基因组DNA的提取及电泳鉴定.ppt

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1、 分子生物学实验 1 1、欢迎大家参加分生实验的学习；欢迎大家参加分生实验的学习；2 2、学习分生实验的重要性；学习分生实验的重要性；3 3、守纪律，听老师安排，穿白衣；守纪律，听老师安排，穿白衣；4 4、每组做一份实验每组做一份实验4 4、本课件原则上禁止拷贝，要作好记录本课件原则上禁止拷贝，要作好记录;5 5、关于课间休息和上课时间关于课间休息和上课时间每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。实验课考试实验课考试1.1.1.1.最后最后最后最后2 2 2 2学时进行实验课考试学时进行实验课考试学时进行实验课考试学时进行实验课考试 2.2.2.2.开卷

2、开卷开卷开卷,但不许抄袭其它同学试卷。但不许抄袭其它同学试卷。但不许抄袭其它同学试卷。但不许抄袭其它同学试卷。内容为实验课学习内容。内容为实验课学习内容。内容为实验课学习内容。内容为实验课学习内容。一、加样器的使用及注意事项一、加样器的使用及注意事项 1 1、用途用途 2 2、如何使用？如何使用？2.1 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。根据取样量，选择合适的加样器。5 5ulul、50ul50ul、500ul500ul，应选择哪个加样器应选择哪个加样器?顶部标有加样器的顶部标有加样器的最大量程最大量程，分别为：分别为：20ul:20ul:20 20 l l100/200ul:20100/

3、200ul:20 100/200 100/200 l l 1000ul:200ul1000ul:200ul 1000 1000 l l 实验仪器的使用及注意事项实验仪器的使用及注意事项练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为 10100 0，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少?2.2 2.2 如何调节？如何调节？(1)(1)首先观察目前读数首先观察目前读数,假设为假设为050:050:1000 1000 l:500 l:500 l l 100/200 100/200 l:50 l:50 l l 20 20 l l：5 5 l

4、l (2)(2)顺时针调节顺时针调节-读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节-读数变大读数变大(3)(3)注注意意：调调节节前前加加样样器器读读数数正正处处于于最最大大量量程程或或最最小小量量程程时时，如如果果向向错错误误方方向向调调节节，马马上上会会超超出出量量程程，将将会损害加样器的精度。会损害加样器的精度。2.3 2.3 加样器使用步骤加样器使用步骤(示教及学生练习示教及学生练习)：1 1 1 1）选择加样器）选择加样器）选择加样器）选择加样器,观察读数观察读数观察读数观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。调节读数，吸头的安装要紧密。调节读数，吸头的安装要紧密。调节读数，吸头的安装要紧密

5、。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。2 2 2 2）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到第一挡第一挡第一挡第一挡。3 3 3 3）将吸头插入液面下适当深度，）将吸头插入液面下适当深度，）将吸头插入液面下适当深度，）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐蚀加样器过深可能会腐蚀加样器过深可能会腐蚀加样器过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。4 4 4 4）缓慢缓慢缓慢缓慢松开拇指松开拇指松开拇指松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲

6、会腐蚀加样器吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟完全放开拇指后，停留约半秒钟完全放开拇指后，停留约半秒钟完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。5 5 5 5）抬起加样器）抬起加样器）抬起加样器）抬起加样器,估计体积是否正确估计体积是否正确估计体积是否正确估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去将外壁液体用容器口引流回去将外壁液体用容器口引流回去将外壁液体用容器口引流回去6 6

7、 6 6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！坏加样器！坏加样器！坏加样器！),),),),贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体匀速匀速匀速匀速打出，加样器推到打出，加样器推到打出，加样器推到打出，加样器推到第二挡第二挡第二挡第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即观察吸头内液体是否完全打出并立即观察吸头内液体是否完全打出并立即观察吸头内液体是否完全打出并立即弃弃弃弃于

