微生物的遗传变异和育种待定.ppt

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1、第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种第四节第四节 基因工程基因工程第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种几个概念n遗传遗传(heredity)n变异变异(variation)n遗传型遗传型(genotype)n表型表型(phenotype)n饰变饰变(modification)第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础 三个经典实验三个经典实验 转化实验转化实验噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验病毒

2、的拆开和重建实验病毒的拆开和重建实验（一）转化实验（一）转化实验n实验材料：实验材料：Streptococcus pneumoniaenStreptococcus pneumoniae 的的几种形态几种形态nS型和型和R型型转化实验转化实验从活的从活的S菌中抽提各种细胞成分（菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，蛋白质，荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验（二）噬菌体感染实验 实验材料：实验材料：噬菌体噬菌体（三）病毒的拆开和重建实验(TMVTMV和和HRV)HRV)结论n核酸是负载遗传信息的真正物质基础核酸是负载遗传信息的真正物质基础二、遗传物质在细胞中的

3、存在方式(一一)细胞水平细胞水平(二二)细胞核水平细胞核水平(三三)染色体水平染色体水平(四四)核酸水平核酸水平(五五)基因水平基因水平(六六)密码子水平密码子水平(七七)核苷酸水平核苷酸水平 核酸的七个水平遗传物质遗传物质类型类型核基因组核基因组真核生物的真核生物的原核生物的原核生物的核外染色体核外染色体真核生物的真核生物的原核生物的原核生物的细胞质基因细胞质基因线粒体线粒体叶绿体等叶绿体等共生生物共生生物2um质粒等质粒等F因子因子(F质粒质粒)R因子因子(R质粒质粒)Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒等降解性质粒等有核膜包裹的真核有核膜包裹的真核(DNA+组蛋白组蛋白)

4、无核膜包裹的核区无核膜包裹的核区(环状双链环状双链DNA)(二二)细胞核水平细胞核水平原核生物的质粒原核生物的质粒1.质粒的定义质粒的定义指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即分子，即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。2.2.特点特点n超螺旋结构；超螺旋结构；n携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能

5、的基因；n某些质粒可与核染色体发生整合或脱离某些质粒可与核染色体发生整合或脱离 附加体；附加体；n当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除质粒消除，如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；n具有具有重组的功能重组的功能 质粒与质粒间、质粒与染色体之间；质粒与质粒间、质粒与染色体之间；n有些质粒不表现任何功能有些质粒不表现任何功能 隐蔽性质粒隐蔽性质粒；3.质粒的种类质粒的种类 按其复制与核染色体的复制是否同步按其复制与核染色体的复制是否同步 严紧型质粒严紧型质粒(stringent replicat

6、ion plasmid)松弛型复制控制质粒松弛型复制控制质粒(relaxed replication plasmid)按其功能按其功能 接合性质粒：如接合性质粒：如F质粒质粒 抗药性质粒：如抗药性质粒：如R质粒质粒 产细菌素的质粒：如产细菌素的质粒：如Col质粒质粒 具有生理功能的质粒：如固氮的具有生理功能的质粒：如固氮的mega质粒、降解质粒等质粒、降解质粒等 产毒质粒：如产毒质粒：如Ti质粒质粒 4.4.典型质粒简介典型质粒简介 1 1）F F质粒质粒 (F plasmid)(F plasmid)是是 等细菌决定性别并有转移功能的质粒。等细菌决定性别并有转移功能的质粒。2）R质粒质粒(R

7、plasmid,resistance plasmid)3）Col质粒质粒(col plasmid)大肠杆菌素 是一类由是一类由某些菌株所产生的细菌素，具有通某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由由ColCol质粒编码；质粒编码；4）Ti质粒质粒(tumor inducing plasmid)AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens（根根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受癌土壤杆菌）从一些

8、双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出出Ti质粒，其上的质粒，其上的T-DNA片段与植物片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。它转变成癌细胞。致癌区冠婴碱合成区冠婴碱分解区Ti质粒接合转移区(tra)毒性区(vir)DNA复制区(rep)6个功能区：个功能区：可遗传变异可遗传变异不可遗传变异不可遗传变异-饰变饰变基因突变基因突变染色体畸变染色体畸变生生物物的的变变异异突变突变

