基因工程涉及的主要技术.ppt

《基因工程涉及的主要技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程涉及的主要技术.ppt（56页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、基因工程涉及的主要技术基因工程涉及的主要技术基因工程涉及的主要技术基因工程涉及的主要技术遗传专业遗传专业遗传专业遗传专业遗传专业遗传专业姓名：张红姓名：张红姓名：张红姓名：张红姓名：张红姓名：张红学号学号学号学号学号学号131017003913101700391310170039131017003913101700391310170039导师：张斌导师：张斌导师：张斌导师：张斌导师：张斌导师：张斌基因工程 基因工程（基因工程（Genetic engineeringGenetic engineering）原称遗）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一

2、种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的操作流程基因工程的操作流程DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化PCR扩增扩增构建基因文库，构建基因文库，从基因文从基因文库中库中“钓钓”取取1 1、目的、目的基因的基因的获取获取2、基因、基因表达载表达载体的构体的构建建3 3、将目、将目的基因的基因导入受导入受体细胞体细胞4 4、目的、目的基因的基因的检测与检测与鉴定鉴定限制酶的切割与连

3、接限制酶的切割与连接农杆菌转化法农杆菌转化法等等分子杂交及分子杂交及DNA测序测序基因工程主要技术DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化凝胶电泳凝胶电泳基因扩增技术基因扩增技术-PCR-PCR反应反应分子杂交分子杂交DNADNA序列测序序列测序12345一、DNA和RNA的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。一般程序一般程序 1、供体的核酸分离、供体的核酸

4、分离 供体细胞培养供体细胞培养 收集收集(菌体菌体)细胞细胞 细胞破碎细胞破碎 分离总分离总DNA 分离细胞器分离细胞器 分离总分离总RNA 分离细胞器分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性特异性RNA 染色体染色体DNA(组建基因组文库组建基因组文库)cDNAcDNA（组建cDNAcDNA文库）DNA提取的几种方法 （1）基因组基因组DNA的提取的提取 CTAB法法 SDS法法 其它其它（2）非基因组非基因组DNA的提取的提取 质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法 线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法

5、基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（）是可溶的，通过有机溶剂抽该复合物在高盐溶液中（）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。酸分离出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在时会形成沉淀析出，

6、因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于低于15。CTAB CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液质粒DNA碱裂解法 碱裂解法由碱裂解法由Birnboim和和Doly设计并于设计并于1979年发年发表，基于染色体表，基于染色体DNA与质粒与质粒DNA变性与复性的差异而变性与复性的差异而达到分离目的。达到分离目的。在在pH高达的碱性条件下，染色体高达的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，

7、的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。离。当以的当以的KAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性至中性时，变性的质粒的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被

8、除去。对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液碱裂解法流程图碱裂解法流程图 蛋白质的去除蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。

9、在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积体积)，氯苯可以与多，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖糖的羟基作用，从而去除多糖。用用PEG8000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNA：在：在500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG8000(含含1.2 M NaCl)，冰浴，冰浴20min。多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它

10、们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合的结合 盐离子的去除：盐离子的去除：70的乙醇洗涤的乙醇洗涤总RNA的提取 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：方法：1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的含量很高的组织（胰脏）中提取组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使特别有效，可使RNase迅速变性，迅速变性，制备的制备的RNA有较高翻

11、译活性。在有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。白质变性是同步进行的。二、凝胶电泳常见的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳的原理凝胶电泳的原理：分离原理分离原理-在在电场的作用下，电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，分子在琼脂糖凝胶中移动时，有有电荷效应电荷效应和和分子筛分子筛效应。效应。检测原理检测原理-溴化乙锭（溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对对DNA样品染色时，加入的样品染色时，加入的EB就插入就插入DNA分子中，荧光强度分子中，荧光强度与与DNA含量成正比。含量成正比。琼脂糖凝胶电

12、泳分辨大小在间的DNA片段；而要分辨较小分子质量的DNA 片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在之间。聚丙酰胺凝胶电泳三、基因扩增技术-PCR-PCR反应1.PCR的发明的发明（1）（2）MullisMullis由此获得由此获得19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。19851985年年CetusCetus公司的科学家公司的科学家K.B.MullisK.B.Mullis发明发明了了PCRPCR，使这一设想变成现实，使这一设想变成现实。19711971年年KhoranaKhorana提出体外人工复制提出体外人工复制DNADNA的的设想设想。当时由于引物和当时由于引物和DNADNA聚合酶及聚

13、合酶及DNADNA测序技术测序技术都没有解决，设想未能实现。都没有解决，设想未能实现。发展过程发展过程：开始使用大肠杆菌开始使用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段，该酶不耐热，每次加热变性片段，该酶不耐热，每次加热变性DNADNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNADNA聚合酶的应用使得自动化聚合酶的应用使得自动化 19861986年年 H.A.Erilish H.A.Erilish从嗜热从嗜热 水生菌分离出耐高温的水生菌分离出耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶，代聚合酶，代替大肠杆菌替大肠杆菌DNADNA聚合

14、酶聚合酶KlenowKlenow片断（片断（37 oC)37 oC)，PCRPCR技术才进入实用阶段。技术才进入实用阶段。19881988年年 R.K.Saiki R.K.Saiki 把把Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶用到用到PCRPCR反应中。使反应中。使 PCR PCR自动循自动循环仪成为可能环仪成为可能。19881988年年 Cetus Cetus公司发明自动热循环仪。公司发明自动热循环仪。模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸双链双链DNA在在受热受热后，配对碱基的氢键断裂，后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为两条链分开成为单链单链。TGCATGCATATCTTG