8、废物盒内于废物盒内于废物盒内于废物盒内.1 1、打开电源、打开电源 2 2、离心管中的液体为、离心管中的液体为2/3,2/3,盖紧盖子盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。防止离心机被腐蚀。二、离心机的使用注意事项二、离心机的使用注意事项 1代表转速盘上方的数据，代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。代表下方的数据。3 3、样品配平、样品配平,对称对称放入离心机放入离心机(管的连接管的连接处朝外处朝外).).4 4、设定离心时间、设定离心时间(如如设定设定2 2分钟，可定时多分钟，可定时多点时间，再用手表记点时间，再用手表记时时)。5 5、统一离心统一离心，逐渐，逐渐升到要求转速。升到要求转速。实验一

9、、实验一、真核细胞基因组真核细胞基因组DNADNA的的提取、酶切及电泳提取、酶切及电泳实验目的1.1.1.1.掌掌掌掌握握握握人人人人外外外外周周周周血血血血基基基基因因因因组组组组DNADNADNADNA的的的的提取技术提取技术提取技术提取技术。2.2.2.2.学习学习学习学习酶切酶切酶切酶切技术技术技术技术3.3.3.3.学学学学习习习习DNADNADNADNA琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电泳电泳电泳电泳的原理和技术。的原理和技术。的原理和技术。的原理和技术。第一部分第一部分 ：裂解血细胞、：裂解血细胞、蛋白酶蛋白酶k k消化消化第二部分第二部分:酚氯仿抽提、酚氯仿抽提、乙醇沉

10、淀乙醇沉淀第三部分：第三部分：酶切、酶切、DNA DNA电泳电泳实验内容（到（到 8：308:40）mlml Eppendorf管中管中.2）加入）加入1ml STMT 溶液，充分混匀，静置溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。，使其溶血。3）9,000rpm,离心离心 3 分钟分钟(统一离心统一离心)。4）弃上清。弃上清。弹管底重悬弹管底重悬沉淀沉淀。注意注意:离心时离心机内样品要平衡离心时离心机内样品要平衡 实验步骤实验步骤实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶K消化消化加样器使用提示：加样器使用提示：（1 1）吸头的安装要紧密。）吸头的安装要紧密。（2 2）打

11、到）打到第一挡第一挡，将吸头插入液面下适，将吸头插入液面下适当深度（当深度（3 3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（液面下停留一下（约半秒钟）（4 4）将外壁液体用容器口引流回容）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（器。吸头内的体积应大致正确。（5 5）贴目的容器内壁，将液体匀）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到速打到目的容器内，加样器推到第二挡第二挡。观察吸头内液体是否完全。观察吸头内液体是否完全打出。打出。8：409：15 ml生理盐水，悬浮细胞。5）9000rp

12、m,离心 3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。6）加460 l NE溶液，混匀。7）加30 l 10%SDS,迅速混匀。8）加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置置50C水浴水浴1小时。小时。操作注意事项：操作注意事项：1、混匀时确认沉淀、混匀时确认沉淀已被悬起。已被悬起。2、注意、注意30ul、50ul加样体积准确。加样体积准确。加样器使用提示：加样器使用提示：（1 1）吸头的安装要紧密。）吸头的安装要紧密。（2 2）打到）打到第一挡第一挡，将吸头插入液面下适，将吸头插入液面下适当深度（当深度（3 3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放

13、开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（液面下停留一下（约半秒钟）（4 4）将外壁液体用容器口引流回容）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（器。吸头内的体积应大致正确。（5 5）贴目的容器内壁，将液体匀）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到速打到目的容器内，加样器推到第二挡第二挡。观察吸头内液体是否完全。观察吸头内液体是否完全打出。打出。一、核酸提取的主要步骤一、核酸提取的主要步骤 课间介绍课间介绍 n真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:n1)1)破破碎碎细胞；细胞；n2)2)去除蛋白质，糖类等去除蛋白质，糖类等生物大分子生物大分子；由于真核细胞基因组

