定量分析方法与验证.ppt

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1、第四章第四章 药物定量分析与药物定量分析与 分析方法验证分析方法验证第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法第二节第二节 定量分析方法特点（自学）定量分析方法特点（自学）第三节第三节 药品分析方法的验证药品分析方法的验证第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法一、含卤素有机药物的分析一、含卤素有机药物的分析一、概一、概 述述 含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或芳环或脂肪链相连者，

2、而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。氢卤酸盐。结构特点：结构特点：CX（一）含卤素有机药物（一）含卤素有机药物卤素与脂肪链的卤素与脂肪链的C原子相连者，卤素与原子相连者，卤素与C原子结合不原子结合不牢固，可直接测定或水解后测定。牢固，可直接测定或水解后测定。氮芥氮芥 氟烷氟烷 1 1 卤素与脂肪链碳原子相连卤素与脂肪链碳原子相连碘番酸碘番酸 泛影酸泛影酸 卤素与芳环相连的药物，卤素与碳原子结合牢卤素与芳环相连的药物，卤素与碳原子结合牢固，不能直接进行测定，需经处理后才能测定。固，不能直接进行测定，需经处理后才能测定。2 2 卤素与芳环碳原子相连卤素与芳环碳原子相连碘苯酯碘苯酯I诺氟沙星诺氟

3、沙星磺溴酞钠磺溴酞钠（二）含金属的有机药物（二）含金属的有机药物1.含金属有机药物含金属有机药物2.有机金属药物有机金属药物:金属原子直接和碳原子以共价键相连，结合牢固，溶液金属原子直接和碳原子以共价键相连，结合牢固，溶液中一般不能解离成离子状态，需经有机破坏后分析。中一般不能解离成离子状态，需经有机破坏后分析。金属原子不直接和碳原子相连，以金属的有机酸及酚的盐金属原子不直接和碳原子相连，以金属的有机酸及酚的盐或配位化合物的形式存在或配位化合物的形式存在.如酒石酸锑钾、富马酸亚铁、葡萄糖如酒石酸锑钾、富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠等。酸锑钠等。富马酸亚铁富马酸亚铁 硫柳汞硫柳汞 卡巴胂卡巴胂二二 不

4、经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法直接测定法直接测定法经还原分解后测定法经还原分解后测定法经水解后测定法经水解后测定法(一一)直接测定法直接测定法 Fe2+Ce4+Fe3+Ce3+如：葡萄糖酸锑钠的含量测定如：葡萄糖酸锑钠的含量测定 碘量法碘量法Sb5+I-Sb3+I2Na2S2O3滴定滴定适用于金属原子不直接与碳原子相连的或适用于金属原子不直接与碳原子相连的或CMCM键结合不键结合不牢固的有机金属药物。（牢固的有机金属药物。（包括配位滴定、氧化还原滴定包括配位滴定、氧化还原滴定）如：富马酸亚铁的含量测定如：富马酸亚铁的含量测定 ChP(2005)ChP(2005)铈量法铈量法邻二氮菲

5、做指示剂，微过量的硫酸铈将红色亚铁配合物氧化成浅蓝色高价铁。邻二氮菲做指示剂，微过量的硫酸铈将红色亚铁配合物氧化成浅蓝色高价铁。(二二)经水解后测定法经水解后测定法 1、碱水解后测定法、碱水解后测定法 适于卤素和碳原子结合不牢固的适于卤素和碳原子结合不牢固的含卤素有机含卤素有机含卤素有机含卤素有机药物药物回流回流回流回流Volhard法法银量法银量法根据终点指示方法可分为：根据终点指示方法可分为：1 莫尔法（莫尔法（Mohr法，铬酸钾指示剂法）法，铬酸钾指示剂法）2 佛尔哈德法（佛尔哈德法（Volhard法，硫酸铁铵指示剂法）法，硫酸铁铵指示剂法）3 法扬氏法（法扬氏法（Fajans法，吸附指

