《单克隆抗体》PPT课件.ppt

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1、11.8.3 单克隆抗体回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两 个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传 重组，在育种方面意义重大。杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。基础知识回顾 免疫学基础 1 抗原 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分子具有表面稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。2 抗体P238动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白

2、 （Immuniiglobbulin,Ig）。互补性决定区（Complementarity determining region，CDR）VH 和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位（Antigen-binding site）。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。多克隆抗体与单克隆抗体动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗

3、体的比较（见下页）比较项目比较项目多克隆抗体（多克隆抗体（PcAb）单克隆抗体（单克隆抗体（MAb）免疫原要求免疫原纯度高，抗体纯度才能高不纯的免疫原可以获得高纯度抗体抗体产生细胞多克隆性单克隆性均质性高度异质高度纯质特异性较高，与抗原上多种决定簇结合高，与抗原上特定决定簇结合稳定性较好相对较差，对理化条件敏感标准化较难，不同批次的抗体质量差异大易于标准化，批次间差异小交叉反应很常见，难避免非特异性反应不常见，可避免非特异反应沉淀反应有多数没有实用的血清学试验大多数血清学试验一种或多种，需适当选择供应量有限无限有效抗体含量0.1-0.2 mg/ml小鼠腹水2.0-30 mg/ml无效Ig含量1

4、0.0-15.0 mg/ml体外培养一般没有，小鼠腹水0.5-5.0 mg/ml其它血清蛋白存在体外培养可能有少量小牛血清蛋白，小鼠腹水有少量杂蛋白3.干扰素脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质。可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而得此名。分子量数百至数千不等。工程菌表达为主。问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的 B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？很难离体培养B淋巴细胞。（一）历史发现1

5、975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠的脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。病毒诱导制备转化脾细胞有人直接取出健康的活化脾细胞，在培养中加入病毒体外诱导，以获得能永久生长的特异脾细胞系。这种方法工作量大、难度高，在制备人用单抗时比较有用。（二）杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydrid

6、omatechniquete）。单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领域：1.作为亲合层析的配体 2.作为生物物治疗的导向武器 3.作为免疫抑制剂4.探针 5.作为医学检验试剂 1.免疫原的制备：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体2.小白鼠免疫及脾脏细胞获得1)小白鼠(BALB/c)先以目标抗原(如菌体)免疫，2)抗原需加 佐剂(adjuvant,如

7、 TiterMax)制成乳剂，3)打入小鼠体内慢慢释出(免疫流程)，4)诱使 B 细胞成熟增殖并生产抗体，5)然后取出脾细胞(大多为 B 细胞)。2)注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。也可以在 电泳后，切出所要色带，胶体装入乳化针筒，加入佐剂直接制成乳剂，可有相当好的免疫效果。3)有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。近来更流行以抗原的 DNA 种入肝脏中，以此 DNA 的表现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应还是最可靠。

8、4）注意免疫过的脾脏被大量结缔组织包裹,分离起来比正常脾脏困难一些，如果不能完整的分离，可以分小块分离。将小鼠两后肢交叉固定(左后肢在上以便于脾脏的暴露)，用小镊子在远离脾脏的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，将剪刀尖从小口伸进去，打开剪刀将小口向两边撑开，再将小镊子从撑开的小口伸进去，夹紧并挂住腹膜向前撕扯，直到脾脏完全暴露。换一套小剪刀和镊子，用小镊子夹紧脾脏并轻轻向上提起，用小剪刀剪断结缔组织即可分离出脾脏，之后，用小剪刀在脾脏的边缘剪一些小口，将脾脏转移到玻璃匀浆器中。加5mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器中，将脾脏进行匀浆，直到看不见红色的组织块，补加

9、5mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器中，混匀后静置1min，待白色的组织块沉到管底后，吸出上层细胞悬液8mL，转移到50mL离心管中，补加8mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器后再转移一次。3.骨髓瘤细胞的获得骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样 杂交融合率高。通常采用HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细 胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。骨髓瘤细胞悬液的制备方法（一）：细胞培养法a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶10

