氨基酸、多肽、蛋白质.ppt

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1、 重庆医科大学重庆医科大学有有 机机 化化 学学 杨晓兰杨晓兰杨晓兰杨晓兰 (第六版第六版 倪沛洲）倪沛洲）第十六章第十六章 氨基酸、多肽氨基酸、多肽和蛋白质和蛋白质Amino Acids,Peptides and Protein10/28/20222主要内容主要内容v第一节第一节 氨基酸氨基酸(Amino Acid)v第二节第二节 多肽多肽(Peptides)v第三节第三节 蛋白质蛋白质(Proteins)第一节第一节 氨基酸氨基酸(Amino Acids)v一、结构、分类与命名一、结构、分类与命名v二、性质二、性质v（一）物理性质（一）物理性质v（二）化学性质（二）化学性质(一一)氨基酸的

2、结构氨基酸的结构20 standard amino acids in proteins一、结构、分类与命名一、结构、分类与命名 2、结构表示、结构表示vL-L-氨基酸氨基酸L-L-甘油醛甘油醛(对照标准对照标准)S-S-L-L-半胱氨酸半胱氨酸R-R-半胱氨酸半胱氨酸(二二)分类分类分分 类类-COOH-COOH-NH-NH2 2氨基酸（数）氨基酸（数）酸性氨基酸酸性氨基酸2 2个个1 1个个2个个中性氨基酸中性氨基酸1 1个个1 1个个15个个碱性氨基酸碱性氨基酸1 1个个2 2个个3个个*骨骨架架变变化化(二二)结构和命名结构和命名UV 特征吸收：特征吸收：l l=280 nmAcidic

3、 amino acidscontaining two carboxylic groupsBasic amino acids containing two amino groups必需氨基酸（必需氨基酸（8 8种种）v三字符：三字符：Val,Leu,Ile,Thr,Met,Trp,Lys,Phev中文名：中文名：缬、亮、异亮、苏、蛋、色、赖、苯丙缬、亮、异亮、苏、蛋、色、赖、苯丙v体内不能合成，必需由食物提供的氨基酸。体内不能合成，必需由食物提供的氨基酸。修饰氨基酸的结构修饰氨基酸的结构L-胱氨酸 L-羟脯氨酸 L-羟赖氨酸 L-甲赖氨酸非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸v定定义义：不不参参与与构构成

4、成蛋蛋白白质质但但却却以以各各种种形形式式分分布布于于植物、细菌和动物体内的这些氨基酸。植物、细菌和动物体内的这些氨基酸。v形式存在：以形式存在：以游离游离或或结合形式结合形式存在的氨基酸。存在的氨基酸。包括：包括：-氨基酸氨基酸 -氨基酸氨基酸 -氨基酸氨基酸 -氨基酸氨基酸 D-D-氨基酸氨基酸例子例子非蛋白质氨基酸氨基酸作用鸟氨酸瓜氨酸精氨酸的代谢中间体-氨基丁酸是谷氨酸的脱羧产物脑内的重要神经递质-丙氨酸/构成维生素泛酸的基本成分D-丙氨酸D-谷氨酸/细菌的肽聚糖的成分D-赖氨酸D-鸟氨酸/某些革兰氏阳性菌的糖肽中的成分二、性质二、性质（Properties）v（一）物理性质（一）物理

5、性质v（二）化学性质（二）化学性质 1 1、酸碱两性与等电点、酸碱两性与等电点 2 2、脱羧反应、脱羧反应(decarboxylation)(decarboxylation)3 3、与、与HNOHNO2 2反应反应 4 4、与茚三酮、与茚三酮(ninhydrin)(ninhydrin)反应反应 5 5、成肽反应、成肽反应 1 1）酸碱性酸碱性(acid-base properties)(acid-base properties)氨基酸氨基酸既是酸又是碱既是酸又是碱2 2）易于水，不溶于非极性溶剂。易于水，不溶于非极性溶剂。3 3）固体熔点高（固体熔点高（200-300200-300）4 4）旋