6、示剂法）法，吸附指示剂法）方方 法法指示剂指示剂滴定液滴定液被滴定物被滴定物终点变化终点变化莫尔法莫尔法K2Cr2O7AgNO3卤化物卤化物砖红色砖红色原理原理佛尔哈德法佛尔哈德法 硫酸铁铵硫酸铁铵NH4SCN(KSCN)Ag+红色红色法扬氏法法扬氏法吸附指示剂吸附指示剂AgNO3卤化物卤化物指示剂变色指示剂变色例：十一烯酸锌的测定例：十一烯酸锌的测定2、酸水解后测定法、酸水解后测定法十一烯酸锌十一烯酸锌稀盐酸稀盐酸十一烯酸十一烯酸氧化锌氧化锌EDTA-Na滴定滴定(三三)经还原分解后测定法经还原分解后测定法 适用于碘原子与苯环直接相连的含卤素有机药物。适用于碘原子与苯环直接相连的含卤素有机药

7、物。NaOHZn+3Na2ZnO2+3H2O+3NaI+2CH3COONaNaI的测定的测定CHPUSP（KIO3滴定法）滴定法）AgNO3滴定滴定冰冰HAC,曙红钠指示剂曙红钠指示剂（Fajans法）法）泛影酸泛影酸三三 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法(一一)湿法破坏湿法破坏 主要适用于含氮有机药物、生物制品分析中主要适用于含氮有机药物、生物制品分析中N、P等测等测定的前处理定的前处理u H2SO4-HNO3u H2SO4-HClO4u H2SO4-K2SO4u HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂凯氏定氮法凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结测定含有氨基和酰胺结构的药物结构构的

8、药物结构原原 理理 将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被中有机结构被“消化消化”成成COCO2 2和和H H2 2O O，有机结合的氮转，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。n 常量法常量法含氮量含氮量 2530mgn 半微量法半微量法含氮量含氮量 凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏烧瓶K2SO

9、4(提高消解温度提高消解温度)CuSO4(加快消解速度加快消解速度)硫酸硫酸碱液碱液硼酸硼酸(吸收液吸收液)甲基红甲基红-溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正1.高温炽灼法高温炽灼法用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。(二二)干法破坏干法破坏氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当的吸收液中，然

10、后根据待测物质的性质，采用适宜的的吸收液中，然后根据待测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。分析方法进行鉴别、检查或含量测定。2 2 氧瓶燃烧后测定法氧瓶燃烧后测定法（Oxygen flask combustion method）(1)(1)原理原理适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析(3)(3)特点：特点：本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析量样品的分析(2)(2)适用范围：适用范围：(4)装置装置燃烧瓶燃烧瓶：为：为500500、10001000或或2000ml2

11、000ml无无 色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶瓶塞瓶塞：空心，底部熔封铂丝一根：空心，底部熔封铂丝一根铂丝铂丝：下端呈螺旋状或网状。：下端呈螺旋状或网状。固体样品固体样品 ：无灰滤纸无灰滤纸 液体样品液体样品 ：纸袋纸袋 软膏类样品：蜡油纸中包裹后再用无灰滤纸包裹软膏类样品：蜡油纸中包裹后再用无灰滤纸包裹(5)(5)操作方法操作方法 样品的准备样品的准备 取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。定于铂丝下端的网内或螺旋处。燃烧前燃烧瓶的准备燃烧前燃烧瓶的准备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸

12、收液，小心急用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，小心急速地通入氧气速地通入氧气1min1min，立即用表面皿覆盖瓶口。，立即用表面皿覆盖瓶口。样品的燃烧样品的燃烧 点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min15min，用，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，同法另做空白试验。水少量冲洗瓶塞及铂丝，同法另做空白试验。(6)吸收液吸收液作用：将样品经

13、燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒作用：将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。例例 碘苯酯的含量测定碘苯酯的含量测定 ChP ChP 置换碘量法置换碘量法2 碘苯酯碘苯酯OI2NaIO+NaI1/3NaIO3+2/3NaI5/3NaI自身氧自身氧 化还原化还原溴醋酸溴醋酸5/3NaIO32NaIO32HIO3+10KI+12H+6 I2+6 I2+12Na2S2O312NaI+6Na2S4O6Br2（过量（过量)+HCOOH HBr（过量）（过量）+CO2 NaOH第三节第三节 药品分析