9、基因重组基因重组第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变（一、基因突变（gene mutationgene mutation）（一）定义（一）定义核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。的变化。DNADNA、RNARNA的一级结构的一级结构 DNADNA一级结构一级结构53OHOHOH53RNARNA一级结构一级结构DNA的双螺旋结构的形成的双螺旋结构的形成53535353磷酸磷酸核糖核糖碱基碱基T-A碱基对碱基对C-G碱基对碱基对 氢键氢键 碱基堆集力碱基堆集力 磷酸基上负电荷被胞内磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和组蛋白或正

10、离子中和 碱基处于疏水环境中碱基处于疏水环境中DNA的双螺旋结构稳定因素的双螺旋结构稳定因素（二）基因突变的类型（二）基因突变的类型n基因突变的类型有哪些？基因突变的类型有哪些？n哪些突变型是选择性突变株？哪些是非哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？选择性突变株？为什么？n举例说明如何筛选抗性突变株？举例说明如何筛选抗性突变株？突变株的表型突变株的表型选择性突变株选择性突变株非选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型营养缺陷型抗性突变型抗性突变型条件致死突变型条件致死突变型形态突变型形态突变型抗原突变型抗原突变型产量突变型产量突变型细菌的变异现象n形态、结构变异n毒力变异n耐药

11、性变异n菌落变异形态结构变异n3-6%食盐鼠疫耶氏菌多形态性陈旧培基物n青霉素、溶菌酶正常形态细菌L型变异抗体或补体(部分或完全失去胞壁)n特殊结构的变异42-43炭疽杆菌炭疽杆菌失去形成芽胞能力失去形成芽胞能力,毒性降低毒性降低10-20天天变形杆菌变形杆菌0.1%石炭酸石炭酸迁徙生长（迁徙生长（H）点状生长、单个菌落（点状生长、单个菌落（O）鞭毛变异毒力变异棒状噬菌体棒状噬菌体白喉棒状杆菌白喉棒状杆菌获得白喉毒素获得白喉毒素增强增强nn胆汁、甘油、马铃薯培养基胆汁、甘油、马铃薯培养基牛分枝杆菌牛分枝杆菌卡介苗卡介苗减弱减弱n13年年(230代代)耐药性变异n细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药

12、的变异称为耐药性变异。n金黄色葡萄球菌n有些细菌还同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。含链霉素培基痢疾杆菌依链株长期培养菌落变异在陈旧培养基中长期培养光滑型菌落粗糙型菌落SR原因：失去LPS的特异多糖（三）突变率（三）突变率n每一个细胞在每一世代中发生某一性状突每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；变的几率；n自发突变几率自发突变几率n一般在一般在10-610-9范围内；范围内；n突变率为突变率为10-9的含义的含义n抗性突变是最常见的突变类型；抗性突变是最常见的突变类型；n细菌产生抗药性的途径细菌产生抗药性的途径n基因突变基因突变n抗药性质粒的转移抗药性质粒的转移

13、n生理适应生理适应n由基因突变引起的抗药性的原因？由基因突变引起的抗药性的原因？两种观点：两种观点：n突变的性状与引起突变的原因间呈对应性 抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；n突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。1.变量试验（fluctuation test）n实验设计者n美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；n时间：1943年n实验材料：n对T1噬菌体敏感的大肠杆菌n实验目的n验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系n实验过程103/mL24-36hn如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？性结果如何？n

14、如何解释得到的实验结果？如何解释得到的实验结果？n噬菌体的作用？噬菌体的作用？实验结果讨论实验结果讨论突变的发生在时间上是随机的突变的发生在时间上是随机的2.2.涂布试验（涂布试验（Newcombe experimentNewcombe experiment）n实验设计者n1949年纽康布n实验材料n对T1噬菌体敏感的大肠杆菌n采用固体平板培养n实验过程突变率的计算接种时每一平皿的细胞数：接种时每一平皿的细胞数：5104培养培养5h后每一平皿的细胞数：后每一平皿的细胞数：5104 2（5100）=2.6 1086个平皿上共发现个平皿上共发现28个突变菌落个突变菌落突变率突变率=突变的细胞数突变