14、较大，在纯化出的的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对的剪切，从而获得相对完整的n3)3)沉淀核酸沉淀核酸乙醇沉淀乙醇沉淀SDS裂解裂解蛋白酶蛋白酶K消化消化琼脂糖电泳琼脂糖电泳PCRPCRDNA提取步骤图解提取步骤图解酚氯仿抽提酚氯仿抽提1、STMT 溶液溶液：四种成份的英文缩写 S:Sugar 8%T:Triton X-100 1%M:MgCl2 T:Tris-HCl 10mM(PH:8.0)作用：作用：用用Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。细胞膜上打孔，裂解细胞。从末梢血中提取从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。主要是从白细胞中提取。（而红细胞

15、经过溶血处理后都已经裂解）。（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用作用：作用：a.a.阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.b.使蛋白质变性使蛋白质变性 c.c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用N:NaCl 50mMN:NaCl 50mM2 2 25mM(PH:8.0)25mM(PH:8.0)作用：作用：金属离子螯合剂，抑制金属离子螯合剂，抑制DNaseDNase的活性的活性 (螯合螯合DNaseDNase发挥活性所需的发挥活性所需的2

16、 2价阳离子价阳离子)。二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用1 1、NE NE 溶液：溶液：2 2、SDS SDS：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 终浓度终浓度0.5%0.5%3 3、蛋白酶、蛋白酶K(K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶)是广谱蛋白酶，能在是广谱蛋白酶，能在SDSSDS和和EDTAEDTA的存在下保持很高的活性，的存在下保持很高的活性，降解蛋白质降解蛋白质降解蛋白质降解蛋白质，将，将，将，将DNADNADNADNA游离。游离。游离。游离。重蒸酚重蒸酚重蒸酚重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对酚的作用是变性蛋白质，而对酚的作用是变性蛋白质，而对酚的作用是变性蛋白质，而对DNADNADNAD

17、NA结构没有影响。结构没有影响。结构没有影响。结构没有影响。无色无色无色无色 酚的氧化产物酚的氧化产物酚的氧化产物酚的氧化产物(如醌等如醌等如醌等如醌等,粉红色粉红色粉红色粉红色)破坏磷酸二脂键。破坏磷酸二脂键。破坏磷酸二脂键。破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TETETETE溶液溶液溶液溶液:Tris-HCl 10mM(pH:8.0)Tris-HCl 10mM(pH:8.0)Tris-HCl 10mM(pH:8.0)Tris-HCl 10mM(pH:8.0)2 2 2 2 1

18、mM (pH:8.0)1mM (pH:8.0)1mM (pH:8.0)1mM (pH:8.0)作用：提供略碱的作用：提供略碱的作用：提供略碱的作用：提供略碱的pHpHpHpH值，保证值，保证值，保证值，保证DNADNADNADNA溶于水相。溶于水相。溶于水相。溶于水相。在酸性条件下，在酸性条件下，在酸性条件下，在酸性条件下，DNADNADNADNA分配于有机相。分配于有机相。分配于有机相。分配于有机相。8-8-8-8-羟基喹啉：羟基喹啉：羟基喹啉：羟基喹啉：0.1%0.1%0.1%0.1%黄色黄色黄色黄色 酚相指示剂酚相指示剂酚相指示剂酚相指示剂 抗氧化剂抗氧化剂抗氧化剂抗氧化剂作作用用：去去

19、除除蛋蛋白白等等杂杂质质。酚酚对对蛋蛋白白有有强强烈烈的的变变性性作作用用，用用酚酚和和氯氯仿仿抽抽提提样样品品，可可以以使使样样品品中中的的蛋蛋白白质质变变性性沉沉淀淀，可可通通过过离离心心去去除除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。4 4、TETE饱和重蒸苯酚：饱和重蒸苯酚：氯仿作用：氯仿作用：氯仿作用：氯仿作用：a.a.a.a.氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同但与酚共同但与酚共同但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；交替使用可增强去蛋白效果；交替使用可增强去蛋白效果；交替使用可增强去蛋白效果；b.氯仿有加速有

