发酵工程原理与技术第二章.ppt

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1、第二章第二章 发酵工业微生物菌种发酵工业微生物菌种制备原理和技术制备原理和技术第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育p微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求p发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育p发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏 有些微生物能在厌氧的条件下生长有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长的生长 有些微生物能进行复杂的代谢有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物有些微

2、生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长有些微生物能在极端的环境下生长微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求p微生物的特性微生物的特性利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强可操作性要强 遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素害的生物活性物质和毒素 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病产生菌及其产物的毒

3、性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）菌无关）p工业化菌种的要求工业化菌种的要求微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求培养条件易于控制培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短生长迅速，发酵周期短 发酵过程产生的泡沫少发酵过程产生的泡沫少 不易感染它种微生物或噬菌体不易感染它种微生物或噬菌体 对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一般的碳源用。般的碳源用。p工业化菌种的要求工业化菌种的要求微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物p细菌（细菌（bact

4、eriabacteria）：常用的有枯草芽孢杆）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。p酵母菌（酵母菌（yeastyeast）：属单细胞真核生物，）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。等。工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物p霉菌（霉菌（mouldmould）：喜偏酸性环境。可用于生产）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。p放线菌（放线菌（actio

5、nmycetesactionmycetes）：原核微生物类群。）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素主要用于生产多种抗生素工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物p担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）：主要用于多）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。p藻类（藻类（algaalga）：许多国家已把它作为人类）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将保健食品和饲料。还可通过藻类将COCO2 2转变为石油；国外还有从转变为石油

6、；国外还有从“藻类农场藻类农场”获得氢能的报道。获得氢能的报道。发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的分离和选育p微生物菌种的分离微生物菌种的分离p微生物菌种的选育微生物菌种的选育微生物菌种的分离微生物菌种的分离p施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法p随机分离方法随机分离方法施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法富集培养富集培养 供给特殊培养基或加入某些抑制剂。供给特殊培养基或加入某些抑制剂。培养方法培养方法分批式富集培养分批式富集培养,连续富集培养连续富集培养固体培养基固体培养基p分批式富集培养（摇瓶培养）分批式富集培养（摇瓶培养）重重复复移移植植几几次次后后，接接种种

7、已已富富集集的的培培养养物物到到固固体体培培养养基基，可可将优势微生物分离出来。将优势微生物分离出来。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法p连续富集培养：连续富集培养：用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。连续富集培养法可以筛选出能连续富集培养法可以筛选出能共共生的稳定混合培养物生的稳定混合培养物，例如用甲，例如用甲烷作碳源筛选到甲烷营养型和一烷作碳源筛选到甲烷营养型和一些非甲烷营养

8、型的共生菌。些非甲烷营养型的共生菌。施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法固体培养基的使用固体培养基的使用 常常用用于于分分离离酶酶产产生生菌菌，选选择择培培养养基基中中常常含含有有所所需需的的基基质，以便促使酶产生菌的生长。质，以便促使酶产生菌的生长。举举例例：产产碱碱性性蛋蛋白白酶酶的的菌菌的的分分离离。碱碱性性土土壤壤铺铺在在pH9pH91010的的琼琼脂脂培培养养基基(含含有有均均匀匀的的不不溶溶性性蛋蛋白白质质)表表面面。根根据据蛋白质水解圈的大小蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。判断蛋白酶的产生能力。施加选择压力的分离方法施加选择压力的分离方法 有有些些微微生生物物的的

9、产产物物对对筛筛选选没没有有任任何何选选择择性性优优势势。因因此此常需随机地分离。常需随机地分离。随机分离方法随机分离方法筛选！筛选！生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选 核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产生菌。生菌。例如：例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。便可检出生长因子产生菌。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选抗生素产生菌筛选抗生素产生菌筛选在含有敏感菌的

10、平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。中，检测抗菌活性。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选药理活性化合物的筛选药理活性化合物的筛选 酶靶法：酶靶法：基基本本原原理理：一一种种化化合合物物如如在在体体外外具具有有抑抑制制代代谢谢过过程程的的某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用。若若将将体体外外筛筛选选出出的的活活性性化化合合物物，再再用用动动物物做做实实验验，可可筛选出新的药理活性化合物。筛选出新的药理活性化合物。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选随机分离方法随机分离