14、方法的验证药品分析方法的验证 目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。和修订说明中。用途：1、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。药品质量标准起草时，分析方法需经验证。2、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。析方法进行修订时，分析方法需经验证。验证内容 v 准确度准确度v 精密度精密度v 专属性专属性v 检测限检测限v 定量限定量限v 线性与范围线性与范围v 耐用性耐用性一

15、一 、准确度、准确度(Accuracy)1 1、定义：、定义：指测得结果与真实值接近的程度。通常采用回收指测得结果与真实值接近的程度。通常采用回收率试验来表示。率试验来表示。2 2、方法：、方法：v回回收收试试验验法法（原原料料药药）：空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M v 制剂可采用制剂可采用空白辅料中加入原料药对照品法空白辅料中加入原料药对照品法。还。还应作单独辅料的空白测定。应作单独辅料的空白测定。v加样回收试验（中药）加样回收试验（中药）已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为MUV、HPLC 回收率要求在回收率要求在98102%范围范

16、围容量分析法容量分析法 回收率要求在回收率要求在100.3%范围范围中药分析中药分析 回收率一般要求在回收率一般要求在95105%范围内，有些方范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内。范围内。RSD一般在一般在3%以内。以内。数据要求数据要求 规定的范围内，至少用规定的范围内，至少用9次测定结果评价，次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。如制备三个不同浓度样品各测三次。（二）精密度（二）精密度(Precision)定义定义：系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的

17、程度。常用多次取样测定所得结果之接近的程度。常用 标准差标准差（SD）或相对标准差（）或相对标准差（RSD）表示。）表示。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。的精密度。在规定的范围内，至少用在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，各测三次。制备三个不同浓度样品，各测三次。或把被测物浓度当作或把被测物浓度当作100%，至少测，至少测6次计算次计算RSD进行评价。进行评价。1.1.重复性重复性 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。设备

18、所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。期、不同分析人员、不同设备。2.2.中间精密度中间精密度 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。试验。3.3.重现性重现性 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专

19、属的测定反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。度量。（三）专属性（三）专属性（specificity）氧氟沙星乳膏的含量测定图谱氧氟沙星乳膏的含量测定图谱乳膏基质乳膏基质样品样品（四）检测限（四）检测限(limit of detection，LOD)1 1、定义：、定义：系指试样中被测物能被检测出的最低量。无需系指试样中被测物能被检测出的最低量。无需定量测定。常用定量测定。常用%、ppm、ppb表示。表示。它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表

20、明样品经处理后空白也表明样品经处理后空白(本底本底)值的高低。值的高低。2 2、方法：、方法：v信噪比法（仪器分析方法）信噪比法（仪器分析方法）：HPLC、GC：用已知浓度样品与空白试验对照，记录测得：用已知浓度样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度的被测药物信号强度S与噪音与噪音(或背景信号或背景信号)强度强度N，以能以能达到达到SN2或或SN3时的样品最低药浓为时的样品最低药浓为LOD；UV或荧光分析：多次空白试验，求得其背景响应的标准差，或荧光分析：多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差将三倍空白标准差(即即3空或空或3S空空)作为检测限的估计作为检测限的估计v目

21、视法（非仪器分析方法）目视法（非仪器分析方法）：通过已知浓度的样：通过已知浓度的样品，目视确定能被可靠地检测出的最低量作为检品，目视确定能被可靠地检测出的最低量作为检测限。测限。（五）定量限（五）定量限(limit of quantitation，LOQ)1 1、定义：、定义：指在具有一定准确度和精密度的前提下，样品中指在具有一定准确度和精密度的前提下，样品中被测物能被定量测定的最低浓度或量。被测物能被定量测定的最低浓度或量。常用%、ppm、ppb表示l 杂质和降解产物定量测定时需确定定量限。杂质和降解产物定量测定时需确定定量限。定量限与检测限的差别：定量限要定量测定某一药定量限与检测限的差别

22、：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。2 2、方法：、方法：v非仪器分析方法非仪器分析方法：与检测限的确定方法相同；：与检测限的确定方法相同；v仪器分析方法仪器分析方法：S/N=10时相应的浓度，作为时相应的浓度，作为定量限的估计值。定量限的估计值。（六）线性与范围（六）线性与范围(linearity and range)1 1、定义：、定义：v线性：线性：在设计的范围内，测试结果与试样中被测在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正