15、的细胞数/增加的细胞总数增加的细胞总数 =28/6（2.6 108-5104）=1.810=1.810-8-83.3.平板影印试验平板影印试验（replica plating）n实验设计者n1952年，美国的莱德伯格夫妇n实验材料n K12n实验过程Lederberg 的平板培养法的平板培养法（四）突变的特点（四）突变的特点n不对应性不对应性n自发性自发性n稀有性稀有性n独立性独立性n诱变性诱变性n稳定性稳定性n可逆性可逆性(五五)基因突变及其机制基因突变及其机制突变突变诱变诱变自发突变自发突变基因突变基因突变染色体畸变：染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位缺失、添加、易位、倒位碱基置换碱基置换

16、移码突变移码突变 转换转换颠换颠换 缺失缺失 添加添加n诱变剂诱变剂：凡能显著提高突变频率的理化因子；凡能显著提高突变频率的理化因子；n1 1）碱基置换碱基置换n转换（转换（transitiontransition）n嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换n颠换（颠换（transversiontransversion）n嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换1.诱发突变诱发突变直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。如：亚硝酸、羟胺、和

17、各种烷化剂；如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂通过活细胞的代谢活动掺入到通过活细胞的代谢活动掺入到DNADNA分子中后引起的变化。如：分子中后引起的变化。如：碱基类似物；碱基类似物；诱变剂种类诱变剂种类2 2）移码突变）移码突变 DNADNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；诱变剂种类：诱变剂种类：丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、-氨基丫啶等氨基丫啶

18、等）和和ICRICR类化合物；类化合物；3 3）染色体畸变）染色体畸变n某些强烈理化因子，如电离辐射（某些强烈理化因子，如电离辐射（X X射线等）和烷化射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤；分子的大片段损伤；n染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；n染色体数目的变化；染色体数目的变化；染色体的易位 转座转座DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座转座(因因)子子IS IS 插入序列插入序列(insertion sequence)(insertio

19、n sequence)Tn Tn 转座子转座子(transposon)(transposon)Mu Mu 噬菌体噬菌体(mutator phage)(mutator phage)ababab2.自发突变自发突变(spontaneous mutation)1、由背景辐射和环境因素引起；2、由微生物自身有害代谢物引起；3、由DNA复制过程中碱基配对错误引起等。（六）紫外线对DNA的损伤及其修复胞嘧啶水合物胞嘧啶水合物胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶二氢胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体胞嘧啶二聚体1.光复活作用光复活作用PREA-AT=TPREA-AT=TA-AT-TPREUV可见光可

20、见光二聚体解离二聚体解离PRE光激活酶光激活酶(photoreactivatingenzyme)A-AT-T5353A-AT-T5353A-AT=T5353A-AT=T5353OHPA-A5353OHPT=TA-AT-T5353UV酶酶I酶酶II酶酶III酶酶IV 2.暗修复（切除修复）暗修复（切除修复）酶酶I核酸内切酶核酸内切酶酶酶II核酸外切酶核酸外切酶酶酶IIIDNA聚合酶聚合酶酶酶IVDNA连接酶连接酶（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种 从生产中育种从生产中育种 定向培育优良菌株定向培育优良菌株（二）诱变育种（二）诱变育种二、突变与育种二、突变与育种 指指利用物理、化学等诱变剂处

21、理均匀分散的微生物细胞利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。以供科学试验或生产实践使用。诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节诱变育种的原则诱变育种的原则突变株的筛选方法突变株的筛选方法产量突变株的筛选产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选 春日霉素产生菌的孢子悬液 诱变 涂布平板 培养2天（29）培养4-

22、5天(29)生物鉴定板上含供试菌种 培养17-18小时(29）检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度保持合适的温、湿度产产量量突突变变株株的的筛筛选选n抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型菌株n营养缺陷型营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。培养基中才能生长的突变株。n基本培养基（基本培养基（MM，符号为，符号为-）是指仅能满足某微生是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。物的野生型菌株生长所需的最低成分