11、方法-筛选筛选多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。随机分离方法随机分离方法-筛选筛选生物进化过程中野生型微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累微生物育种的目的方法：突变、体内重组方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）体外重组（基因工程）微生物菌种的选育微生物菌种的选育 经典育种经典育种：自然选育自然选育和和诱变育种诱变育种 定定向向育育种种：转转化化、转转导导、接接合合、原原生生质质体体融融合合

12、、代代谢谢调控和基因工程等。调控和基因工程等。微生物菌种的选育微生物菌种的选育自自然然选选育育：利利用用菌菌种种自自然然突突变变(Spontaneous(Spontaneous Mutation)Mutation)进进行菌种筛选的过程。行菌种筛选的过程。自然突变自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。：微生物在没有人工参与下所发生的突变。引引起起自自然然突突变变两两个个原原因因：多多因因素素低低剂剂量量的的诱诱变变效效应应和和互互变变异构异构效应。效应。自然选育自然选育前前前前 进进进进 多多因因素素低低剂剂量量诱诱变变效效应应：自自然然突突变变实实质质上上是是由由一一些些原原因因不不详

13、详的的低低剂剂量量诱诱变变因因素素引引起起的的长长期期综综合合效效应应，如如宇宇宙宙空空间间各各种种短短波波辐辐射射、自自然然界界中中普普遍遍存存在在的的一一些些低低浓浓度度诱诱变变物物质质以以及及微微生生物物自自身身代代谢谢活活动动中中所所产产生生的的一一些些诱诱变变物物质质(如如H H2 2OO2 2)的作用等。的作用等。自然突变自然突变 互互变变异异构构效效应应：五五种种碱碱基基第第六六位位上上的的酮酮基基和和氨氨基基，G G 和和T T可可以以酮酮式式或或烯烯醇醇式式出出现现，A A 和和C C可可以以氨氨基基或或亚亚氨氨基基形形式出现。式出现。自然突变自然突变腺嘌呤腺嘌呤(adeni

14、ne,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)五种碱基都能形成酮式五种碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基烯醇式或氨基-亚氨基的互变异亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。互变异构效应互变异构效应互变异构效应互变异构效应p平衡倾向于酮式和氨基时，平衡倾向于酮式和氨基时，DNADNA双链中以双链中以ATAT和和GCGC碱碱基对为主。基对为主。p T T以烯醇式出现，在以烯醇式出现，在DNADNA复制到达该点的一瞬间，与复制到达该

15、点的一瞬间，与G G配对；配对；pC C以亚氨基出现时，在新合成的以亚氨基出现时，在新合成的DNADNA单链的单链的C C点出现点出现A Ap碱基对发生自然突变几率约碱基对发生自然突变几率约1010-8-81010-9-9。结果：结果：1 1、菌种衰退和生产质量下降；、菌种衰退和生产质量下降；2 2、对生产有益的突变。、对生产有益的突变。为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮复壮)。实实际际生生产产中中，从从高高产产批批号号中中取取样样分分离离单单菌菌落落，从中选从中选 出出稳定菌株稳定菌株用于生产。用于生产。自然突变自然突变自然选育自然选育p自然选育的优越

16、性自然选育的优越性:简单易行简单易行,可以达到纯化菌可以达到纯化菌种种,防止菌种衰退防止菌种衰退,稳定生产稳定生产,提高产量的目的提高产量的目的.p缺点缺点:效率低效率低,进展慢进展慢,很难使生产水平大幅度提很难使生产水平大幅度提高高.诱变育种理论基础：诱变育种理论基础：基因突变基因突变。诱变育种诱变育种 自然突变：自然突变：自然条件下出现的基因突变。自然条件下出现的基因突变。诱诱发发突突变变：用用各各种种物物理理和和生生物物因因素素、化化学学因素人工诱发的基因突变。因素人工诱发的基因突变。诱诱变变剂剂处处理理使使菌菌种种发发生生突突变变频频率率和和变变异异幅幅度度提提高高获得特性优良变异菌株

