方法选择与检测系统性能评价.ppt

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1、第三章第三章 方法选择与检测系统方法选择与检测系统性能评价性能评价教材第29页 方法学评价方法学评价 是通过实验途径来测定分析方法的性能指标，并评价其是否可接受。方法学评价的目的方法学评价的目的在于评估该分析方法在稳定状态下具有的误差，并对这些误差做出判断，来决定该分析方法是否可以用于常规测定。方法学评价内容方法学评价内容，通常应包括：精密度、准确度、检测限、生物参考区间和可报告范围等。第一节 实验方法的选择 一、一、实验方法的分级实验方法的分级 IFCC根据实验方法的准确度与精密度的不同可以分为三级:决定性方法、参考方法、常规方法。（一）决定性方法（definitive method）n n

2、准确度准确度最最高，系统误差高，系统误差最最小，经过详细的研究，小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因，测定结果与没有发现产生误差的原因，测定结果与“真真值值”最最接近。接近。n n用于发展及评价参考方法和一级标准品用于发展及评价参考方法和一级标准品。n n此类实验室往往存在于发达国家。此类实验室往往存在于发达国家。特 点 准确度最高，相对误差最小，测量结果为准确度最高，相对误差最小，测量结果为“确定确定值值”。系统误差最小，经详细研究没有发现产生系统误系统误差最小，经详细研究没有发现产生系统误差的原因。差的原因。常为绝对测量法（结果是绝对值）。在化学分析常为绝对测量法（结果是绝对值）。在

3、化学分析中，重量法和库仑法属绝对测量法，中，重量法和库仑法属绝对测量法，同位素稀释同位素稀释-质质谱分析法（谱分析法（ID-MSID-MS）或中子活化法也可进行绝对测量或中子活化法也可进行绝对测量法。法。需精密仪器、高纯度试剂、训练有素的技术人员需精密仪器、高纯度试剂、训练有素的技术人员以及相应的环境。以及相应的环境。（二）参考方法（reference method）n n是指准确度与精密度已经是指准确度与精密度已经充分证实充分证实的分析方法，的分析方法，干扰因素干扰因素少少，系统误差与重复测定的随机误差相，系统误差与重复测定的随机误差相比可以比可以忽略不计忽略不计，有适当的灵敏度、特异性、线

4、，有适当的灵敏度、特异性、线性及较宽的分析范围。性及较宽的分析范围。n n用于评价常规方法和试剂盒，为二级标准品、质用于评价常规方法和试剂盒，为二级标准品、质控物定值控物定值 。n n这类方法在条件许可的实验室（参考实验室）中这类方法在条件许可的实验室（参考实验室）中使用。使用。（三）常规方法（routine method）性能指标符合临床或其他常规目的需要，性能指标符合临床或其他常规目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性有足够的精密度、准确度、特异性和和适当的适当的分析范围分析范围，简便经济实用简便经济实用。常规方法经充分评价，经学术组织认可，常规方法经充分评价，经学术组织认可，可以作为推

5、荐方法。如可以作为推荐方法。如IFCCIFCC推荐方法、卫生推荐方法、卫生部临检中心推荐方法等。部临检中心推荐方法等。临床化学决定性方法、参考方法、常规方法 项目项目 决定性方法决定性方法 参考方法参考方法 常规方法常规方法 Ca ID-MS Ca ID-MS 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 邻甲酚酞络合酮法、邻甲酚酞络合酮法、MTBMTB法法 Mg ID-MS Mg ID-MS 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 MTBMTB法法 K ID-MS K ID-MS 火焰光度法火焰光度法 ISEISE法法 P ID-MS P ID-MS 米吐尔直接法米吐尔直接法 Na Na 火焰光度法火

6、焰光度法 ISEISE法法 Cl Cl 电量滴定法电量滴定法 ISEISE法、硫氰酸汞比色法法、硫氰酸汞比色法 Cr ID-MS Cr ID-MS 离子交换层析法离子交换层析法 苦味酸比色法苦味酸比色法 Urea ID-MS Urea ID-MS 尿素酶法尿素酶法 二乙酰一肟法、脲酶波氏法二乙酰一肟法、脲酶波氏法 UA ID-MS UA ID-MS 尿酸酶法（紫外法）尿酸酶法（紫外法）磷钨酸比色法磷钨酸比色法 Glu ID-MS Glu ID-MS 己糖激酶法己糖激酶法 葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶法 TC ID-MS Abell-Kendel TC ID-MS Abell-Kendel法法 胆