10、0ml培养瓶培养的细胞进行准备）。b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。c、1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液加入台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数106/2 骨髓瘤细胞悬液的制备方法（二）：饲养小鼠法将Balb/c小鼠体内生长的SP2/0骨髓瘤匀浆后制备SP2/0骨髓

11、瘤细胞，然后再用于融合，其制备步骤如下：将背部皮下长出骨髓瘤的Balb/c小鼠脱颈椎处死，用75%的酒精浸泡5min。在一支灭菌50mL离心管中事先加入15mL淋巴细胞分离液。背部朝上固定小鼠，参照饲养细胞的制备方法，分离骨髓瘤（只要蚕豆大小的一块瘤子即够做一次融合了），匀浆制备骨髓瘤细胞。取15mL骨髓瘤细胞悬液轻轻加到淋巴细胞分离液的上层。1700r/min，水平离心10min后，取出离心管可见，在骨髓瘤细胞悬液和淋巴细胞分离液的交界处有一层白色的细胞，这就是骨髓瘤细胞，用10mL吸管吸走上层细胞悬液后，将中层的骨髓瘤细胞悬液转移到另一支灭菌50mL离心管中，用15mLRPMI-1640基

12、础培养液，1200r/min，5min,洗细胞两次。用10mLRPMI-1640基础培养液重悬骨髓瘤细胞，用血球计数板计数。骨髓瘤细胞浓度=（四角+中央中方格的细胞数）5104个/毫升饲养细胞作用：吞噬死亡及异常细胞提供生长因子危害：吞噬融合细胞争夺营养4.细胞融合（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。取1107个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用

13、滴管吸净残留液体。于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合细胞的50mL离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴（很重要）。（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。将其放置于事先准备好的37水浴中，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续90s后，移走水浴锅，从CO2培养箱取出温育至37的50mLRPMI-1640基础培养液，用吸管吸取10mL缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌（不能吹打），使细胞团块分散，先加1mL，再加2mL，再加3mL，最后加完剩下的4mL，加完第一个10mL后，接

14、着沿管壁加完剩下的40mL，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。融合条件：PEG1450,90秒，浓度50%（4）离心，弃上清，用20小牛血清的HAT培养液轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100l孔，37、5CO2 孵箱培养。5.融合细胞的筛选融合后的细胞类型 融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞未融合的脾细胞、未融合未融合的瘤细胞的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞和

15、瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。HAT培养基筛选法有培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。筛选原理DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA，可以被氨基蝶呤（A）阻断 胸腺嘧啶核苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶（TKTK）补救途径：核苷酸前体 核苷酸DNA次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HPRTHPRT）需要2种酶的共同参与；氨基蝶呤对补救途径无阻断（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采

16、用该途径合成DNA。（2）融合所用的瘤细胞一般是融合所用的瘤细胞一般是HPRTHPRT与与TKTK缺陷型缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。6.阳性孔的筛选1 集落孔的标记 融合后第7天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打上小点，标明集落的位置，以便检测时取样以及原始孔的对号入座。2.筛选方法的建立 采

17、用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选出能够产生抗原特异性抗体的阳性孔，对阳性集落孔进行克隆。3.完全抗原用间接ELISA方法一步筛选即可；而不完全抗原筛选分两步进行，第一步为间接ELISA法筛选，本步筛选出抗半抗原而不抗载体（BSA、HSA）的阳性孔；第二步为直接竞争ELISA法筛选，此步对第一步筛选出的阳性孔进行检测，筛选出B/B0值相对较小的孔。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S So

18、rbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)原理原理（以间接性（以间接性ELISA为例）为例）：显色显色显色显色酶联免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物（带有酶），加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量

19、直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。预期结果预期结果阳性：显色为黄色阳性：显色为黄色阴性：无色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性注意事项注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。包被和温育在湿盒内进行。7.克隆化培养将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。培养板每孔预先加培养板每孔预先加饲养细胞。饲养细胞。找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生

20、产抗体。（1）有限稀释法）有限稀释法a.制备小鼠腹腔细胞。或再加脾细胞。b.制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含、15和50个细胞3中不同的稀释度。c.按每毫升加入5104-1105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d.每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为，每孔的杂交瘤细胞数分别为、3和10。e.37、7.5%CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f.取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。（2）软琼脂法软琼脂法a.在培养皿中制备饲养细