17、的几率高。获得特性优良变异菌株的几率高。诱变育种诱变育种主要步骤主要步骤出发菌株的诱变处理出发菌株的诱变处理 和和 突变体的筛选突变体的筛选。前进前进前进前进出发菌株诱变处理出发菌株诱变处理 包括：包括：出发菌株的选择出发菌株的选择诱变剂的选择诱变剂的选择诱变剂量和处理时间的确定诱变剂量和处理时间的确定 返返返返 回回回回（1 1）出发菌株出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。几个应注意的问题几个应注意的问题（2 2）复合诱变因素的使用）复合诱变因素的使用 野野生生型型菌菌株株用用单单一一诱诱变变因因素素有有时时能能取取得得好

18、好效效果果；老老菌菌种种单单一一诱诱变变因因素素重重复复使使用用突突变变效效果果不不高高，可可利利用用复复合合因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。青青霉霉菌菌选选育育：先先以以氮氮芥芥处处理理很很短短时时间间而而不不引引起起突突变变，再再用用UVUV处处理理，可可使使诱诱变变频频率率大大为为提提高高。提提高高突突变变频频率率可可获得高产菌株。获得高产菌株。几个应注意的问题几个应注意的问题 乙烯亚胺和乙烯亚胺和UVUV复合处理，氯化锂和复合处理，氯化锂和UVUV复合处理，都复合处理，都用得较普遍，且有一定成效。用得较普遍，且有一定成效。氯化锂氯化锂本身无诱变作用，

19、与一些诱变因子一起使用时本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时能促进突变。能促进突变。几个应注意的问题几个应注意的问题（3 3）剂量选择）剂量选择 变变异异率率取取决决于于诱诱变变剂剂量量，变变异异率率和和致致死死率率之之间间有有一一定关系。定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据用致死率作为选择适宜剂量的依据。合适剂量合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。：同时增加变异幅度与正突变。几个应注意的问题几个应注意的问题 绝大部分个体死亡绝大部分个体死亡少数存活少数存活 多数未变多数未变 少数突变少数突变 多数负变多数负变 少数正变少数正变 多数幅度小多数幅度小 少数幅度大少数幅度大 多数不宜投产多

20、数不宜投产 少数适宜投产少数适宜投产存活率存活率 突变率突变率 正变率正变率 高产率高产率 投产率投产率 （4 4）变异菌株的筛选）变异菌株的筛选 诱变目的诱变目的：高产菌株、新产物。：高产菌株、新产物。几个应注意的问题几个应注意的问题突变体的筛选突变体的筛选 一般经初筛和复筛一般经初筛和复筛初筛初筛：一般：一般定性定性，更多的是通过，更多的是通过平板平板采用变色圈、透明圈、采用变色圈、透明圈、抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某变异特性的某变异特性的 存在存在，粗略推算出产量，有时也用液体培养。，粗略推算出产量，有时也用液体培养。复筛：复筛：对初筛结果的菌株生产

21、性能作比较精确的对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的定量定量测定测定 还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产例子例子例子例子前进前进前进前进1231 123初筛初筛对照对照对照对照(HC0=HC1+HC2+HC3)HC0=HC1+HC2+HC3)(HC1 HC0能力增强能力增强)(HC2 HC0能力减弱能力减弱)(HC3=HC0能力不变能力不变)诱变诱变诱变诱变1 1233对照对照对照对照(HC0=HC1+HC2+HC3)HC0=HC1+HC2+HC3)(HC1 HC0能力增强能力增强)(HC2 HC0能力减弱能力减弱)(HC3=HC0能力不变能力

22、不变)诱变诱变诱变诱变1233 诱诱变变后后的的突突变变株株会会继继续续变变异异，低低单单位位菌菌株株在在传传代代过过程程中中往往往往占占优优势势，因因此此复复筛筛中中常常常常出出现现产产量量高高低低不不稳稳的的状状态态，必须进行自然分离必须进行自然分离诱变育种和杂交育种必须环节。诱变育种和杂交育种必须环节。自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型抗阻遏和抗反馈突变型 特殊变异菌的筛选方法特殊变异菌的筛选方法组成型突变株组成型突变株抗（敏感）性突变株抗（敏感）性突变株高丝氨酸缺陷菌生产高丝氨酸缺陷菌生产