7、固醇酶法胆固醇酶法（ID-MSID-MS：同位素稀释质谱法）同位素稀释质谱法）举例二、参考物的分级 参考物，也称标准品或标准物质，是一类具有一种或多种成分、含量均匀确定的物质。参考物用以校准仪器设备、评价测量方法或给其它物质赋值。参考物的结果含量一般表示为：标准值总不确定度1.一级参考物（原级参考物）n n是一种稳定而均一的物质，它的数值已是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定由决定性方法确定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，且有所含杂质也已经定量，且有证书证书。n n用于校正决定性方法用于校正决定性方法，评价及校正参考方法评价及校正参考

8、方法以以及及为为“二级参考物二级参考物”定值定值。一级标准品的特点 （1 1）是已经确定的稳定而均一的物质。）是已经确定的稳定而均一的物质。（2 2）所含杂质已被定性或定量地标明。）所含杂质已被定性或定量地标明。（3 3）其数值由决定性方法确定，或由高度）其数值由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定。准确的若干方法确定。（4 4）有公认机构颁发的证书。）有公认机构颁发的证书。SRM-927SRM-927（70g/L70g/L牛血清白蛋白溶液）牛血清白蛋白溶液）为测定蛋白的一级标准品为测定蛋白的一级标准品其技术指标有：其技术指标有：经醋纤电泳及免疫电泳证实，杂蛋白含量经醋纤电泳及免疫电泳证

9、实，杂蛋白含量2%95%95%。糖含量糖含量 0.005%0.005%，脂质，脂质 0.5%0.5%，游离氨基酸和非多肽成，游离氨基酸和非多肽成分分 0.05%0.05%，灰分，灰分 0.1%0.1%，总金属离子，总金属离子 0.02%0.02%。吸光度测定：吸光度测定：A A405nm 405nm 0.20.2（用于检测羟基血红素），用于检测羟基血红素），A A500nm500nm 和和A A600nm600nm 均均 0.050.05，在，在450-600450-600nmnm之间无明显吸收峰，之间无明显吸收峰，A Amaxmax（280nm280nm）/A/Aminmin（255 nm2

10、55 nm）大于大于2 2。经以上技术指标鉴定后，用严格的干重称量法作为经以上技术指标鉴定后，用严格的干重称量法作为蛋白一级标准品的定量方法。蛋白一级标准品的定量方法。举例2.二级参考物（次级参考物）n n这这类类标标准准品品可可由由实实验验室室自自已已配配制制或或为为商商品品，它它的的值值必必须须用用一一级级标标准准品品和和参参考考方方法法并并由由训训练练有有素素的的，能能熟熟练练掌掌握握参参考考方方法法的的操操作作者者确确定。定。n n主主要要用用于于常常规规方方法法的的校校准准或或为为质质控控品品定定值值和和常规测定的结果计算。常规测定的结果计算。3.校准物（校准品）用于常规分析仪器校准

11、并具有可溯源性的标准用于常规分析仪器校准并具有可溯源性的标准物质。物质。常规测定用常规测定用校准品校准品：可以不是二级标准品。如：可以不是二级标准品。如一些知名公司提供的一些知名公司提供的校准液校准液或称定标液。但必须具或称定标液。但必须具有可溯源性。有可溯源性。4.控制物（质控品）用于常规质量控制，用来控制患者标本的测定误差。质控物不能用于仪器的校准。决定性方法决定性方法用途：评价参考方法及一级参考物一级参考物一级参考物发展及评价参考方法，校准决定性方法及参考方法，为二级标准品定值参考方法参考方法为二级标准品及质控品定值，评价常规方法二级参考物、校准品二级参考物、校准品常规方法的标准品，为质