21、胞（小鼠腹腔细胞）单层。b.临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45水浴中温育。c.吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。d.取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。e.37、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。f.吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。细胞的冻存与复苏在杂交瘤细胞进行扩大培养后，应该冻存一部分细胞。采集腹水后还应该用淋巴细胞分离液将杂交瘤细胞分离出来再冻存一部分。细胞冻存几个月后要

22、进行复苏，对细胞活力和分泌抗体的能力进行检测。细胞冻存细胞复苏 8.单克隆抗体的大量生产（1）实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按13107 cellsml 接种于小鼠背部皮下，每处注射。待肿瘤 达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。采血量有限。（2）腹水制备法 腹腔注射1106 个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入 试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可 用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml，这是 目前最常用的方法。（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 杂

23、交瘤细胞 生物反应器 培养液 离心除去细胞，收集上清液提取抗体。9.9.单抗的纯化单抗的纯化（1 1）腹水的处理腹水的处理 在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。A.二氧化硅吸附法：新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入巴比妥缓冲盐水稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过

24、该法除去，即可得澄清的腹水。B.过滤离心法：用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4）除去细胞残渣及小颗粒物质。C.混合法：即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。（2 2）单抗的粗提单抗的粗提A A、硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法a.饱和硫酸铵溶液的配制 b.盐析：c.脱盐：蛋白质含量的测定：分装冻存备用。B B、辛酸辛酸-硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。C C、优球蛋白沉淀法优球蛋白沉淀法 该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几

25、乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。（3 3）单抗的纯化）单抗的纯化单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。动物细胞大规模培养生产药物存在问题与发展方向 （1）细胞密度低，产物浓度低。（2）大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低活性易降低。（3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。（4）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。（5）在线监测水平技术不完善，限制了优良培

26、养系统的开发。今后应重点开展的工作 （1）细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研究。（2）开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。（3）开发细胞生长性能优良、细胞解解离容容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。（4）研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌包括新型的无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控制技术等。（5）基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。人源化单克隆抗体鼠源性单抗的局限：不能激活补体及Fc受体；易被人体识别排斥；易清除。人源化单抗的制备思路：人鼠杂交瘤：人脾细胞+鼠骨髓瘤人人杂交瘤：人脾细胞+人骨髓瘤免疫缺陷小鼠：T、B细胞均缺乏，易植入人免疫干细

27、胞基因工程单抗基因工程单抗单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3）与轻链V区（5）端连接在一起（VH-linker-VL）即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（single chain antibodies）。它能自发折叠成天然构象，与抗原的结合力维持与原来完整抗体一样。基因工程单抗人-鼠嵌合抗体：其原理是取某一Mab基因的V区，与人Ig基因的C区连接，然后插入到表达质粒中，传染骨髓瘤细胞即产生出鼠-人嵌合抗体。由于Ig的C区是人源的，这种抗体对人的免疫性就大为降低，采用不同亚类的人C区基因，便可改变抗体的

28、效应功能，以获抗肿瘤的最佳效果。鼠-人嵌合抗体并不能彻底清除鼠源免疫原性，于是进一步提出重构抗体的设想。即：人化抗体组合抗体库技术1985年Smith将一基因片段克隆到载体噬菌体fd-tet的基因（g3）上，发现该基因所表达的蛋白与噬菌体基因表达的蛋白结合在一起呈现到噬菌体表面。这种表达的融合蛋白仍保留抗原特异性和生物活性，可通过相应抗原进行检测。目的基因表达的蛋白如若想在噬菌体表面呈现，就必须插在这5种外壳的其中一处。实验表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都会影响其构成外壳蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌体表面呈现，也不影响噬菌体的完整性和稳定性。利用这一系统可以构建表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库。它最先被用于抗体基因文库的构建和筛选。虽然利用动物的免疫可以获得循环多克隆抗体，用细胞融合方法可以获得单克隆抗体，但利用基因工程的技术构建抗体基因库，再筛选所需的特异性抗体，不仅摆脱了繁重的工作量，也可获得大量的、稳定的抗体。而且随着研究的不断深入和发展，抗体的多样性，亲和力也大有提高。