分子克隆技术的工具酶.ppt

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1、第二章第二章 分子克隆技术的工具酶分子克隆技术的工具酶1n分子克隆的工具酶分子克隆的工具酶（instrumental enzyme of molecular cloning）是应用于分子克隆中的各种酶的总称，包括核酸是应用于分子克隆中的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。制备等所需要的酶类。2 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶核酸修饰酶核酸修饰酶3N

2、MPNTPdNMPdNTP45一、限制性核酸内切酶（一、限制性核酸内切酶（Restriction enzyme）n核酸酶的分类核酸酶的分类1）根据核酸底物分）根据核酸底物分RNA酶（酶（Rnase）DNA酶（酶（Dnase）底物非专一性核酸酶；底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）外切核酸酶（外切核酸酶（exonuclease）；3)根据对底物碱基专一性分根据对底物碱基专一性分 碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）非碱基专一

3、性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）6n核酸酶核酸酶能够将核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶能够将核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵发现：1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind和Hind 7酵母中的限制性酶：SceI、n限制限制-修饰系统修饰系统限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如如噬菌体

4、噬菌体DNA等等)，使得外源，使得外源DNA对生物细胞的入对生物细胞的入侵受到限制；侵受到限制；修饰作用：生物细胞修饰作用：生物细胞(如宿主如宿主)自身自身DNA分子通分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。限制修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶限制修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。维护自身遗传稳定的保护机制。8n细菌中的防卫系统：限制与修饰现象细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易

5、吸收外源）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵的入侵 （3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。就不再被相应的限制

6、酶切割了。（4）细菌自身的）细菌自身的DNA受到甲基化修饰，得以保存受到甲基化修饰，得以保存 （5）外源入侵的）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解未来得及甲基化，被降解 910n作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5），必须是），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体，基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组；分子发生遗传重组；（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。分子不会受其限制酶的降解。112.限制性核酸内切酶的类型主要

7、特性 I 型 II 型 III 型限制修饰限制修饰多功能单功能单功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP Mg2+SAMATP Mg2+SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割特异性切割特异性切割24-26bp处SAM：S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸 12n型酶的作用方式在分子克隆中具有十分重要的价值，型酶的作用方式在分子克隆中具有十分重要的价值，是分子克隆中常用的工具酶。是分子克隆

8、中常用的工具酶。n型酶、型酶、型酶的使用不如型酶的使用不如型酶方便，切割方式不如型酶方便，切割方式不如型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。133.限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名H i n d H i n d Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶14nH：细菌属名的头一个字母：细菌属名的头一个字母nin：细菌种名的头两个字母：细菌种名的头两个字母nHin：表示了该菌的物种名称，用斜体：表示了该菌的物种名称，用斜体nd：代表该菌菌株名称：代表该菌菌株名称nIII：表示

9、该菌具有几个不同的限制与修饰体系，：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，表示该表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶酶是属于第三个限制修饰系统的酶 154.II 型限制性核酸内切酶的基本特性（1）识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列；（2）大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；（3）识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构；5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR的识别序列EcoR 的切割位点16（1）回文结构）回文结构（palindrome）n序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，序列正读和反读是一样的，

10、即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。n在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。17（2）限制性核酸内切酶的切割类型：）限制性核酸内切酶的切割类型：n粘粘末末端端：两两条条链链上上的的断断裂裂位位置置是是交交错错和和对对称称围围绕绕着着一一个个对对称称轴轴排排列列，这这种种形形式式的的断断裂裂结结果果形形成成具具有粘末端的有粘末端的DNA片段；片段；n平平末末端端：两两条条链链上上的的断断裂裂位位置置是是处处在在一

11、一个个对对称称轴轴的的中中心心，这这样样形形式式的的断断裂裂是是形形成成具具有有平平末末端端的的DNA片段。片段。18EcoR等产生的等产生的5粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoR 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHOHPPOHOHPP磷酸二酯键发生水解磷酸二酯键发生水解 n

12、ick缺口缺口 19Pst等产生的等产生的3粘性末端粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHOHPPOHOHPP磷酸二酯键发生水解磷酸二酯键发生水解 nick缺口缺口 20Pvu等产生的平头末端等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-