23、比关系的程度。物浓度直接呈正比关系的程度。v线性范围线性范围：指达到一定精密度、准确度和线性的：指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。可用可用mgL mgL、gml ugml等表示。等表示。2 2、方法：、方法：线性与范围的确定可用作图法线性与范围的确定可用作图法(响应值响应值Y浓浓度度X)或计算回归方程或计算回归方程(Ya+bX)来研究建立。来研究建立。采用相关系数采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度。表示标准曲线的线性度。对照品的对照品的LOQ必须包括在线性范围。必须包括在线性范围。（七）耐用性（七）耐用性

24、(robustness)(robustness)定义：定义：指在测定条件有小的变动时，测定结果不指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。受影响的承受程度。变动因素：溶液稳定性、不同的测试耗用时间、变动因素：溶液稳定性、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期、流动相的不同的分析温度、不同的测定日期、流动相的组成和组成和pH，商品柱的品牌，柱温等。，商品柱的品牌，柱温等。已有重现性验证，不需验证中间精密度已有重现性验证，不需验证中间精密度如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充视具体情况予以验证视具体情况予以验证准确度 精密

25、度 重复性中间精密度专属性 检测限 定量限线性/范围耐用性鉴别杂质定量杂质限度含量测定溶出量测定检验项目和验证内容检验项目和验证内容各种含量测定方法对效能指标的要求各种含量测定方法对效能指标的要求 1.1.容量分析法：容量分析法：用原料药精制品用原料药精制品(含量含量)或对照或对照品考察方法的精密度，品考察方法的精密度，RSD ；回收率一般在回收率一般在之间之间。2.2.UV法：法：用适当用适当浓浓度的精制品度的精制品进进行行测测定，其定，其RSD一般不大于一般不大于1。制。制剂剂的的测定测定，回收率一般，回收率一般应应在在98102之之间间。线性：线性：吸收度吸收度A一般在，一般在，浓浓度点

26、度点n5。用。用浓浓度度c对对A作作线线性回性回归处归处理，得一直理，得一直线线方程，方程，r应应大于大于0.9999(n5)，方程的截距，方程的截距应应近于零。近于零。3.3.HPLC法：法：要求要求RSD2，回收率回收率98102之间。之间。线性范围：浓度点线性范围：浓度点n应为应为57，回归处理回归处理 浓度浓度c 峰高峰高H或峰面积或峰面积A或被测物与内或被测物与内标的响应值之比进行回归，建立方程，标的响应值之比进行回归，建立方程，r应大于，截距应大于，截距应趋于零。应趋于零。思思 考考 题题1、在原料药的分析方法验证中，是否所有指标均需进、在原料药的分析方法验证中，是否所有指标均需进

27、行验证？行验证？2、怎样设计回收率试验？、怎样设计回收率试验？体内药物分析体内药物分析：是一门研究进入人或动物体内，存在于生物样：是一门研究进入人或动物体内，存在于生物样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的药物及其代谢物和品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。一一 概概 述述(一一一一)体内药物分析的概念体内药物分析的概念体内药物分析的概念体内药物分析的概念第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求（二）体内药物分析的意义（二）体内药物分析的意义 通过体内药物分析结果可求得

28、药物动力学参数，可了解药通过体内药物分析结果可求得药物动力学参数，可了解药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。因此，体内药物分物在体内的吸收、分布、代谢、排泄情况。因此，体内药物分析为药物研究、制剂质量管理、临床用药等提供了数据和信息。析为药物研究、制剂质量管理、临床用药等提供了数据和信息。另外，在用药过量、误服或服毒等中毒事件中，为解毒急另外，在用药过量、误服或服毒等中毒事件中，为解毒急救或判断案情，也需要进行体内药物分析；还有对一些兴奋剂、救或判断案情，也需要进行体内药物分析；还有对一些兴奋剂、致幻剂、镇静剂等药物滥用现象也需要进行体内药物进行检测。致幻剂、镇静剂等药物滥用现象也需要进行