23、赖氨酸赖氨酸必需氨基酸必需氨基酸食品、医药、畜牧业需要量很大食品、医药、畜牧业需要量很大但但在在代代谢谢过过程程中中，一一方方面面赖赖氨氨酸酸对对天天冬冬氨氨酸酸激激酶酶有有反反馈馈抑抑制制，另另一一方方面面还还同同时时生生成成苏苏氨氨酸酸和和甲甲硫硫氨氨酸酸，使使赖赖氨氨酸酸不不能能在在细细胞内累积胞内累积高高丝丝氨氨酸酸缺缺陷陷菌菌（不不能能合合成成高高丝丝氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶，补补充充适适量量高高丝丝氨酸）则合成大量赖氨酸氨酸）则合成大量赖氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸 磷酸磷酸天冬氨酸天冬氨酸 半醛半醛高丝氨酸高丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 甲硫甲硫氨酸氨酸 赖氨酸赖氨酸AKHSDH的代

24、谢调节与赖氨酸生产的代谢调节与赖氨酸生产为反馈抑制为反馈抑制为阻遏为阻遏AK：天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 p淘汰野生型淘汰野生型 p检出缺陷型检出缺陷型 p鉴定缺陷型鉴定缺陷型 前前前前 进进进进淘汰野生型淘汰野生型 原因：原因：营养缺陷型的比率很低，只有百分营养缺陷型的比率很低，只有百分 之几到千分之几，淘汰为数众多的之几到千分之几，淘汰为数众多的 野野生生型型菌菌株株，可可达达到到“浓浓缩缩”营营养养缺缺 陷型的目的陷型的目的 方法：方法：抗生素法抗生素法或或菌丝过滤法菌丝过滤法返返返返 回回回回抗生素法抗生素法 原原

25、理理：抗抗生生素素只只杀杀死死生生长长中中的的细细菌菌或或真真菌菌，在在基基本本培培养养基基上上加加抗抗生生素素，将将野野生生型型细细菌菌杀杀死死，营营养养缺缺陷陷型型不不死，从而来浓缩营养缺陷型死，从而来浓缩营养缺陷型细菌细菌 通常通常 青霉素青霉素 （抑制细胞壁的合成）（抑制细胞壁的合成）真菌真菌 制霉菌素制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）（破坏真菌细胞膜）返返返返 回回回回菌丝过滤法菌丝过滤法 原理：原理：在在基本培养基基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷上野生型发育成菌丝而营养缺陷 型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大

26、部分野生型个体。纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。条件：条件：丝状真菌和放线菌丝状真菌和放线菌返返返返 回回回回检出缺陷型检出缺陷型 pA A夹层培养法夹层培养法 pB B逐个检出法逐个检出法 pC C影印培养法影印培养法 返返返返 回回回回夹层培养法夹层培养法 方法：方法：先倒一薄层不含菌先倒一薄层不含菌MMMM，冷凝后加上一层混有经过，冷凝后加上一层混有经过诱变处理的菌液的诱变处理的菌液的MMMM，再浇一，再浇一薄层薄层不含菌不含菌MMMM，“三明三明治治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四层层CMCM培养，野生型继续繁殖，

27、菌落变大，营养缺陷型开培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开始生长，菌落较小始生长，菌落较小 CMMM培养皿侧面培养皿侧面培养皿正面（新、小菌落培养皿正面（新、小菌落即营养缺陷型）即营养缺陷型）返返返返 回回回回逐个检出法逐个检出法 依次挑取菌落依次接种在依次挑取菌落依次接种在MMMM和和CMCM培养比较，在完全培养基培养比较，在完全培养基的某一部位长出菌落而的某一部位长出菌落而MMMM不长，则是营养缺陷型不长，则是营养缺陷型 CM MMCM营养缺陷型营养缺陷型返返返返 回回回回影印培养法影印培养法完全培养基完全培养基影印接种影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型营养缺陷型返返返返 回回

28、回回营养缺陷型营养缺陷型影印培养法影印培养法返返返返 回回回回鉴定缺陷型鉴定缺陷型 生长谱法生长谱法 返返返返 回回回回生长谱法生长谱法 方法：方法：营养缺陷型菌株与营养缺陷型菌株与MMMM以一定的浓度混合倒在以一定的浓度混合倒在培养皿上，干燥后，在皿底培养皿上，干燥后，在皿底画上若干区域，然后，在正画上若干区域，然后，在正面加上微量的氨基酸、维生面加上微量的氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物的素、嘌呤或嘧啶等营养物的粉末或结晶（滤纸片法也可）粉末或结晶（滤纸片法也可）。培养后，如果某一营养物的培养后，如果某一营养物的周围有微生物的生长圈，说周围有微生物的生长圈，说明它就是微生物的营养缺陷明它