13、A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5Pvu 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 磷酸二酯键发生水解磷酸二酯键发生水解 21n限制酶的识别序列与限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的与乙种生物的DNA用同用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连

14、接起来。这是重组过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组重组成一种新的重组体分子。体分子。n限制酶切割限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状。这些环状分子经过加热又可以打开成线状。n但如果在环化后加进但如果在环化后加进DNA连接酶，在连接酶，在DNA片段之间的接口处将形片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力，形成的环形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合

15、力，形成的环形DNA将将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。22（3）位点偏爱（）位点偏爱（sitepreference）某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。表现出不同的切割效率。23（4）星号活性（）星号活性（staractivit

16、y）又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、反应液离子强度过低、pHpH改变、有机溶剂的影响改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。等条件，酶切割位点专一性发生改变。24（5）同裂酶）同裂酶(isoschizomers)有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，切割位点可以相同，也可以不核苷酸靶序列，切割位点可以相同，也可以不同。同。例如，例如，XmaI（CCCGGG）SmaI（CC

17、CGGG）25（6）同尾酶）同尾酶(isocaudamers)来来源源不不同同，识识别别的的靶靶序序列列也也各各不不相相同同，但但都都能能产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。常常用用的的BamBamHH和和BglBgl是是一一组组同同尾尾酶酶，它它们们切切割割DNADNA之之后后都都形形成成由由“-GATC-GATC-”4 4个核苷酸组成的粘性末端。个核苷酸组成的粘性末端。265.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作(1)大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClMgCl210 mMNaCl0-150 mMDTT1 mM0-50 mM 低盐酶100

18、mM 中盐酶150 mM 高盐酶Volume20-100 mlT T37 1-2 hr（不能过长或过短）1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量27(2)II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5BamH Sma5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA55 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT33 C

19、GATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA528(2)II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切倍体积的 3 倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥296.影响限制性核酸内切酶活性的因素(1)DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间30(2)DNA样品的甲基化程度：识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性因此在基

20、因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基31(3)DNA的分子结构某某些些限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割超超螺螺旋旋的的质质粒粒DNA或或病病毒毒DNA所所需需要要的的酶酶量量，要要比比消消化化线线性性DNA的的高高出许多倍。出许多倍。此此外外，还还有有一一

21、些些限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，切切割割不不同同位位置置的的限限制位点，其效率亦有明显的差别。制位点，其效率亦有明显的差别。32（4）核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象例如，EcoR在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5AATT3序列。33n酶活性的正常发挥，需要二价阳离子，通常是Mg2+。n缓冲液TrisHCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在的条件下，其

22、功能最佳。n巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。34（5）酶切消化反应的温度大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37，但也有许多例外的情况。357.限制性内切酶反应的终止消消化化DNA样样品品后后，在在进进一一步步处处理理DNA样样品品前前往往往往需需要要钝钝化化内内切切酶酶的的活活性性，钝钝化化大大多多数数限限制制性性内内切切酶酶的的方方法法是是65温温浴浴5分分钟钟。但但有有些些酶酶，如如BamHI和和Hae具具备备对对热热稳稳定定性性，则则需需加加入入终终止止反反应应液液（加加入入0.5mol/L的的EDTA使使之之在在溶溶液液中中的

23、的终终浓浓度度达达到到10mmol/L以螯合以螯合Mg2+）。36限制性核酸内切酶的特点限制性核酸内切酶的特点n识别位点的识别位点的DNA序列具有回文结构；序列具有回文结构；n切割切割DNA均产生含均产生含5磷酸和磷酸和3羟基的末端；羟基的末端；n错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；端；37限制性核酸内切酶的应用限制性核酸内切酶的应用n在特异位点上切割在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶，产生特异的限制酶切片段；切片段；n用限制酶切割产生相同的粘末端以便重组；用限制酶切割产生相同的粘末端以便重组；n建立建立DNA的限制酶切图谱；的限制酶切图谱；n

24、构建基因组文库。构建基因组文库。388.利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：n不不同同的的限限制制酶酶生生产产厂厂家家往往往往推推荐荐使使用用截截然然不不同同的的反反应应条条件件，甚甚至至对对同同一一种种酶酶也也如如此此，所所以以建建议议遵遵循循与与酶一起提供的说明书进行操作。酶一起提供的说明书进行操作。n以以下下是是对对0.21.0ugDNA进进行行消消化化的的典典型型反反应应步步骤骤，如如要要对对更更大大量量的的DNA进进行行消消化化，则则反反应应的的各各个个成成分分须相应放大。须相应放大。391）加入合适体积的）加入合适体积的DNA溶液；溶液；2)加入加入2ul适当的适当的10限制酶消