6、光性旋光性(optical activity)(optical activity)氨基酸的结构氨基酸的结构存在形式：存在形式：氨基酸在结晶状态或在接近中性的溶液中是以氨基酸在结晶状态或在接近中性的溶液中是以两性离两性离子子(dipolar ion)的形式存在的的形式存在的,是一种是一种内盐内盐(inner salt)（一）物理性质（一）物理性质（二）化学性质（二）化学性质v1、酸碱性与等电点酸碱性与等电点 (1)两性电离两性电离Amino acids are ampholytes(两性电解质两性电解质)碱性电离碱性电离酸性电离酸性电离酸碱性酸碱性铵盐铵盐羧酸盐羧酸盐（2）氨基酸的电离平衡）氨基

7、酸的电离平衡v在三种离子共同存在于一个平衡体系中在三种离子共同存在于一个平衡体系中v以以哪哪种种离离子子为为主主取取决决于于氨氨基基酸酸的的结结构构和和溶溶液液的的酸酸碱度。碱度。阳离子阳离子 两性离子两性离子 阴离子阴离子等电点等电点(Isoelectric Point，pI)定定义义：在在某某一一pH 值值下下，氨氨基基酸酸所所带带正正电电荷荷的的数数目目与与负负电电荷荷的的数数目目正正好好相相等等，即即净净电电荷荷为为零零，该该 pH 值为该氨基酸的值为该氨基酸的等电点等电点（pI）。v1、amino acids 几乎全部以两性离子几乎全部以两性离子 I 的形式存的形式存在（并伴以极少量

8、的阳性离子在（并伴以极少量的阳性离子 和阴性离子和阴性离子）v2、氨基酸的溶解度最小、氨基酸的溶解度最小等电点时等电点时（1 1）氨基酸结构的影响）氨基酸结构的影响氨基酸氨基酸pI酸性氨基酸酸性氨基酸4.0中性氨基酸中性氨基酸5.06.5碱性氨基酸碱性氨基酸7.5（2 2）溶液酸碱度的影响）溶液酸碱度的影响 pKa COOH:2.2 pKb pKa NH3+:9.4 pKb pHPI 阳离子阳离子 两性离子两性离子 阴离子阴离子氨基酸的电泳示意图氨基酸的电泳示意图 PH精氨酸丙氨酸天冬氨酸278.5正电荷正电荷/负级负级 正电荷正电荷/负级负级 正电荷正电荷/负级负级正电荷正电荷/负级负级 负

9、电荷负电荷/正级正级 负电荷负电荷/正级正级正电荷正电荷/负级负级 负电荷负电荷/正级正级 负电荷负电荷/正级正级2、脱羧反应、脱羧反应(decarboxylation)组胺组胺尸胺尸胺-氨基丁酸（氨基丁酸（GABA）v-氨基丁酸氨基丁酸v是由谷氨酸中是由谷氨酸中-羧基脱羧后转变而成羧基脱羧后转变而成v是脑内存在的重要神经递质是脑内存在的重要神经递质L-L-谷氨酸谷氨酸 -氨基丁酸氨基丁酸 3、与、与HNO2反应反应v根据放氮的体积，可测定氨基酸根据放氮的体积，可测定氨基酸和多肽的和多肽的和多肽的和多肽的的含量。的含量。此种方法称为此种方法称为此种方法称为此种方法称为van Slyke van

10、 Slyke 氨基氨基氨基氨基氮测定法氮测定法氮测定法氮测定法4、与茚三酮、与茚三酮(ninhydrin)反应反应v 茚三酮茚三酮 -氨基酸氨基酸 蓝紫色蓝紫色(Ruhemanns purple)鉴别：鉴别：-氨基酸氨基酸5、成肽反应、成肽反应v二肽(dipeptide)酰胺键或称肽键例题与习题例题与习题现在有四个氨基酸：苯丙氨酸现在有四个氨基酸：苯丙氨酸pI、脯氨酸、脯氨酸pI、门冬氨酸、门冬氨酸pI和赖氨酸和赖氨酸pI，请问在以下，请问在以下pH条件下进行电泳，各氨基酸的条件下进行电泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外电场作用下，移向阳极还是阴主要存在形式是什么？在外电场作用下，移向阳极