23、的合成培养基。完全培养基完全培养基(CM，符号为，符号为+)是指可满足某种微生物的是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。基。n补充培养基（补充培养基（SM，符号为，符号为A或或B等）等）是指在基本培是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。株生长需求的合成或半合成培养基。营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选n(1)(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基与筛选营养缺陷型有关的三类培养基n基本培养基(minimal m

24、idium，MM)-n完全培养基(complete medium,CM)+n补充培养基(supplemental medium,SM)An（2 2）与营养缺陷型突变有关的菌体与营养缺陷型突变有关的菌体n野生型(wild type)能在-中生长n营养缺陷型(auxotroph)能在+或A生长n原养型(prototroph)能在-中生长抗生素法抗生素法菌丝过滤法菌丝过滤法青霉素法青霉素法制霉菌素法制霉菌素法原菌株原菌株(出发菌株出发菌株)诱变剂处理诱变剂处理淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿同一培养皿夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法不同培养皿不同

25、培养皿逐个检出法逐个检出法影印接种法影印接种法生长谱法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法夹层培养法夹层培养法夹层培养法夹层培养法先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多然后

26、再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。数都是营养缺陷型突变株。限量补充培养法n限量补充培养法把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法逐个检出法n逐个检出法逐个检出法把经诱变处理的细胞群涂布在把经诱变处理的细胞群涂布在完完全培养基全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个用接种针或灭过菌的

27、牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到整齐地分别接种到基本培养基平板基本培养基平板和另一完全和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。置上却不长，说明此乃营养缺陷型。营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法影印接种法影印接种法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法abc-+影印平板法影印平板法将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培将诱

28、变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具“印章印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株缺陷型突变株。第四步，鉴定缺陷型第四步，鉴定缺陷型n生长谱法生长谱法是指在混有供试菌的平

29、板表面点加微是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求。该供试菌的营养要求。n鉴定营养缺陷型的操作是：把生长在完全培养鉴定营养缺陷型的操作是：把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如配成适当浓度的悬液（如107108个个ml），），取与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，取与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所

30、需的营在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（用滤纸片法也可），例如氨基酸、养物粉末（用滤纸片法也可），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。用类似方法还可是该营养物的缺陷型突变株。用类似方法还可测定双重或多重营养缺陷型。测定双重或多重营养缺陷型。营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法(4)(4)营养缺陷型的筛选举例营养缺陷型的筛选举例枯草杆菌氨基酸缺陷型枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的

31、营养要求的鉴定氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备细胞悬浮液制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养淘汰野生型淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出营养缺陷型菌株的检出（使细胞处于对数生长期）（使细胞处于对数生长期）（UVUV照射照射60s60s）（调整细胞浓度为（调整细胞浓度为10108 8个个/ml/ml）（3030度度CMCM中振荡过夜培养）中振荡过夜培养）（青霉素法）（青霉素法）（生长谱法）（生长谱法）营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法 无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液（107-108/ml）0.1ml.+上生长的营 养缺陷型 培养营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定生长谱法

32、生长谱法n作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；的标记菌种；n作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；定的试验菌种；n用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；的生产菌株；营养缺陷型突变株的应用营养缺陷型突变株的应用 Ames testAmes test测定潜在化学治癌物测定潜在化学治癌物 理论依据理论依据n一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNADNA，所以任何所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。能改

33、变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物化学统一性法则生物化学统一性法则n生物的生物的“三致三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。基本原理基本原理nSalmonella Salmonella typhimuriumtyphimurium 的的his-his-菌株在菌株在-的平的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。试验步骤：试验步骤：n可疑“三致”试样n+n鼠肝匀浆S.t his-吸入滤纸片保温 S.t h

34、is+-阳性 阴性 培养1 1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了在添加了0.1%0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。株的生长必需物。2 2、什么叫做营养缺陷型菌株、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计请设计一个具体实验方案。一个具体实验方案。3 3、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？是受环

