基因工程主要技术原理-PCR技术.ppt

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1、基因工程基因工程第三节第三节 PCR技术原理技术原理 PCR PCR（polymerase polymerase chain chain reactionreaction）是是指指那那些些模模拟拟体体内内DNADNA复复制制的的方方式式在在体体外外选选择择性性的的扩扩增增DNADNA某某个个特特殊殊区区域域的的技术技术 是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。返回目录返回第二章基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.1 2.3.1 核酸体外扩增最早的设想核

2、酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.2 2.3.2 聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明p1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理类似于

3、DNA的体内复制。p开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，由于该酶不耐热，因此，每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。p耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。pPCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.3 PCR 2.3.3 PCR 原理原理基本原理基本原理：即DNA合成的基本原理 基本要素基本要素：teplate/primer/DNA p

4、olyteplate/primer/DNA poly TemplateTemplate:ssDNA or dsDNA PrimersPrimers:oligo-nucleotides等 SubstratesSubstrates:dNTP DNA DNA polymerasepolymerase:Taq polymerase使用的是来自高温微生物的DNA polymerase基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理5 amplicon 33 5943772Cycle 1 2分子分子基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理Cycle 2 4 分子分子Cy

5、cle 3 8分子分子基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.4 PCR2.3.4 PCR反应过程反应过程变变性性。将模板DNA置于95的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；退退火火。将反应体系的温度降低至55左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延延伸伸。将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理denature dsDNA ssDNA 92-96annealing

6、 37-72 50-58extension 72 94942min4+722min722min651min变性退火延伸这三个热反应过程的重复称为一个循环一般需使用一对引物新合成的链又可作为模板基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.5 PCR2.3.5 PCR反应体系反应体系缓冲液缓冲液 bufferbuffer（11）50 mM KCl 引物退火 10 mM 1.5 mM MgCl2(0.5-2.5)基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理dNTPdNTP终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0）4种dNTP应平衡，提高忠实性使用时应考虑

7、Mg2+，引物，产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40m引物引物各1m，即1pmol/l OD260 dsDNA 50g/ml（molecular cloning）SsDNA 40g/ml oligo 33g/ml基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理引物引物长度至少长度至少1616bpbp，通常通常20-3020-30bpbpTm=81.5-16.6logJ+0.041(G+C)%-(600/N)Tm=81.5-16.6logJ+0.041(G+C)%-(600/N)N：链长 J：单价离子浓度若N=20 G+C%=55%J+=60mmol/L，则：Tm=8

8、1.5-20.3+22.6-30=53.8简单计算 Tm=Tm=（G+CG+C）4+4+（A+TA+T）22（用于较短引物）还可从internet计算基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理避免二级结构的形成避免二级结构的形成二聚体二聚体 二级结构二级结构G/CG/C和和A/TA/T分布尽管均匀，一般分布尽管均匀，一般G+C%45-55%G+C%45-55%OligoOligo dT/oligodT/oligo dCdC除外除外其它，如其它，如55末端，限制酶位点的长度末端，限制酶位点的长度随机引物随机引物 6 6ntnt 10-12nt 10-12nt基因工程基因工程第

9、二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理 模模 板板gorng102-1051g人类单拷贝基因组DNA3105targets10ngteastDNA31051ngDNA31051ng1kbDNA91061%M13plaque106基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理名称名称主要用途主要用途简并引物扩增法简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居巢居PCR提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合复合PCR同时检测多个突变或病原反向反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA

10、锚定锚定PCR分析具备不同末端的序列增效增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着固着PCR有利于产物的分离2.3.6 PCR2.3.6 PCR的相关技术的相关技术基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理连接介导连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR扩增cDNA末端定量定量PCR定量mRNA或染色体基因原位原位PCR研究表达基因的细胞比例等臆断臆断PCR鉴定细菌或遗传作用通用引物通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型信使扩增表型分型(mapping)同时分析少量细胞的mRNA膜结合膜结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒

11、表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的DNA片段基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理逆转录逆转录PCR(retrotranscription PCR,RT PCR)指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理锚定锚定PCR(anchored PCR)适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行P

12、CR扩增。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理反向反向PCR(inverse PCR,inPCR)适用于扩增已已知知序序列列的的两两端端的未知序列。其具体方法是选择一个在已已知知序序列列中中没没有有，而而在在其其两两侧侧都都存存在在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶酶切切的片段在连接酶的作用下环环化化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板扩增出已知序列两侧的未知序列。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.7 2.3

13、.7 其它体外核酸扩增技术其它体外核酸扩增技术 技术技术应用应用转录依赖的扩增系统(TAS)检测HIV连接酶链反应(LCR检测点突变自主序列复制(3SR)系统研究RNA，临床应用、法医学等链替代扩增(SDA)检测、鉴定基因Q复制酶系统增加探针检测敏感性循环探针反应增加探针检测敏感性基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.3.8 PCR2.3.8 PCR技术的应用技术的应用研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌(螺旋

14、体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾等)；人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本

15、分析；HLA-DQ肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物传染病的诊断等植物学：检测植物病原等基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理 2.3.9 PCR2.3.9 PCR技术未来发展的方向技术未来发展的方向随着PCR技术在更多领域的越来越广泛的应用，还会有更多的新的改进问世。总之，PCR技术技术与每一领域的专门技术结合使用与每一领域的专门技术结合使用是PCR技术未来发展的方向。基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理回答问题回答问题1.什么是什么是PCR，PCR的程序是什么？的程序是什么？2.什么是锚定什么是锚定PCR，反向反向PCR，逆转录逆转录PCR？3.举例说明举例说明PCR的用途的用途4.随机引物随机引物PCR和通用引物和通用引物PCR有什么用途？有什么用途？5.实验分析题：起初，实验分析题：起初，人们怀疑人们怀疑“非典型肺炎非典型肺炎”是是由某种人类已知病毒引起由某种人类已知病毒引起，请设计实验，用，请设计实验，用PCR的方法分析之。的方法分析之。返回目录返回第二章