11、还是阴极？极？苯丙氨酸苯丙氨酸 脯氨酸脯氨酸 门冬氨酸门冬氨酸 赖氨酸赖氨酸（1）（2）（3）（4）正正 阴极阴极 正正 阴极阴极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极负负 阳极阳极 负负 阳极阳极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极正正 阴极阴极 正正 阴极阴极 正正 阴极阴极 正正 阴极阴极负负 阳极阳极 正正 阴极阴极 负负 阳极阳极 正正 阴极阴极第二节第二节 肽肽(peptide)第十七章 氨基酸、多肽和蛋白质 第二节 肽 肽肽是氨基酸残基之间彼此通过是氨基酸残基之间彼此通过酰胺键酰胺键(肽肽键键)连接而成的一类化合物。其通式为：连接而成的一类化合物。其通式为：氨基酸氨基酸 氨基酸氨基酸 二二

12、 肽肽 多肽分子中的酰胺键称为多肽分子中的酰胺键称为肽键肽键(peptide bond),一般为一般为-COOH 与与-NH2 脱水缩合而成。脱水缩合而成。肽也以肽也以两性离子两性离子两性离子两性离子的形式存在。的形式存在。32 二肽分子的两端仍存在着游离的二肽分子的两端仍存在着游离的-NH3+和和-COO-,因此它可以再与另一分子氨基酸脱水因此它可以再与另一分子氨基酸脱水缩合形成缩合形成三肽三肽;同样依次可形成同样依次可形成四肽四肽、五肽五肽。四四肽肽 l十肽以下的称为十肽以下的称为寡肽寡肽（oligopeptide）l大于十肽的称为大于十肽的称为多肽多肽（polypeptide）l肽中的氨

13、基酸单位称为肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基氨基酸残基(amino acid residue)第十七章 氨基酸、多肽和蛋白质 第二节 肽 上页上页下页下页首页首页33 自然界存在多种肽类物质自然界存在多种肽类物质 青霉素青霉素 短杆菌肽短杆菌肽S S脑啡肽脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu leucine enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met methionine enkephalin虽有环肽存在虽有环肽存在,但绝大多数的肽呈链状但绝大多数的肽呈链状,称为称为多肽链多肽链 l N-末端末端(N-terminal end)：保留游离保留游离-NH-NH2 2 的

14、一端的一端,也叫也叫氨基末端氨基末端，一般写在肽链的左边。，一般写在肽链的左边。l C-末端末端(N-terminal end):保留有保留有 -CO-CO2 2HH 的一端，的一端，也叫也叫羧基末端羧基末端,通常写在肽链的右边。通常写在肽链的右边。l 肽链骨架肽链骨架:所有链状多肽都有一个共同的骨架所有链状多肽都有一个共同的骨架一、肽的结构和命名一、肽的结构和命名 上页上页下页下页首页首页35v三肽三肽(tripeptide)(tripeptide)。v命命名名：以以C-C-末末端端的的氨氨基基酸酸为为母母体体，其其它它氨基酸残基称氨酰氨基酸残基称氨酰依次依次命出。命出。v丙氨酰半胱氨酰亮氨

15、酸丙氨酰半胱氨酰亮氨酸v缩写成：丙缩写成：丙-半胱半胱-亮亮 或或 Ala-Cys-Leuv简写成：简写成：A-C-L思思考考题题：Ser-Gly-Tyr-Ala-LeuSer-Gly-Tyr-Ala-Leu 与与 Leu-Ala-Tyr-Gly-SerLeu-Ala-Tyr-Gly-Ser 相相同同吗吗?肽键平面肽键平面 v肽单元肽单元（-C-C-CO-NH-C-CO-NH-C-）v特征：特征：v（1 1）肽单元是平面结构肽单元是平面结构。v（2 2）肽键具有局部双键性质肽键具有局部双键性质。v（3 3）肽肽键键呈呈反反式式构构型型 与与C-NC-N键键相相连连的的O O与与H H或或两两个