12、控品定值常规方法常规方法临床实验室的常规定量分析 质控品质控品质量保证评价校准校准评价定值评价校准定值各级分析方法与参考物的互相关系各级分析方法与参考物的互相关系测定结果测定控制测定三、常规方法选择的原则（一）常规方法的要求 国际临床化学协会（国际临床化学协会（IFCCIFCC）提出：常规方提出：常规方法应具有法应具有适用性适用性和和可靠性可靠性两方面的要求。两方面的要求。实验室应根据条件（仪器设备、技术力量、实验室应根据条件（仪器设备、技术力量、实验成本等因素），选择常规分析方法和简便实验成本等因素），选择常规分析方法和简便的参考方法。的参考方法。1.适用性 （1 1）微量快速微量快速 适用

13、于急诊和成批分析。适用于急诊和成批分析。（2 2）方方法法简简便便 无无需需特特殊殊培培训训，试试剂剂种种类类少少，易于自动化分析。易于自动化分析。（3 3）安全可靠安全可靠 试剂无毒害，保存简便。试剂无毒害，保存简便。（4 4）成本低廉成本低廉 试剂、仪器和辅助设备成本。试剂、仪器和辅助设备成本。（二）可靠性 具有较高的精密度、准确度和特异性，以及较大的检测范围。精密度：不精密度一般应小于3%。准确度：不准确度一般应小于5%。特异性：尽可能只对待测物特异。检测范围：能适合正常和大多数病理标本。四、常规方法的选择步骤 n n临床提出要求临床提出要求n n广泛查阅文献广泛查阅文献n n确定候选方

14、法确定候选方法n n进行评价实验进行评价实验 五.定量测定的方法学比对 ISO15189规定：当同样的检验应用于不同的程序或设备，或在不同地点进行，应有确切机制以验证在整个临床适用的区域内检验结果的可比性。（简单地说：一个检验项目在不同仪器、方法、地点检测，应该得到相同的结果。）比对方案：CLSI EP9-A2文件“用患者标本进行方法学比较和偏倚评估批准指南”（CLSI 美国临床和实验室标准研究院）进行EP9-A2的准备和步骤：1.熟悉检测系统，熟悉评价方案。2.对整个过程进行质量控制。3.至少应有40份患者新鲜标本，这些标本应涵盖线性范围，不要收集对实验有干扰的标本。4.按标本号1、2、3、

15、4、5、6、7、8测定一次，然后8、7、6、5、4、3、2、1测定一次，不同检测系统同时进行。5.剔除离群值，绘制散点图，建立线性回归方程。6.判断是否可接受。六.定性试验的方法学评价（一）评价准备 熟悉实验方法，选择合适的试剂，使用质量控制，使用阴阳性对照（二）定性试验重复性评价 1.确定方法的临界值（cut-off），是判定阴性阳性的分界点。2.准备 临界值20%浓度标本。3.分别测定以上标本20次，记录阴性阳性结果。4.测定结果阴性和阳性结果应该各占一半。5.结论：测定结果阴性和阳性结果应分别大于95%了解（三）定性试验方法学比较1.样本种类和数量 患者新鲜标本，稳定。阴性和阳性标本应分

16、别在50例以上。2.实验过程 在常规条件下，10-20天完成。3.以符合率进行结果描述。了解 量值溯源的目的，是让常规标本的检测结果得到和参考系列相同的测量值。参考方法常规方法患者新鲜标本参考值结果常规测定结果结果一致一级参考校准测定得到第二节 量值溯源、误差及不确定度掌握几个基本概念二级参考校准一、量值溯源的概念量值的溯源性 通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。二、参考物的量值溯源了解大大小小三、误差的分类和表示1.系统误差 是指测定值与“真值”的符合程度。以变异系数来表示 特点：单向性，没有随机性，有

17、一定的大小和方向；找到原因，采取措施后可以基本消除。分恒定系统误差和比例系统误差。2.随机误差 是多次测定结果之间的符合程度。以偏倚表示 特点：误差没有一定的大小和方向，呈正态分布，不可预测，不可避免，但可控制在一定范围内；重复测定的均值可减少随机误差。测定值、样本均值、真值测定值、样本均值、真值和和系统误差、随机误差的关系系统误差、随机误差的关系真值样本均值测定值SERE比例系统误差恒定系统误差比较方法结果试验方法结果系统误差类型示意图理想情况四、测量不确定度1.基本概念 表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。（理解：测量不确定度是指由于测量误差的存在，而对被测量值不能肯