29、体内药物进行检测。（三）体内药物分析的特点（三）体内药物分析的特点1 1干扰物质多干扰物质多：生物样品中含有大量的内源性物质，如蛋：生物样品中含有大量的内源性物质，如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等，样品一般均需经白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等，样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。过分离、净化后才能进行分析。2 2样品量少、不能重复取样样品量少、不能重复取样：生物样品多数在特定条件下：生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且样品量少。采集，无法再次取样，且样品量少。3被测成分浓度低被测成分浓度低：对分析方法的灵敏度及专属性要求较：对分析方法的灵敏度及专属性要求较高。在测定前

30、需浓缩、富集以适应分析方法要求。高。在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求。4药物浓度监测和药物滥用药物浓度监测和药物滥用：要求分析方法简便、快速：要求分析方法简便、快速二二 常用样品的种类、采集和贮存常用样品的种类、采集和贮存（一）样品及采集（一）样品及采集1 1、血样、血样：血浆血浆(plasma)：全血加肝素、枸橼酸全血加肝素、枸橼酸盐盐、草酸盐等抗凝剂、草酸盐等抗凝剂后经离心分取，量约为全血的一半。后经离心分取，量约为全血的一半。血清血清(serum)：血液室温放置后，自然凝固析出的清液。血液室温放置后，自然凝固析出的清液。全血全血采取：采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血一般是静

31、脉取血、针刺手指、耳垂取血 动物实验可直接从动脉或心脏采取动物实验可直接从动脉或心脏采取2 2、唾液、唾液：优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。缺点：药物浓度变化大缺点：药物浓度变化大采取：漱口采取：漱口1515分钟，收集自然流出或经舌在口内分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激搅动流出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。使唾液流出。3 3、尿液、尿液：尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。除率和生物利用度等

32、研究，以及测定代谢物类型等。优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。样。采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。（二）样品贮存（二）样品贮存 取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷藏则短期内冷藏(4)，长期冰冻，长期冰冻(-20)。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。尿液是很好的细菌生长液，若需收集尿液是很好的细菌生长液，若需收集24

33、小时或小时或更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）保存。甲苯、过饱和氯仿）保存。三三 生物样品的前处理生物样品的前处理（一）药物在体内的存在形式（一）药物在体内的存在形式游离型：原形药物游离型：原形药物或或代谢物代谢物缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合结合物：药物与蛋白质结合结合物：药物与蛋白质结合（二）样品前处理的目的（二）样品前处理的目的1 1 1 1、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性、提高测定方法灵敏度、准确度

34、和专属性、提高测定方法灵敏度、准确度和专属性2 2 2 2、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质等的污染。、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质等的污染。、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质等的污染。、保护测定仪器不受生物样品中类脂和蛋白质等的污染。（三）生物样品前处理方法（三）生物样品前处理方法分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集化学衍生化化学衍生化去除蛋白质去除蛋白质缀合物的水解缀合物的水解有机破坏有机破坏1 1、去除蛋白质、去除蛋白质加入与水混融的有机溶剂加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐加入中性盐

35、(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂加入金属沉淀剂(CuSO(CuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4、ZnSOZnSO4 4-NaOH)-NaOH)酶解法酶解法(枯草菌溶素枯草菌溶素)2 2、缀合物的水解、缀合物的水解尿液中药物多数呈缀合物状态。尿液中药物多数呈缀合物状态。（1 1）酸水解：适量盐酸）酸水解：适量盐酸（2 2）酶水解：常用葡糖酸苷酶或硫酸酯酶或两者）酶水解：常用葡糖酸苷酶或硫酸酯酶或两者混合。混合。3 3、有机破坏、有机破坏适于生物样品中金属离子的测定。适于生物样品

36、中金属离子的测定。硝酸硝酸-高氯酸消化高氯酸消化)目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分方法：方法：（1 1）液）液-液萃取（液萃取（LLELLE）：多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来，多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来，而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。4 4、分离、纯化与浓集、分离、纯化与浓集 液液-液萃取中需注意的问题：液萃取中需注意的问题：适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿等。适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿等。适当的水相适当的水相pH值：由药物的值：由药物的pKa值确定，一般碱性药物