16、个C C 原原子子之之间间一一般般呈呈较较稳稳定定的的反式构型。反式构型。Peptide Bonds肽键的平面特征肽键的平面特征 二硫键（二硫键（Disulfide bond）Disulfide Bonds(二硫键)烫发的过程是一个旧二硫烫发的过程是一个旧二硫键还原打开而后又氧化形键还原打开而后又氧化形成新的二硫键过程成新的二硫键过程两性电离和等电点两性电离和等电点脱羧反应脱羧反应与亚硝酸反应与亚硝酸反应酰化反应酰化反应缩二脲反应缩二脲反应，缩二脲反应被广泛用于肽和蛋白质，缩二脲反应被广泛用于肽和蛋白质的定性和定量分析。的定性和定量分析。二、肽的性质二、肽的性质42v（1 1）氨基酸组分分析）

17、氨基酸组分分析 （2 2）氨基酸顺序分析）氨基酸顺序分析三、肽结构的测定三、肽结构的测定（1）肽中氨基酸组分分析）肽中氨基酸组分分析 The number and kinds of amino acids 6 N HCl,heating at 100oC for 24 h automated amino acid analyzerAmino Acids Analyzer（2 2）肽中氨基酸顺序分析）肽中氨基酸顺序分析 N-N-端测序：端测序：EdmanEdman降解法：可用于自动测序降解法：可用于自动测序适用于适用于5050肽肽 C-C-端氨基酸残基的分析：羧肽酶端氨基酸残基的分析：羧肽酶羧肽

18、酶羧肽酶是肽链外切酶（是肽链外切酶（exopeptidaseexopeptidase）它专门催化水解肽链末端（即它专门催化水解肽链末端（即C-C-端）的肽键。端）的肽键。羧肽酶羧肽酶A A水解断裂那些不是水解断裂那些不是ArgArg（精）（精）和和LysLys（赖）（赖）的的C-C-端氨基酸端氨基酸羧肽酶羧肽酶B B只水解断裂只水解断裂C-C-端为端为ArgArg或或LysLys的氨基酸的氨基酸 多肽链的选择性水解多肽链的选择性水解(酶法和化学法酶法和化学法)化学法化学法溴化氰水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧溴化氰水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。基所形成的肽键。、采用重叠法、采用重

19、叠法采用重叠法得出整个肽链的氨基酸顺序采用重叠法得出整个肽链的氨基酸顺序Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-AlaGlyv 一个一个9肽其组成是肽其组成是2Gly、Tyr、Lys、Arg、Glu、Met、Leu、Ala；用；用DND-Cl 和羧肽酶法证明和羧肽酶法证明N、C两端分别为两端分别为Tyr和和Gly；v用蛋白酶水解得一组肽片段，测得各片段的氨基用蛋白酶水解得一组肽片段，测得各片段的氨基酸排列次序为：酸排列次序为：AlaGly、TyrLys、Glu-Met-Leu-Gly-Arg；v若用化学水解得另一组肽片段，各片段的顺序为：若用化学水解得另一组肽片段，各片段的顺序

20、为：Tyr-Lys-Glu-Met，Leu-Gly-Arg-AlaGly。试。试推测该推测该9肽中氨基酸的排列顺序（一级结构）肽中氨基酸的排列顺序（一级结构）四、生物活性肽四、生物活性肽（active peptide）v定义：是指在生物体内存在并具有活性的一类肽类。定义：是指在生物体内存在并具有活性的一类肽类。v现有：现有：神经肽、脑啡肽、催产素、加压素、谷胱甘肽、多神经肽、脑啡肽、催产素、加压素、谷胱甘肽、多肽生长因子、非蛋白质来源多肽肽生长因子、非蛋白质来源多肽v作用：在体内一般作用：在体内一般含量较少，结构多样含量较少，结构多样，却起着重要的生，却起着重要的生理作用。理作用。v动物体内控