29、就是微生物的营养缺陷型。型。返返返返 回回回回诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法反馈抑制和反馈阻遏反馈抑制和反馈阻遏阻遏蛋白阻遏蛋白操纵基因操纵基因抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株p结构基因突变，使结构酶无结合能力但结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；有催化活性；末端产物的积累末端产物的积累p调节基因或操纵基因突变调节

30、基因或操纵基因突变p产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合，但不发生作用；合，但不发生作用；末端产物的积累末端产物的积累抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选方法方法：末端产物结构类似物筛选；末端产物结构类似物筛选；未突变者死，未突变者死，突变为抗者生并产菌落突变为抗者生并产菌落营养缺陷型回复突变株筛选。营养缺陷型回复突变株筛选。活性复，结构改变活性复，结构改变目标产物结构类似物赖氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)苏氨酸-氨基-羟基戊酸（AHV)异亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸组成酶和诱导酶组成酶和诱导酶

31、组成酶组成酶 微生物有些酶总是适量地存在微生物有些酶总是适量地存在,它们是不依赖它们是不依赖 于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶酶,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。诱导酶诱导酶 适应性酶适应性酶,是依赖于某种底物或底物的结构类是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。似物的存在而合成的酶。大大肠肠杆杆菌菌乳乳糖糖操操纵纵子子i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A有乳糖时有乳糖时调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋白调节蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白RNARNA聚合酶

32、聚合酶i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A诱导物乳糖诱导物乳糖无活性的无活性的阻遏蛋白阻遏蛋白转录转录翻译翻译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶mRNAmRNA没有乳糖时没有乳糖时诱导酶弊端诱导酶弊端诱导酶的生产需要诱导物，而诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。诱导物有及分解产物的影响。诱导物有时又比较昂贵。时又比较昂贵。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少会引起酶合成的减少.生产成本提高生产成

33、本提高 组成型突变株组成型突变株p突变发生在调节基因或操纵基因突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物解除对诱导物的依赖的依赖,可获组成型突变株。可获组成型突变株。p少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株超产突变株。前前前前 进进进进i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac Alac A有乳糖时有乳糖时调节蛋白亚基调节蛋白亚基 调节蛋白调节蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白RNARNA聚合酶聚合酶i i基因基因P POOLac ZLac ZLac YLac Ylac

34、 Alac A诱导物乳糖诱导物乳糖无活性的无活性的阻遏蛋白阻遏蛋白转录转录翻译翻译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷通透酶半乳糖苷通透酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶mRNAmRNA没有乳糖时没有乳糖时p筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物交替培养法交替培养法显色反应法显色反应法组成型突变株筛选组成型突变株筛选组成型突变株筛选组成型突变株筛选加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基如：加邻硝基-D-D-岩藻糖苷，抑制岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷半乳糖苷酶合成。酶合成。诱导型不能利

35、用乳糖，不长；组成型产酶，能利诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。用乳糖，生长，被富集。组成型突变株筛选组成型突变株筛选交替培养法交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养含诱导物（乳糖）中培养组成型组成型快快不含诱导物（葡萄糖）中培养不含诱导物（葡萄糖）中培养诱导型失酶诱导型失酶反复。反复。组成型突变株筛选组成型突变株筛选显色反应法显色反应法 不含诱导物平板培养不含诱导物平板培养加底物加底物分分解（有颜色变化）解（有颜色变化）检出。检出。如如:邻邻-硝基苯酚半乳糖苷硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)可被可被-半乳糖半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻苷酶水解为半乳糖和黄

36、色的邻-硝基苯酚硝基苯酚（ONPONP）抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选p包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量；抗生素抗性突变：提高产量；抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；条件抗性突变：如温度，可提高产量；条件抗性突变：如温度，可提高产量；（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选敏感突变：敏感突变：如：柠檬酸如：柠檬酸-异柠檬酸异柠檬酸氟乙酸抑制顺乌头酸酶氟乙酸抑制顺乌头酸酶氟乙酸敏感突变型氟乙酸敏感突变型顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。少，柠檬酸积累。顺乌头酸酶顺乌头酸酶