35、境诱导产生的？思考题思考题(gene recombination)n基因重组的定义基因重组的定义n两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。n重组和杂交的关系重组和杂交的关系n重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别n杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）转化（一）转化（transformation）n1.定义：定义：n受体菌直接吸收供体菌的受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。分

36、遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。n2.能进行转化的微生物种类能进行转化的微生物种类nStreptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae；Bacillus Bacillus；Rhizobium Rhizobium；PseudomonasPseudomonas；Staphylococcus Staphylococcus；Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae；Neurospora Neurospora crassacrassa；Aspergillus niger Aspergillu

37、s niger等。但肠道菌科的等。但肠道菌科的细菌如等很难进行转化。细菌如等很难进行转化。n3.影响菌株间发生转化的因素影响菌株间发生转化的因素n与它们在进化过程中的亲缘关系有关；与它们在进化过程中的亲缘关系有关；n最易与细胞表面结合的是最易与细胞表面结合的是dsDNA；n发生转化的细胞必须处于发生转化的细胞必须处于感受态感受态;n转化的频率低（转化的频率低（0.1-1%，最高为，最高为20%）;n转化需要的转化需要的DNA浓度极低浓度极低;n4.感受态（感受态（competence）n指受体细胞最易接受外源指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理片段并能实现转化的一种生理状态。

38、状态。n不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同n外界环境因子如环腺苷酸（外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）和）和Ca2+等可提高受体细等可提高受体细胞的感受态水平。胞的感受态水平。n调节感受态的是一类特异蛋白调节感受态的是一类特异蛋白感受态因子感受态因子dsDNA供体（strR）感受态受体（strS）同源区段配对单链整合，形成一小段杂合DNA区段转化子（strR）非转化子（strS）复制与分离5.转化过程转化过程n6.转染转染(transfection)n用提纯的病毒核酸（用提纯的病毒核酸（DNA或或RNA）去感染）去感染其宿主

39、细胞，可增殖出一群正常病毒后代的其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为现象称为转染转染。1.定义定义通过通过完全缺陷完全缺陷或或部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体的媒介，把供的媒介，把供体细胞的小片段体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。现象。获得的重组细胞称为转导子。2.转导的种类转导的种类普遍转导普遍转导局限转导局限转导（二）转导（二）转导(transduction)供体菌受体菌转导噬菌体细菌DNA噬菌体DNAn通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺

40、陷噬菌体对供体菌基因组上任何对供体菌基因组上任何DNA小片段的小片段的“误包误包”，而将其遗传性状传递给受而将其遗传性状传递给受体菌的现象；体菌的现象；n一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；n可分为可分为完全普遍转导完全普遍转导和和流产普遍转导；流产普遍转导；普遍转导普遍转导(generalizedtransduction)完全普遍转导完全普遍转导(generalized transduction)供体受体（2）流产普遍转导）流产普遍转导外源外源DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、片段不与受体细胞核染色体组进行交换、整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和

41、性状表整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释稀释”。n通过通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；转导子的现象；n特点：特点：n只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；n该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；n缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主核染色体过程缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主

42、核染色体过程中，发生低频率（中，发生低频率（-10-5）的误切；）的误切；n需要通过需要通过UV等因素对溶源菌的诱导；等因素对溶源菌的诱导；n分为低频转导和高频转导分为低频转导和高频转导局限转导局限转导(restrictedtransduction)gal dgal1)低频转导（低频转导（LFT）n部分缺陷噬菌体n以大肠杆菌噬菌体为例 gal bio正常切割不正常切割biodbio 其频率为10-410-6 （LFT裂解物）E.coli K12gal-少数少数 稳定的 gal+转导子低低m.o.i.m.o.i.2)高频转导（高频转导（HFT）n双重溶源菌（双重溶源菌（doublelysogen

43、）n同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；n被紫外线等诱导时，正常的被紫外线等诱导时，正常的 噬菌体具有补偿缺陷噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如噬菌体（如 dgal）所缺失的部分基因的功能，使）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；两种噬菌体同时获得复制；n存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；n双重溶源菌产生的裂解物中含有双重溶源菌产生的裂解物中含有等量等量的的 和和 dgal粒子粒子HFT裂解物裂解物低低m.o.i.Ecoli.K12gal-高频地把它转化成高频地把它转化成 稳定的稳