21、制和调节代谢的激素（动物体内控制和调节代谢的激素（hormonehormone）、脑内的神）、脑内的神经递质（经递质（neurotransmitterneurotransmitter）、微生物中的一些抗菌素）、微生物中的一些抗菌素（antibioticantibiotic）等都是肽类。）等都是肽类。v生命科学中的某些重要课题的研究生命科学中的某些重要课题的研究v例如例如细胞分化、肿瘤发生、生殖控制以及某些疾病的病因细胞分化、肿瘤发生、生殖控制以及某些疾病的病因与治疗等与治疗等，均涉及到，均涉及到活性肽活性肽的结构和功能。的结构和功能。第三节第三节 蛋白质蛋白质v一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的

22、元素组成v二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类v三、蛋白质的结构三、蛋白质的结构v四、蛋白质的理化性质四、蛋白质的理化性质 一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成v元素组成：碳元素组成：碳50505555，氢，氢8 8，氧，氧20202323，氮，氮13131919，硫，硫0 04 4v有些蛋白质还含有微量磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素有些蛋白质还含有微量磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素v其中其中氮的含量氮的含量在各种蛋白质中含量都比较接近，在各种蛋白质中含量都比较接近，平均为平均为1616v因此，只要测出生物样品中的含氮量，就可粗略计因此，只要测出生物样品中的含氮量，就可粗略计算出其蛋白质的含量算出

23、其蛋白质的含量v每每1g1g氮相当于蛋白质氮相当于蛋白质（一）根据化学组成分类（一）根据化学组成分类1 1、单纯蛋白质、单纯蛋白质(simple protein)(simple protein)组成：只由组成：只由-氨基酸氨基酸例如清蛋白、球蛋白、谷蛋白、精蛋白、硬蛋白等例如清蛋白、球蛋白、谷蛋白、精蛋白、硬蛋白等2 2、结合蛋白、结合蛋白(conjugated protein)(conjugated protein)组成：由组成：由单纯蛋白质单纯蛋白质和和非蛋白质非蛋白质(常称为常称为辅基辅基)两部分两部分常见的辅基：核酸、糖、脂、磷酸及色素等常见的辅基：核酸、糖、脂、磷酸及色素等包括：核蛋

24、白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白包括：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类（二）根据形状分类（二）根据形状分类1 1、球状蛋白质、球状蛋白质(globular protein)(globular protein)外形外形:接近球状，溶解度较好接近球状，溶解度较好例如：酶、免疫球蛋白等例如：酶、免疫球蛋白等 2 2、纤维状蛋白质、纤维状蛋白质(fibrous protein)(fibrous protein)外形外形:类似细棒或纤维，一般不溶于水类似细棒或纤维，一般不溶于水例例如如：毛毛发发中中的的角角蛋蛋白白，结结缔缔组组织织中中的的胶胶原原蛋蛋白白及及弹性

25、蛋白等弹性蛋白等（三）根据功能分类（三）根据功能分类1 1、活性蛋白质（、活性蛋白质（active proteinactive protein）此此类类是是指指在在生生命命运运动动中中一一切切具具有有生生物物活活性性的的蛋蛋白白质质和和它它们们的前体。的前体。例如：酶、运动蛋白、运输蛋白、激素蛋白和防御蛋白等例如：酶、运动蛋白、运输蛋白、激素蛋白和防御蛋白等2 2、结构蛋白质（结构蛋白质（structural proteinstructural protein）此类是指担负保护或支持作用的蛋白质此类是指担负保护或支持作用的蛋白质例如：角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白等例如：角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白