25、化缓冲液，混匀；限制酶消化缓冲液，混匀；3)加入加入1-2单位限制酶，混匀；单位限制酶，混匀；4)将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育；将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育；mol/LEDTA（）使终浓度达（）使终浓度达10mmol/L，以终止反应；以终止反应；6)消消化化后后的的DNA可可加加入入6ul凝凝胶胶电电泳泳加加样样缓缓冲冲液液混混合合后后，进进行行电电泳检测。泳检测。若欲纯化酶切后的若欲纯化酶切后的DNA，可用酚可用酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA409.使用限制酶的注意点：n1 1）限限制制酶酶十十分分昂昂贵贵!为为能能从从贮贮

26、存存管管内内取取出出极极少少量量的的酶酶，只只要要用用移移液液器器吸吸头头在在酶酶溶溶液液表表面面轻轻沾沾一一下下即即可可，这这样样可可以以取取到到少少至至0 0.1ul.1ul的的酶酶。浓浓缩缩的的限限制制酶酶也也可可在在使使用用前前用用限限制制酶酶缓缓冲冲液液稀稀释释，但但切切勿勿用用水稀释以免酶变性。水稀释以免酶变性。n2)2)限限制制酶酶在在5050甘甘油油中中保保存存于于-20-20时时是是稳稳定定的的。进进行行酶酶切切消消化化时时，将将除除酶酶以以外外的的所所有有反反应应成成分分加加入入后后加加以以混混匀匀，再再从从冰冰箱箱内内取取出出贮贮酶酶管管，立立即即放放置置于于冰冰上上。每

27、每次次取取酶酶时时都都应应换换一一个个无无菌菌吸吸头头，一一旦旦限限制制酶酶中中污污染染了了DNADNA或或其其它它酶酶，将将造造成成财财力力和和时时间间上上的的浪浪费费。操操作作要要尽尽可可能能快快，用用完完后后立立即即将将酶酶放放回回冰冰箱箱，以以使使酶酶在在冰冰箱箱外外放放置置的的时间尽可能缩短。时间尽可能缩短。n3)3)尽尽量量减减少少反反应应中中的的加加水水量量以以使使反反应应体体积积减减到到最最小小，但但要要确确保保酶酶体体积积不不超超过过反反应应总总体体积积的的1 1/1010，否否则则限限制制酶酶活活性性将将受受到到甘甘油油的的抑抑制。制。n4)4)通通常常延延长长消消化化时时

28、间间可可使使所所需需的的酶酶量量减减少少，这这在在切切割割大大量量DNADNA时时不不失失为为一一大大节节约约方方法法。在在消消化化过过程程中中，可可取取少少量量反反应应液液进进行行电电泳泳以以判断消化程度。判断消化程度。41DNA聚合酶作用的特点：（1）要有）要有4种种dNTP作为底物催化合成作为底物催化合成DNA；（2）接受模板指导；）接受模板指导；（3）需要有引物（）需要有引物（3羟基）的存在；羟基）的存在；（4）不能起始合成新的）不能起始合成新的DNA链；链；（5）催化）催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链链3-OH末端；末端；（6）催化）催化DNA的合成方向是的合成方向是53

29、。二、二、DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)42431.大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性（1）大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OH5 5 ppp dNTP Mgppp dNTP Mg2+2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNA p

30、ol IDNA pol I44缺口平移（Nick translation）：5 533的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进（2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：制备制备32P标记标记DNA探针45DNA pol IMg2+5 dNTP 5 ppp dATP（-32P-dATP）462.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）（1）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKleno

31、w酶。酶。KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核的核核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。47（2）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列48补平由核酸内切酶产生的5粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP

32、5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 49DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 50聚合酶（1）T4-DNA聚合酶的基本特

33、性：在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性51（2）T4-DNA聚合酶的基本用途I 切平由核酸内切酶产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5 T4-DNA聚合酶5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。52(2)T4-DNA聚合酶的基本用途II