18、定的程度，它表征被测量的真值所处的测量范围。）1.测量不确定度计算 A类不确定度估算=测量值标准偏差s因子 B类不确定度估算=仪器误差 总不确定度的合成：“平方和 开平方”第三节 检测系统性能评价评价的意义 方法学评价，是通过实验途径测定分析方法的技术性能，并评价分析性能是否被临床所接受。评价的基本步骤 1.确定方法的质量目标，总允许误差 2.选定评价指标，重复、回收、干扰、比较 3.收集评价的实验数据，进行统计学分析 4.判断方法的临床可接收性什么是检测系统？完成一个项目检测涉及的仪器、试剂、校准品、测定方法、质量控制、保养计划等的（规定）组合。贝克曼LX20生化仪罗氏的检测试剂盒贝克曼的校

19、准品葡萄糖氧化酶法如：葡萄糖测定贝克曼LX20生化仪贝克曼的检测试剂盒贝克曼的校准品葡萄糖氧化酶法两个不同的检测系统一、检测系统的概念及分类完整的检测系统自建的检测系统进行性能核实进行详尽的评估二、检测系统的评估方法 一个检测系统从厂家的实验室搬运到我们的常规实验室，诸如环境（供电、供水、温度、湿度等）和操作人员等的改变，其性能是否还能保持和说明书上的描述一致？因此需要评估（一）评估内容 与检测结果质量相关的：精密度、准确度、可报告范围等。（二）评估方法 重点是检测系统性能评价（方法学评价）性能评价参考文件 美国临床和实验室标准研究院（CLSI）公布一系列与方法学评价相关的文件，如：EP5-A

20、精密度评价 EP6-A线性评价 EP7-A干扰实验 EP9-A2方法比对 。必要时可以利用上述EP文件对我们的检测系统进行标准化的评估。三、精密度评价三、精密度评价 重复性试验重复性试验 精密度是指同一样本在规定条件下多次重复测得的一系列单次值之间的接近程度，是表示测定结果中随机误差大小的指标。精密度一般以变异系数CV%表示 重复性试验是评价精密度的常用方法。2.2.基本方法基本方法 对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定，一般为测定，一般为2020次。次。n n批内重复性：批内重复性：20 20次测定，计算次测定，计算x x、s s、cv%cv%

21、。n n批间重复性：批间重复性：一天内分数批重复一天内分数批重复2020次测定，计算次测定，计算x x、s s、cv%cv%。一般分一般分5 5批每批作批每批作4 4次测定。次测定。cv%cv%比批内大比批内大。n n日间重复性：日间重复性：每天每天1 1次，重复次，重复2020天，计算天，计算x x、s s、cvcv。其其cvcv反映实际工作情况。反映实际工作情况。cvcv比批间大比批间大。3.3.试验要点试验要点（1 1）分析样品性质和分析物浓度分析样品性质和分析物浓度 分析样品分析样品：校准品、质控血清、病人标本都可：校准品、质控血清、病人标本都可 分析物浓度分析物浓度：一般二个浓度：一

22、般二个浓度 参考值或在医学决定水平附近参考值或在医学决定水平附近（2 2）试验条件试验条件 尽量在相同条件下进行尽量在相同条件下进行4.性能可接受判断 （1）批内或日内标准差应小于等于CLIA88规定的总允许误差的1/4 （2）日间的标准差应小于等于CLIA88规定的总允许误差的1/3医学决定水平，就是临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。医学决定水平，就是临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。EP5-A EP5-A 精密度评价方案介绍精密度评价方案介绍1.1.实实验验标标本本每每天天测测定定2 2次次（2 2次次测测定定间间隔隔不不得得少少于于2 2小小时时），每每次次测测定定均均作

23、作双双份份，共共测测定定2020天天，收收集集8080个个数数据据（见表（见表3-53-5）。）。2 2.统计处理统计处理 每双份的差值（批内差）反映了批内精密度每双份的差值（批内差）反映了批内精密度 每天每天2 2次均值的差值反映了天内的精密度次均值的差值反映了天内的精密度 2020天有天有2020个批间差，减去批内差，反映了批间精密度个批间差，减去批内差，反映了批间精密度 （见（见p46p46）四、准确度的评价（一）准确度评价指标有：方法比较试验、回收试验和干扰试验。（二）方法比较试验 实验方案：EP9-A2 1.基本方法：用两种方法同时对一组新鲜标本进行测定，根据测定结果的差异，得到恒定