26、等三、蛋白质的结构三、蛋白质的结构（一）蛋白质的一级结构（一）蛋白质的一级结构（primary structure）v蛋白质的一级结构是指蛋白质的一级结构是指蛋白质中氨基酸残基之间的排列顺序蛋白质中氨基酸残基之间的排列顺序v一级结构是蛋白质的一级结构是蛋白质的基本结构基本结构v其主要化学键是其主要化学键是肽键肽键，又称，又称主键主键v例如，胰岛素例如，胰岛素v一级结构：由条一级结构：由条A A链链(21(21肽肽)和一条和一条B B链链(30(30肽肽)通过二硫键连通过二硫键连 接而成，分子中共有三个二硫键接而成，分子中共有三个二硫键v作作 用：降低体内血糖含量用：降低体内血糖含量v用用 途：

27、在临床上治疗糖尿病途：在临床上治疗糖尿病人胰岛素分子的一级结构人胰岛素分子的一级结构由由由由 51 51个氨基酸残基组个氨基酸残基组个氨基酸残基组个氨基酸残基组成成成成 A A、B B 二条多肽链。二条多肽链。二条多肽链。二条多肽链。A A 链内有一链内二硫键，链内有一链内二硫键，链内有一链内二硫键，链内有一链内二硫键，A A 链与链与链与链与 B B 链之间借链之间借链之间借链之间借 2 2 条二硫键相连。条二硫键相连。条二硫键相连。条二硫键相连。59蛋白质二级结构（蛋白质二级结构（secondary structure）v定义：是指多肽链的定义：是指多肽链的主链骨架主链骨架在空间盘曲折在空

28、间盘曲折叠形成的方式，并不涉及侧链叠形成的方式，并不涉及侧链R R基团的构象基团的构象v形式：形式：-螺旋、螺旋、-折叠层、折叠层、-转角和无规卷转角和无规卷曲等几种类型曲等几种类型v维系主链构象稳定的最主要因素是维系主链构象稳定的最主要因素是主链的羰主链的羰基基和和亚氨基亚氨基之间所形成的之间所形成的氢键氢键（二）蛋白质的空间结构（二）蛋白质的空间结构(二级、三级和四级结构)三级结构（三级结构（tertiary structure）v定定义义：是是蛋蛋白白质质分分子子在在二二级级结结构构基基础础上上进进一一步步盘盘曲曲折折叠叠形形成成的三维结构，是多肽链在空间的整体排布。的三维结构，是多肽链

29、在空间的整体排布。v三三级级结结构构的的形形成成和和稳稳定定主主要要靠靠侧侧链链R R基基团团的的相相互互作作用用，作作用用力力有以下几种：有以下几种：v（1 1）氢键）氢键v（2 2）盐键）盐键v（3 3）疏水作用力）疏水作用力v（4 4）Van der WaalsVan der Waals力力v（5 5）二硫键）二硫键四级结构（四级结构（quaternary structure）v四级结构：由四级结构：由两条或两条两条或两条以上具有以上具有三级结构的多肽三级结构的多肽链通过疏链通过疏水作用力、盐键等次级键相互缔合而成。水作用力、盐键等次级键相互缔合而成。v每一个具有三级结构的多肽链称为每一

30、个具有三级结构的多肽链称为亚基亚基（subunitsubunit）。）。v在蛋白质分子中，亚基的立体排布、亚基间相互作用与接触在蛋白质分子中，亚基的立体排布、亚基间相互作用与接触部位的布局称为四级结构（部位的布局称为四级结构（quaternary structurequaternary structure）。）。v四级结构不包括亚基内部的空间结构四级结构不包括亚基内部的空间结构v亚基：一般多为偶数亚基：一般多为偶数v 为为2 21010个时，是较小的蛋白质个时，是较小的蛋白质v 多的可达上千个多的可达上千个四、蛋白质的理化性质四、蛋白质的理化性质 v（一）蛋白质的两性电离和等电点（一）蛋白质的