34、 DNA片段的同位素末端标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+5 ppp dNTP a-32P-dATP 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA polT4-DNA pol5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 53噬菌体DNA聚合酶(1)T7噬菌体DNA聚合酶的基本特性：已知DNA聚合酶中持续合成能力最强改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的测序酶53的DNA

35、聚合酶活性和35的核酸外切酶活性54(2)T7噬菌体DNA聚合酶的基本用途：用于拷贝长段模板的引物延伸反应通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记555.末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）(1)TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，在3端随机掺入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCo2+/Mg2+dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 56TdT的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+/Mg2+dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdT

36、TdTCoCo2+2+/Mg/Mg2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAAAA57（2）TdT的基本用途：DNA片段3末端的同位素标记给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾586.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）（1）反转录酶的基本特性I：以RNA为模板聚合cDNA链3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA反转录酶Mg2+dNTP5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-183AAAAAAAAAAAAAA5mRNA5TTTTTTTTTTTTTT3cDNA59（1）反转录酶的基本特性II 双向外切DNA-RNA杂合

37、链中的RNA链反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA33553 RNA3 RNA55 DNADNA3355反转录酶55 DNADNA3360（2）基因工程中常用的反转录酶：AMV：一种提取自纯化的禽成髓细胞瘤病毒的反转录酶禽源反转录酶在42发挥作用，而鼠源发挥作用，而鼠源反转录酶在37发挥作用发挥作用MMLV：一种是Moloney鼠白血病病毒（MMLV）克隆的反转录酶基因在大肠杆菌的表达产物61（3）反转录酶的基本用途将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库；代替Klenow片段，用于DNA序列测定。627.耐热DNA聚合酶（Taq酶）Taq酶的特点：热稳定性；具有5-3外

38、切酶活性，但不具有3-5外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。离子依赖性；63连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在能够催化在2条条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（连接酶（1igase）。）。这种酶需要在一条这种酶需要在一条DNA链的链的3末端具有一个游离的末端具有一个游离的羟基羟基(-OH)，和另一条和另一条DNA链的链的5末端具有一个磷酸基团末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的分子的作用

39、。作用。三、三、DNA连接酶连接酶（DNA ligase）64 值得注意的一点是，值得注意的一点是，DNA连接酶并不能连接酶并不能连接两条单链连接两条单链DNA分子或环化单链分子或环化单链DNA分子，分子，被连接的被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。链必须是双螺旋的一部分。65常用的两种常用的两种DNA连接酶：连接酶：由大肠杆菌染色体编码的由大肠杆菌染色体编码的DNA连接酶连接酶由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编码的编码的T4DNA连接酶。连接酶。这这两两种种DNA连连接接酶酶，除除了了前前者者用用NAD+烟烟酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸作作能能源源辅辅助助因因子子，后后者

40、者用用ATP腺腺苷苷三三磷磷酸酸作作能能源源辅辅助助因因子子外外，其其它它的的作作用用机机理理并并没没有有什什么么差别。差别。666768连接酶的基本性质（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键：催化5-磷酸基团和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick69（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-

41、U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 570（3）连接多个平头双链DNA分子5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶71连接酶的反应条件Tris-HClMgCl210 mMATP0.5-1 mMDTT5 mMVol

42、ume10-20 mlT T4-16 4-16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下16 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA 所需的酶量。724.粘性末端的连接 DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外连接酶最突出的特点是，它能够催化外源源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组和载体分子之间发生连接作用，形成重组DNA分子。分子。当然，按上述这种方法构建重组体当然，按上述这种方法构建重组体DNA分子分子最主要的缺点是，由限制酶切产生的具有粘性末最主要的缺点是，由限制酶切产生的具有粘性末端的载体端的载体DNA分子，在连接反应中会发生自我环分子，在连接反应中会发生自我

43、环化作用。化作用。为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供多克隆位点，可采用双酶切以避免自我环化。多克隆位点，可采用双酶切以避免自我环化。735.平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mmol/L74平末端平末