44、定的gal+转导子；转导子；高m.o.i.的LFT裂解物 感染 Ecoli.K12gal-?低频转导和高频转导的异同点低频转导和高频转导的异同点n相同点相同点n只能转导供体菌的个别特定基因只能转导供体菌的个别特定基因n该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带n不同点不同点n低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子感染宿主，只获得极少量的局限转导子n高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染高频转导：产生高频转导裂解物，用其

45、感染宿主，可获得较多的转导子。宿主，可获得较多的转导子。当温和噬菌体感染其当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源宿主而使之发生溶源化时，因化时，因噬菌体基因噬菌体基因整合到宿主基因上，整合到宿主基因上，而使后者获得了除免而使后者获得了除免疫性以外新性状的现疫性以外新性状的现象，称象，称溶源转变溶源转变。溶源转变溶源转变（三）接合（三）接合（conjugation）n供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。干新遗传性状的现象。n能进行结合的微生物种类能进

46、行结合的微生物种类n主要在细菌和放线菌中存在；主要在细菌和放线菌中存在；n研究得最清楚的是研究得最清楚的是；n有性别分化，决定有性别分化，决定性别性别的是一种质粒，即的是一种质粒，即F因因子子是属于是属于附加体附加体的质粒。的质粒。n根据根据F因子因子在细胞内的存在方式，将分为四种类型：在细胞内的存在方式，将分为四种类型：nF+菌株菌株n含有游离的含有游离的F因子，在细胞表面还有性菌毛因子，在细胞表面还有性菌毛nF-菌株菌株n不含不含F因子因子，细胞表面没有性菌毛。，细胞表面没有性菌毛。nHfr（高频重组）菌株（高频重组）菌株nF因子整合在核染色体组特定位点上因子整合在核染色体组特定位点上nF

47、菌株菌株nHfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色因子因不正常切离而脱离核染色体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基因的特殊因的特殊F因子因子初生的初生的F菌株菌株大肠杆菌的四种类型大肠杆菌的四种类型F质粒的质粒的4种存在方式及相互关系种存在方式及相互关系大肠杆菌的接合方式nF+F-F+F+nHfrF-Hfr+F-（多数情况下）nHfrF-Hfr+Hfr（少数情况下）nFF-F+FnF因子转导n以F质粒通过接合来传递供体基因的方式F质粒的接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF+中断实验（四）原生质体融合（四）原生

48、质体融合(protoplastfusion)n通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。融合子。n能进行原生质体融合的细胞极其广泛能进行原生质体融合的细胞极其广泛n原核生物、真核生物、高等动植物、人体原核生物、真核生物、高等动植物、人体原生质体融合的主要步骤：原生质体融合的主要步骤：n1选择亲本n有特殊价值n有选择性遗传标记n2获得原生质体n脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌）n3原生质体融合n促融合

49、剂PEG(聚乙二醇)或电脉冲n4筛选稳定的融合子原生质体融合的主要步骤：各种融合子各种融合子 长成菌落长成菌落影印接种影印接种-检出检出A+B+筛选优良性筛选优良性状的融合子状的融合子筛筛 选选+原生质体融合的特点n1.重组频率高n2.不受亲缘关系的影响n3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种n4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）原生质体融合原生质体融合二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组n基因重组的方式：有性杂交基因重组的方式：有性杂交、准性杂交、原生质体、准性杂交、原生质体融合和遗传转化；融合和遗传转化；n（一）有性杂交（一）有性杂交n指不同遗传型

50、的两性细胞之间发生的接合和随之进行的指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。n举例举例酿酒酵母酿酒酵母n酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱n面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强比较项目比较项目双倍体双倍体单倍体单倍体细胞细胞菌落菌落液体培养液体培养在产孢培养基上在产孢培养基上大，椭圆形大，椭圆形大，形态均一大，形态均一繁殖较快，细胞较分散繁殖较快，细胞较分散会形成子囊会形成子囊小，球形小，球形小，形态变