31、两性电离和等电点v（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质v（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性v（四）蛋白质的沉淀（四）蛋白质的沉淀v（五）蛋白质的颜色反应（五）蛋白质的颜色反应（一）蛋白质的两性电离和等电点（一）蛋白质的两性电离和等电点pH pH pI pH=pI pHpI pH=pI pHpIpI阳离子阳离子 电中性电中性 阴离子阴离子 （二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质v蛋白质的分子量：有的可达数千万蛋白质的分子量：有的可达数千万v水中形成的颗粒直径：水中形成的颗粒直径：1 1lOOnmlOOnmv有胶体溶液的性质，不能通过半透膜有胶体溶液的性质，不能通过半透膜v可用半透

32、膜将蛋白质与小分子物质分离而得以纯化可用半透膜将蛋白质与小分子物质分离而得以纯化v这种方法称为这种方法称为透析法透析法v透析法透析法是实验或工业生产上提取和纯化蛋白质常用的方法是实验或工业生产上提取和纯化蛋白质常用的方法（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性v是指蛋白质是指蛋白质v在某些在某些物理或化学物理或化学因素的作用下因素的作用下v其空间结构遭到破坏其空间结构遭到破坏v致使致使蛋白质生物活性丧失蛋白质生物活性丧失和和理化性质改变理化性质改变引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的因素v物物理理因因素素有有：加加热热、紫紫外外线线照照射射、超超声声波波和和剧烈振摇等剧烈振摇等v化化学学因因素素有

33、有：强强酸酸、强强碱碱、有有机机溶溶剂剂、重重金金属盐等属盐等变性蛋白质变性蛋白质(denatured protein)v变性作用并不破坏蛋白质的一级结构变性作用并不破坏蛋白质的一级结构v变性蛋白质的表现：变性蛋白质的表现：v首首先先是是失失去去生生物物活活性性。如如血血红红蛋蛋白白失失去去运运输输氧氧的的功功能，胰岛素失去调节血糖的功能，酶失去催化能力等能，胰岛素失去调节血糖的功能，酶失去催化能力等v其其次次是是各各种种理理化化性性质质的的改改变变。如如溶溶解解度度降降低低，易易于沉淀等。于沉淀等。变性蛋白质（变性蛋白质（2 2种）种）v1 1、可逆变性、可逆变性v当当变变性性蛋蛋白白质质去

34、去掉掉变变性性因因素素后后，能能恢恢复复原原有有性性质，这种变性称为质，这种变性称为可逆变性可逆变性或称或称复性复性v2 2、不可逆变性、不可逆变性胃蛋白酶胃蛋白酶v加热到加热到8090v就失去其消化蛋白质的功能就失去其消化蛋白质的功能v当把温度回调到当把温度回调到37，则其功能又可恢复。，则其功能又可恢复。v目前很多蛋白质变性后尚不能复性，如机目前很多蛋白质变性后尚不能复性，如机体衰老时的蛋白质变性尚属不可逆过程。体衰老时的蛋白质变性尚属不可逆过程。变性作用的实际意义变性作用的实际意义v一是一是防止蛋白质激素、酶、抗体、疫苗等活性防止蛋白质激素、酶、抗体、疫苗等活性蛋白质在生产和保存过程中变

35、性，以保持其生蛋白质在生产和保存过程中变性，以保持其生物活性物活性v二是变性原理可用于灭菌等二是变性原理可用于灭菌等（四）蛋白质的沉淀（四）蛋白质的沉淀 调节蛋白质溶液的调节蛋白质溶液的pH值至等电点值至等电点,再加入适当的再加入适当的脱水剂除去蛋白质分子表面的水化膜脱水剂除去蛋白质分子表面的水化膜,可使蛋白质分可使蛋白质分子聚集而从溶液中沉淀析出。子聚集而从溶液中沉淀析出。沉淀蛋白质的方法：沉淀蛋白质的方法：l盐析盐析常用常用(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl、MgSO4等等 l有机溶剂有机溶剂常用甲醇、乙醇、丙酮等亲水性溶剂常用甲醇、乙醇、丙酮等亲水性溶剂l重金属盐重金属盐常用常用