20、机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；5 5、酚、酚/氯仿氯仿 6 6、氯仿、氯仿/异戊醇异戊醇 (24:1)(24:1)氯仿的作用：氯仿的作用：氯仿的作用：氯仿的作用：去除去除去除去除DNADNADNADNA水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：异戊醇的作用：异戊醇的作用：异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。减少操作过程中气泡的产生。在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单

21、价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNADNADNADNA发生沉淀。可发生沉淀。可发生沉淀。可发生沉淀。可离心收集离心收集离心收集离心收集 .v核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。v最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等v常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等。8 8、无水乙醇、无水乙醇 ：作用：提供单价阳离子。作用：提供单价阳离子。作用：提供单价阳离子。作用：提供单价阳离子。7 7、醋酸钠：、醋酸钠：3 3M NaAcM NaAc课间休息课间休息 同学自己练习：同学自己练习

22、：加样器使用提示：加样器使用提示：（1 1）吸头的安装要紧密。）吸头的安装要紧密。（2 2）打到）打到第一挡第一挡，将吸头，将吸头插入液面下适当深度（插入液面下适当深度（3 3）缓慢松开拇指，吸取液体。缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒液面下停留一下（约半秒钟）（钟）（4 4）将外壁液体用容）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（的体积应大致正确。（5 5）贴目的容器内壁，将液体贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加匀速打到目的容器内，加样器推到样器推到第二挡第二挡。观察吸。观察吸头内液体是否

23、完全打出。头内液体是否完全打出。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl(sodium dodecyl sulfatesulfate，简称，简称SDS)SDS)等离子型表面等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使使核蛋白解聚，从而使DNADNA得以游得以游离出来。离出来。蛋白酶蛋白酶K K。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸因核酸(DNA(DNA、RNA)RNA)水溶性很强，经水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎离心后即可

24、从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使上清液中加入无水乙醇使DNADNA沉淀，沉淀，沉淀沉淀DNADNA溶于溶于TETE溶液中，即得总溶液中，即得总DNADNA溶液。溶液。10:0010:00上课上课上课上课1、加入加入550ul(等体积等体积)TE饱和酚饱和酚,混匀混匀1min.10,000rpm,2 min。(注意抽取下层酚相;酚可腐蚀加样器等,加样器头用过即弃掉)(轻柔混匀，避免DNA链断裂;但是太轻又起不到变性蛋白的作用)2、将、将上层水相上层水相移至一新管中移至一新管中(要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。加入加入500ul(等体积等体积)酚酚/氯仿

25、氯仿(已经配好，体积比1:1),同上条件同上条件混匀、离心。混匀、离心。3、将上层水相移至一新管中。将上层水相移至一新管中。加入加入500ul(等体积等体积)氯仿氯仿-异戊醇异戊醇，同上条件同上条件离心、取上清。离心、取上清。4、加入、加入1/10体积（约体积（约30ul）醋酸钠醋酸钠于上清中充分混匀。于上清中充分混匀。无水乙醇无水乙醇（约（约1ml）（通常加满小离心管（通常加满小离心管），），混匀后交给老师，（统一置）混匀后交给老师，（统一置）-20 1 h(或或-70 10 min)。实验第二部分、实验第二部分、酚氯仿抽提酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀及乙醇沉淀 注意事项：注意事项：1）本实验

26、将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清；2）在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂尤其不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。3）基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作，如用加样器反复吹打等，有时需要将加样器头尖剪断，以防由于太细造成基因组DNA通过狭小通道而断裂。乙醇沉淀后午休。乙醇沉淀后午休。注意事项：双蒸水溶解沉淀要充分。注意事项：双蒸水溶解沉淀要充分。8.加入加入13 l 双蒸水双蒸水,溶解沉淀，溶解沉淀，-20保存。保存。6、10,