37、值确定，一般碱性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下萃取。在碱性条件、酸性药物在酸性条件下萃取。碱性药物最佳碱性药物最佳pH 高于高于pKa值值1-2个个pH单位单位酸性药物最佳酸性药物最佳pH 低于低于pKa值值1-2个个pH单位单位中性药物：中性药物：pH=7 附近附近 离子型药物：离子对萃取离子型药物：离子对萃取 提取技术：提取次数尽可能少，不要求提取完全，而要提取技术：提取次数尽可能少，不要求提取完全，而要求适量而稳定的提取率。求适量而稳定的提取率。（2 2）液）液-固萃取（固萃取（LSELSE）：将生物样品溶液通过填有适宜担将生物样品溶液通过填有适宜担体的小柱，使药物保留在担体上，洗

38、体的小柱，使药物保留在担体上，洗去杂质后，用适当的溶剂洗脱下来测去杂质后，用适当的溶剂洗脱下来测定；或杂质保留在担体上，先把药物定；或杂质保留在担体上，先把药物洗脱下来测定。洗脱下来测定。担担体体亲水性：硅藻土亲水性：硅藻土疏水性：活性炭、聚苯乙烯或疏水性：活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶化学键合硅胶常用微型柱：常用微型柱：Bound Elut 、Sep-pak 用有机溶剂用有机溶剂(甲醇甲醇)冲洗冲洗洗净洗净用水冲洗用水冲洗活化活化上样上样用水或缓冲液冲洗，洗去用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质内源性物质有机溶剂洗脱药物有机溶剂洗脱药物收集洗脱液收集洗脱液微型柱液微型柱液-固萃取步骤固萃取

39、步骤（3 3）被测组分的浓集）被测组分的浓集浓集方法：浓集方法：浓集方法：浓集方法：1 1、末次提取时，加入溶剂尽可能少、末次提取时，加入溶剂尽可能少2 2、挥去溶剂：、挥去溶剂：（1 1）通入气流（氮气）吹干）通入气流（氮气）吹干（2 2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物5 5、化学衍生化、化学衍生化GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物极性极性小、稳定性好的衍生物小、稳定性好的衍生物HPLC中，分子结构无紫外吸收中，分子结构无紫外吸收具具紫外吸收或荧光紫外吸收或荧光的衍生物的衍生物GC中化学衍生化中化学

40、衍生化：RCOOH、ROH、RSH、RNH2CH3I、CH3N2等等RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3例：烷基化例：烷基化极性降低，挥发性增加极性降低，挥发性增加烷基化（烷基化（碘庚烷、叠氮甲烷）碘庚烷、叠氮甲烷）酰化（乙酸酐、丙酸酐）酰化（乙酸酐、丙酸酐）硅烷化（三甲基氯硅烷硅烷化（三甲基氯硅烷TMCS等）。等）。HPLC中化学衍生化中化学衍生化常用衍生化试剂有：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。常用衍生化试剂有：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。化学衍生化化学衍生化柱后衍生化柱后衍生化柱前衍生化柱前衍生化四、定量分析方法的验证四、定量分析方法的验证(一一)特异性特异性 所测的物质是原型药

41、物或特定的活性代谢物，内源性物质和所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白血浆空白血浆空白血浆标准物质空白血浆标准物质受试血浆受试血浆(二二)标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围19.225.6 3230茶碱茶碱(g/ml)Y10-2X+6.15310-3 ru至少至少6 6个浓度点建立标准曲个浓度点建立标准曲线线u线性范围必须覆盖全部待测线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推浓度，不得外推u最低浓度点偏差在最低浓度点偏差在20%u其余浓度点的偏差在其余浓度点的偏差在 15%。isHH(三三

42、)精密度与准确度精密度与准确度(四四)定量下限定量下限(五五)稳定性稳定性(六六)提取回收率提取回收率(七七)质控样品质控样品(八八)质量控制质量控制(九九)测定结果测定结果五五 体内药物分析方法建立的一般实验步骤体内药物分析方法建立的一般实验步骤1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，考虑分离度。考虑分离度。3、空白样品加对照品测定：求得样品回收率，检、空白样品加对照品测定：求得样品回收率，检验样品中是否有干扰。验样品中是否有干扰。4、体内实际样品测定、体内实际样品测定