除菌取材与除菌酶解酶解分离分离洗涤洗涤P61P61鉴定鉴定 植物植物细细胞壁的主要成分是胞壁的主要成分是纤维纤维素，素，还还有少量的半有少量的半纤纤

48、维维素、果素、果胶胶、蛋白、蛋白质质等，等，细细胞壁的去除方法主要有机胞壁的去除方法主要有机械法和酶消化法械法和酶消化法两种两种方法。方法。机械法机械法 首先首先将将外植体（或愈外植体（或愈伤组织伤组织）进进行高渗溶液行高渗溶液(可用可用盐盐或糖或糖溶液溶液)处处理理,结结果果会导会导致致细细胞胞脱脱水、水、质质壁分离。之后再以壁分离。之后再以组织捣组织捣碎碎机等高速机械切割机等高速机械切割细细胞，胞，从从而而获获得得脱脱壁壁细细胞。胞。该该法法虽虽然然简单简单易易行，但原生行，但原生质质体体损伤严损伤严重、重、数数量少。量少。酶法酶法 利用消化利用消化细细胞壁的酶，破坏植物胞壁的酶，破坏植物

49、细细胞壁，胞壁，从从而而释释放出植物放出植物原生原生质质体，体，这这是目前是目前应应用的方法。用的方法。常用的酶常用的酶类类有：有：纤维纤维素酶、果素酶、果胶胶酶、半酶、半纤维纤维素酶、素酶、蜗蜗牛酶等牛酶等。通常通常将将在外界在外界因素作用下，使因素作用下，使两两个个或或两个两个以上植物以上植物细细胞合胞合并并成一成一个个多多核核细细胞的胞的过过程程称为称为植物植物细细胞融合，也胞融合，也称为称为植物体植物体细细胞胞杂杂交。交。（二）植物原生质体融合（二）植物原生质体融合融合方法融合方法 化化学学诱诱导导融融合合。该该法法不不需需要要贵贵重重仪仪器器、试试剂剂易易得得，一一直直是是细细胞胞融

50、融合合的的重重要要方方法法。尤尤其其是是聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）结结合合高高PHPH、高高钙钙法法诱导诱导融合方法融合方法。按按比比例例混混合合双双亲亲原原生生质质体体滴滴加加PEGPEG溶溶液液，摇摇匀匀，静静置置滴滴加加高高钙钙高高PHPH溶溶液液，摇摇匀匀，静静置置滴滴加加原原生生质质体体培培养养液液洗洗涤数涤数次次离心离心获获得原生得原生质质体体细细胞胞团团筛选筛选、再生、再生杂杂合合细细胞。胞。物物理理诱诱导导融融合合。显显微微操操作作、离离心心、振振动动等等机机械械方方法法或或电电场场磁磁刺刺激激法法等等均均是是较较为为有有效效地地促促进进细细胞胞融融合合的的方方法法，其其