27、000 r/min 离心离心 5 min，弃上清，弃上清(倒倒)。10,000 r/min 离心离心 1 min，弃上清，弃上清(吸吸)。7、用滤纸条吸干管内壁液体、用滤纸条吸干管内壁液体(不要触及不要触及DNA沉淀沉淀)，室温干燥室温干燥10 min，观察观察DNA沉淀的颜色。沉淀的颜色。8 l：酶切、电泳酶切、电泳 余余 5 l：PCR模板（下次课进行）。模板（下次课进行）。9、基因组、基因组DNA的酶切：的酶切：基因组基因组DNA 8 ul 10 x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入最后加入)0.6 ul 置置 37 保温保温 45 min。实验第三部分：基因组实验第三

28、部分：基因组DNA的酶切的酶切 1:002:20 课间介绍（课间介绍（2）：）：1.酶切相关知识酶切相关知识1、酶活性单位酶活性单位 Unit（U）：）：1U:是指在1小时内，适当温度下(37C)，在50ul 反应体系中，将1ug of lambda DNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。2、酶切体系：酶切体系：10反应缓冲液：提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。双蒸水：无细菌和其他酶类污染。BSA：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。内切酶：含50%甘油，-20保存。反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应5%。1.Southern blot DNA水平基因结

29、构分析的重要策略之一水平基因结构分析的重要策略之一.基因组基因组DNA酶切电泳后可以直接用于酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。转膜。2.构建基因组文库构建基因组文库的模板的模板 克隆表达基因克隆表达基因 分析基因一级结构的变化分析基因一级结构的变化 基因组基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性；产物的酶切电泳可以分析基因多态性；利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。课间介绍课间介绍 提取模板提取模板DNA的常见目的：的常见目的：由于基因组由于基因组DNA的链很长，常用的蛋白酶的链很长，常用的蛋白酶

30、K酚抽提法由于机械剪切力的作用，很难获酚抽提法由于机械剪切力的作用，很难获得完整的得完整的DNA分子分子,可获得可获得100kb-150kb大小的大小的DNA片断，可满足下述实验用途。片断，可满足下述实验用途。DNA琼脂糖凝胶电泳1.内切内切酶消化酶消化后的后的DNA片片段段琼脂糖凝胶取下硝酸纤维素膜标记探针杂交袋4.将硝酸纤维素将硝酸纤维素膜放入杂交袋中膜放入杂交袋中,预预杂交杂交;杂交杂交:与标记的核酸探与标记的核酸探针针;洗膜洗膜放射自显影后的X光底片将硝酸纤维素膜与X-光片曝光2.变性变性 中和中和3.转膜转膜5.放射自显影放射自显影或显色或显色 Southern Blot 基本过程基

31、本过程 实验第四部分、实验第四部分、DNA质量检测质量检测 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 一、一、原理原理DNA分子在分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。迁移。电电泳泳样样品品载载体体琼琼脂脂糖糖是是一一种种线线性性多多糖糖聚聚合合物物，煮煮沸沸冷冷却却后后形形成成网网格格样样结结构构，电电泳泳中中起起分分子子筛筛作作用用。通通常常情情况况下下，分分子子量量大大的的DNA电电泳泳过过程程中中由由于于受受到到的的阻阻力力较较大大，泳泳动动速速率率较较慢慢，反反之之，分分子子量较小的量较小的

32、DNA片段跑在前面。片段跑在前面。二、二、常用试剂常用试剂上样液成份：上样液成份：10.25%溴酚蓝或溴酚蓝或/和和0.25%二甲苯青（样品指示剂）二甲苯青（样品指示剂）240%蔗糖蔗糖 或或 30%甘油（增加样品比重），利于加样。甘油（增加样品比重），利于加样。电泳缓冲液：电泳缓冲液：TAE 为例为例 T:Tris碱碱 A:冰醋酸冰醋酸 E:EDTA 提供有一定缓冲能力的提供有一定缓冲能力的pH值值(8.0),EDTA可抑制可抑制DNase 的作用。的作用。溴化乙锭（溴化乙锭（EB）：）：染色剂染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或或RNA