24、或比例系统误差。2.实验要点：（1）比较方法的选择：尽可能选择性能高的方法，如参考方法。（2）实验标本与测定（见定量检测的方法学比对）标本例数、浓度分布、测定时间、测定顺序比例系统误差恒定系统误差比较方法结果试验方法结果3.结果分析理想情况4.临床可接受判断：SE TEa 为可接受水平。（三）回收试验（三）回收试验 概念概念 在常规分析样品中加入在常规分析样品中加入纯分析物纯分析物，测定值是否与理论值相同的试验。目的测定值是否与理论值相同的试验。目的是测定是测定比例系统误差比例系统误差，以衡量候选方法，以衡量候选方法的的准确度准确度。1.1.基本步骤基本步骤 将将被被分分析析的的纯纯品品标标准

25、准液液加加入入样样品品中中，成成为为分分析析样样品品。原原样样品品加加入入同同量量的的无无分分析析物物的的溶溶液液作作基基础础样样品品。然然后后用用实实验验方方法法分分析析，两两者者测测定定结结果果的的差差值值为为回回收收量。量。32.2.回收率计算回收率计算 加入浓度加入浓度=标准液浓度标准液浓度 回收浓度回收浓度 =分析样品测得浓度分析样品测得浓度 基础样品测得浓度基础样品测得浓度回收率（回收率（%）=一般要求回收率一般要求回收率95-105%95-105%比例系统误差比例系统误差 =100%-=100%-平均回收率平均回收率%3回收率接近100 分析不受基质影响。无论在纯溶液还是复杂的基

26、质环境中，分析方法的反应能力是一样的。（准确度不受影响）回收率明显偏离100 分析明显受不同的基质影响。在不同的基质环境下，分析方法的反应能力有明显差异。（准确度受影响）回收率的理解：基质：分析样品中，除了被测物质之外的，都称为3.3.3.3.试验要点试验要点（1 1）加入标准液的体积在整个样品中要少于等于加入标准液的体积在整个样品中要少于等于10%10%。（2 2）要准确吸量。一般每样品重复测定）要准确吸量。一般每样品重复测定2-32-3次取均值。次取均值。（3 3）分析样品浓度必须在测定方法的分析范围内。一般）分析样品浓度必须在测定方法的分析范围内。一般需做高中低三个浓度需做高中低三个浓度

27、的回收试验，计算平均回收率。的回收试验，计算平均回收率。（4 4）分析样品浓度最好在医学决定水平上。）分析样品浓度最好在医学决定水平上。4.可接受判断 一般：SE+RE 1.03）例预期值实测值预期值预期值实实测测值值举例七、生物参考区间（一）关于基本概念：参考个体 根据临床的要求选择的检测个体；参考总体 所有参考个体的集合称；参考抽样组 一定数量的参考个体；参考值 对一个参考个体进行某项目的测定得到的一个测定值；参考值范围 所有参考抽样组的各参考值合起来为；参考区间 所有参考值根据临床使用要求，经过统计归纳分析后，确定的是参考区间（是参考值范围的一部分）。（二）参考区间的建立 1.实验方案：

28、建立新项目参考值范围和参考区间的计划 2.选择参考个体怎样才算健康？各项目临床应用不同，对健康也有不同的规定。一般规定要排除的：饮酒、吸烟、高血压尽可能与使用该项目的患者分布组成相近的；除非有必要，不要选择门诊或住院患者。是否要分年龄组和性别组。3.做好参考个体分析前的准备尽量减少生物变异，避免引入干扰。4、参考值数据的要求和分析（1）建议至少每组要取120个参考值数据；（2）按照统计学要求舍取疑似离群点，如有离群点被剔除，应补足数据；（3）绘制分布图，了解数据的分布特性；（4）参考值数据分组要根据临床意义并作Z检验（p56）。（三）参考区间的转移和验证 实验室引入外部实验室或厂家提供的参考区间的过程，称参考区间的转移。实验室一般存在以下两种情况：（1）使用相同检测系统的参考区间的转移 （2）使用不同检测系统的参考区间的转移对于上述（1），可采用“用20个参考值数据进行验证”。对于上述（2），则采用EP9-A2进行方法比对和偏倚评估。