44、端DNA片段的连接方法片段的连接方法（1）直接用）直接用T4DNA连接酶连接；连接酶连接；（2）先先用用末末端端核核苷苷酸酸转转移移酶酶，给给平平末末端端DNA分分子子加上同聚物尾巴之后再用加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端）用衔接物连接平末端DNA分子；分子；（4）DNA接头连接法接头连接法75（1）直接用T4 DNA连接酶连接 T4DNA连接酶除了能够封闭具有连接酶除了能够封闭具有3-OH和和5-P末端末端的双链的双链DNA的单链缺口外，在的单链缺口外，在ATP和高浓度酶的条件下，和高浓度酶的条件下，它还能连接具有完全碱基配对的平末端它还能

45、连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平分子，但平末端连接效率不高，基因操作常不采用此法。末端连接效率不高，基因操作常不采用此法。76（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段 运运用用末末端端转转移移酶酶，能能够够将将核核苷苷酸酸加加到到DNA分分子子单单链链延延伸伸末末端端的的3-OH基基团团上上，不不需需要要模模板板链链的的存存在在，一一个个个个加加上上核核苷苷酸酸，构构成成由由核核苷苷酸酸组组成成的尾巴，长度可达的尾巴，长度可达100个核苷酸。个核苷酸。连连接接分分子子的的裂裂口口可可以以通通过过大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I的的作作用用来来填填补补；留留下下的的单单链链缺缺口口则

46、则可可由由DNA连连接接酶酶封封闭闭。上上述述这这种种连连接接DNA分分子子的的方方法法叫叫作作同同聚聚物物尾尾巴巴连连接接法法，简简称同聚物加尾法。称同聚物加尾法。7778(3)用衔接物连接平末端DNA分子 所所谓谓衔衔接接物物(linker)，是是指指用用化化学学方方法法合合成成的的一一段段由由10-12个个核核苷苷酸酸组组成成的的、具具有有一一个个或或数数个个限限制制酶酶识识别别位位点点的寡核苷酸片段。的寡核苷酸片段。衔衔接接物物的的5末末端端和和待待克克隆隆的的DNA片片段段5末末端端，用用T4多多核核苷苷酸酸激激酶酶处处理理使使之之磷磷酸酸化化，然然后后再再通通过过T4DNA连连接接

47、酶酶的的作作用用使使两两者者连连接接起起来来；接接着着用用适适当当的的限限制制酶酶消消化化具具有有衔衔接接物物的的DNA分分子子和和克克隆隆载载体体分分子子，这这样样的的结结果果使使二二者者都都产生出了彼此互补的粘性末端。产生出了彼此互补的粘性末端。7980（4）DNA接头连接法 DNA接头接头(adapter)连接法，于连接法，于1978年由康奈尔大年由康奈尔大学吴瑞教授发明。它是一类由人工合成的一头具有某学吴瑞教授发明。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊双链种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊双链寡核苷酸片段。寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的

48、外源当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，片段连接之后，会使后者成为具粘末端的新会使后者成为具粘末端的新DNA分子，从而易于连接分子，从而易于连接重组。重组。8182四、核酸修饰酶四、核酸修饰酶多聚核苷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或 RNA的5-OH末端上5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+pppATP（g-32P-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 T4-PNP的基本用途：用于探针的末端同位素标记832.碱性磷酸单酯酶：去除DNA和RNA的5端磷酸基小牛胸腺碱性磷酸单酯酶（CIP）：68时失活 大肠杆菌碱性

49、磷酸单酯酶（BAP）：68稳定，且耐酚抽提 5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N作用：催化核酸分子脱掉作用：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使磷酸基团，从而使DNA或或RNA片段的片段的5-P末末端转换成端转换成5-OH末端，在分子克隆中的作用是为了防止粘性末端之间的末端，在分子克隆中的作用是为了防止粘性末端之间的自连。自连。84碱性磷酸单酯酶基本用途：（1）去除载体DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率。（2）去除DNA和RNA的5端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。853.单链核酸

50、外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3355335533553355864.双链核酸外切酶ExoIII33553355Mg2+33553355大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3端外切（1）核酸外切酶 III（ExoIII）87（2）l 核酸外切酶（lExo）lExo33553355Mg2+l核酸外切酶特异性地从5端外切33553355885.单链核酸内切酶：S1核酸酶（1）S1核酸酶的基本特性：来自米曲霉（Aspergillus oryzae）Zn2+必需最适pH需要NaCl 10-300 mmol/L降解单链DNA的速度比降解双