15、AACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC35533553TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板模板（模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC355TAGAACTTGACGTACGTA3人工合成的单链人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板与所要扩增的模板DNA双链的双链的5端相同端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板模板模板ATCTTGAAC53ACGTACGTA53引物引物引物引物引物（引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则在模板

16、上延聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸伸DNA链。链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC355TAGAACTTGACGTACGTA3模板模板模板模板ATCTTGAAC5ACGTACGTA5TaqTaq72oC理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA。变性变性复性复性延伸。延伸。（4）1个循环的结果个循环的结果（5）新一轮循环开始 总体积总体积 50-100 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Primer 引物（引物（0.1-0.5 mol/L）DNA分子分子 模板模板（50-100ng）Taq酶酶 DNA聚合酶（聚合酶

17、（0.5-2.5 U/50 L）4.4.反应体系：反应体系：5.PCR的应用理论上只要一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！（1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增；从基因组中扩增；从载体上扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；组织样本原位扩增；微量残留微量残留DNA扩增；扩增；分析模板序列；分析模板序列；在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。插入、替换等）。（2）基因的体外诱变 技术关键：技术关键：利用引物的利用引物的5端序列不要求与模板严格配端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序

18、列。对，设计引物时引入突变序列。五、分子杂交概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。可用于从基因文库中钓取目的基因等。目前常使用的主要有Sourthern杂交、Northern杂交、Western杂交和原位杂交等。核酸分子杂交核酸分子杂交技术（DNA/DNA or DNA/RNA），是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。DNA-DNA

19、杂交双链分子杂交双链分子 同源或部分同源探针 总cDNA探针 特异性cDNA探针 人工合成的寡核甘酸探针探针标记u放射性标记 32P，3H，35S，14C，125I 等u 非放射性标记 地高辛，生物素，荧光素等 用于标记dUTP（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝胶凝胶转移杂交技术转移杂交技术 如图如图:基因组基因组DNA经限制性内切酶消化后，经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有将含有DNA片断的

20、凝片断的凝胶放入变性溶液变性后，胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜将硝酸纤维膜(NC)膜膜放在胶上，上面放吸水放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使纸巾，利用毛吸作用使胶胶DNA转移质转移质NC膜上，膜上，然后利用杂交技术检测然后利用杂交技术检测NC膜上的膜上的DNA片断。片断。1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）但但它它不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特不需要限制

21、性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。异性分析和定量分析。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。原位杂交：是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。如菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；五、DNA测序技术 一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert化学分析法 双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技

22、术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。Frederick Sanger,1980年Nobel Prize化学奖一、Sanger双脱氧链终止法DNA测序的自动化 用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来二、二、Maxam-Gilbert化学分析法化学分析法1977年，哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明。用化学试剂处理末端放射性标记的D

23、NA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。Walter Gilbert,1980年Nobel Prize化学奖 常规的基因工程技术的研究方法：除了凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA 测序技术，还涉及细胞转化、文库构建、酵母双杂交技术等。噢噢噢！与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端序列端序列互补（互补（5端相同）端相同）的短的短DNA。引物（primer)位置位置33 1011 bp的基因组中有一次完全与的基因组中

24、有一次完全与19个个核苷酸的序列相同的机会（或机会是核苷酸的序列相同的机会（或机会是约约210-11）。）。引物的长度理论计算：理论计算：419 1011。一般引物设计为长一般引物设计为长1530bp。引物的碱基序列5端根据需要可设计成某个端根据需要可设计成某个内切酶的切内切酶的切点点顺序、突变位点或生物素标记等，方顺序、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。便与以后操作。5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT33GCTAGCTACTTAAG53端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，5端可以不配对。端可以不配对。templateprimer3）避免形成引物二聚体（dim

25、er）两个引物之间不能有两个以上的连续两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。碱基序列互补。5GGTCTGCCAGTCTAC33CAGGACTTAGTCACT5primer1primer2尽可能提高尽可能提高G+C含量含量，以提高引物与模，以提高引物与模板的结合力板的结合力引物的碱基组成避免避免连续相同碱基连续相同碱基排列或内部排列或内部回文序列回文序列.5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3CTGCCAGTCTAC3GACGG5T发卡结构发卡结构1）2）引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（当引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%时，时，复性温度低于复性温度低于

26、55 oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择实际复性温度选择低于低于Tm值值5 5oC。手工计算：手工计算：一般估计：一般估计：Tm是指半数双链DNA分子解链时的温度 Tm是指半数双链DNA分子解链时的温度 Tm是指半数双链DNA分子解链时的温度 引物的浓度引物的浓度 mol/L。简并引物简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密，就必须考虑密码的简并性。码的简并性。需要合成多种序列的

27、引物，彼此间只有需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。称简并引物。但不能有但不能有蛋白质变性剂蛋白质变性剂、DNA酶酶、Mg2+的的螯合剂螯合剂等影响等影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。模板（template)模板的量：模板的量：不能太多不能太多，100 l反应体系中反应体系中20ng足够。足够。纯度：纯度：PCR对模板对模板DNA的纯度要求不高。的纯度要求不高。dNTPs 是是 dATP、dTTP、dCTP和和dGTP的总称。的总称。dNTPs 一般反应体系中一般反应体系中dNTP混合液终浓度混合液终浓度用用0.2mmol/L。浓度过高会抑制浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活聚合酶的活性并增加错配率。性并增加错配率。