33、的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。致癌剂致癌剂致癌剂致癌剂重点强调溴乙锭的危害！重点强调溴乙锭的危害！1%1%琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳。在样品中加在样品中加在样品中加在样品中加 2 23ul 63ul 6上样液，混匀，上样液，混匀，上样液，混匀，上样液，混匀，加入上样孔内加入上样孔内加入上样孔内加入上样孔内 电泳条件：电泳条件：电泳条件：电泳条件：100 100110110伏，伏，伏，伏，30-30-4040分钟。分钟。分钟。分钟。电泳结束后照像保存，结果分析。电泳结束后照像保存，结果分析。电泳结束后照

34、像保存，结果分析。电泳结束后照像保存，结果分析。上样时老师先加，上样时老师先加，再委派技术好的学生帮老师加。再委派技术好的学生帮老师加。各组按顺序上样，老师在一旁指导上样。各组按顺序上样，老师在一旁指导上样。三、三、操作操作 80分钟。（分钟。（2:203:40)线性线性DNA片断大小（片断大小（kb）琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%）凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？四、四、琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度五、五、电泳仪的使用方法电泳仪的使用方法稳压稳压:电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。如箭头所示。如箭头所示。用

35、内切酶酶切基因组，电泳结果可出现用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现连续的、弥漫云雾状带，称连续的、弥漫云雾状带，称连续的、弥漫云雾状带，称连续的、弥漫云雾状带，称 Smear Smear 带。带。带。带。识别识别识别识别 6bp6bp序列的内切酶，平均每序列的内切酶，平均每序列的内切酶，平均每序列的内切酶，平均每4096 4096 bpbp长度出现一次切割概率。长度出现一次切割概率。长度出现一次切割概率。长度出现一次切割概率。如果如果如果如果SmearSmear带密度比较均匀，说明酶切效果比较带密度比较均匀，说明酶切效果比较带

36、密度比较均匀，说明酶切效果比较带密度比较均匀，说明酶切效果比较好，可用于好，可用于好，可用于好，可用于Southern Blot Southern Blot 实验。实验。实验。实验。六、预期结果六、预期结果 1 2 3 4 5Marker总总DNA未酶切的基因组未酶切的基因组未酶切的基因组未酶切的基因组n n思考题：思考题：1.1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么?氯仿氯仿,乙醇乙醇,EDTA,EDTA2.2.DNADNA提取过程中应注意什么？提取过程中应注意什么？由于基因组由于基因组由于基因组由于基因组DNADNADNADNA的链很长，在实验中由于机的链很

37、长，在实验中由于机的链很长，在实验中由于机的链很长，在实验中由于机械剪切力的作用，很难获得完整的械剪切力的作用，很难获得完整的械剪切力的作用，很难获得完整的械剪切力的作用，很难获得完整的DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。常用的蛋白酶常用的蛋白酶常用的蛋白酶常用的蛋白酶K K K K酚抽提法可获得酚抽提法可获得酚抽提法可获得酚抽提法可获得100kb-100kb-100kb-100kb-150kb150kb150kb150kb大小的大小的大小的大小的DNADNADNADNA片断，可满足上述实验用途。片断，可满足上述实验用途。片断，可满足上述实验用途。片断，可满足上述实验用途。基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA一般用于：一般用于：一般用于：一般用于：SouthernSouthernSouthernSouthern杂交、杂交、杂交、杂交、构建构建构建构建DNADNADNADNA文库文库文库文库 或用于或用于或用于或用于PCRPCRPCRPCR反应的模板。反应的模板。反应的模板。反应的模板。n n实验结束后整理实验台实验结束后整理实验台,n n值日生值日值日生值日!总结：提取基因组总结：提取基因组DNA的常见目的的常见目的