36、 Ag+、Cu2+、Pb2+等等l常用的酸常用的酸：苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等上页上页下页下页首页首页761、盐析法、盐析法（salting out）v盐析法盐析法是指加盐使蛋白质沉淀析出现象的方法。即，是指加盐使蛋白质沉淀析出现象的方法。即，v分段盐析法分段盐析法是指调节盐浓度可使混合蛋白质先后析出的方法。是指调节盐浓度可使混合蛋白质先后析出的方法。v常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠等常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠等v原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜v 中和了蛋白质分子的电荷中和了蛋白质分子的电荷v一般用盐析沉淀出来的蛋

37、白质不变性。一般用盐析沉淀出来的蛋白质不变性。v血清中加硫酸铵至血清中加硫酸铵至50饱和度，则饱和度，则球蛋白球蛋白先沉淀析出，先沉淀析出，加硫酸铵至饱和，则加硫酸铵至饱和，则清蛋白清蛋白沉淀析出沉淀析出2、加有机溶剂、加有机溶剂v有：乙醇、丙酮等有：乙醇、丙酮等v原理：由于这些溶剂对水的亲和力强于蛋白质分原理：由于这些溶剂对水的亲和力强于蛋白质分子而破坏了蛋白质周围的水化膜，使蛋白质沉淀子而破坏了蛋白质周围的水化膜，使蛋白质沉淀v在蛋白质的在蛋白质的pI时，加入这些溶剂则沉淀效果更好时，加入这些溶剂则沉淀效果更好3、加重金属盐、加重金属盐v有：硝酸银、醋酸铅及氯化高汞等有：硝酸银、醋酸铅及氯

38、化高汞等v原理：这是因为蛋白质在原理：这是因为蛋白质在pHpI的溶液中带负的溶液中带负电荷，可与这些重金属正离子结合成不溶性的电荷，可与这些重金属正离子结合成不溶性的蛋白盐而沉淀。蛋白盐而沉淀。4、加生物碱试剂、加生物碱试剂v有：苦味酸、三氯醋酸、鞣酸和磺柳酸等有：苦味酸、三氯醋酸、鞣酸和磺柳酸等v原理：这是由于蛋白质在原理：这是由于蛋白质在pHpI的溶液中带正电的溶液中带正电荷，可与这些有机酸根结合成不溶性的蛋白盐而荷，可与这些有机酸根结合成不溶性的蛋白盐而沉淀。沉淀。反应名称反应名称试剂试剂颜色颜色作用基团作用基团缩二脲反应缩二脲反应强碱、稀硫酸铜溶液强碱、稀硫酸铜溶液紫色或紫红色紫色或紫

39、红色肽键肽键茚三酮反应茚三酮反应稀茚三酮溶液稀茚三酮溶液蓝紫色蓝紫色氨基氨基蛋白黄反应蛋白黄反应浓硝酸、再加碱浓硝酸、再加碱深黄色或橙红深黄色或橙红色色苯环苯环MillonMillon反应反应硝酸亚汞、硝酸汞和硝酸亚汞、硝酸汞和硝酸混合液硝酸混合液红色红色酚羟基酚羟基亚硝酰铁氰化钠反亚硝酰铁氰化钠反应应亚硝酸铁氰化钠溶液亚硝酸铁氰化钠溶液红色红色 巯基巯基(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应第四节第四节 酶的化学酶的化学酶的定义酶的定义:酶的结构特点酶的结构特点(4(4点点)酶的催化效能酶的催化效能(三点三点)酶催化的立体专一性酶催化的立体专一性蛋白组学蛋白组学PS1PS1平台平台vPro

40、teomics Solution I SystemSymBiot I SymBiot I 自动加样系统自动加样系统MALDIMALDITOF TOF 质谱仪质谱仪特点特点vDE技术技术v借助反射镜使飞行长度增加到借助反射镜使飞行长度增加到2m，提高了质量分辩率和测量，提高了质量分辩率和测量结果的结果的准确性准确性v反射镜校正了在离子源时离子的初始速度分布，减小了相同反射镜校正了在离子源时离子的初始速度分布，减小了相同质量的离子在动能上的差别质量的离子在动能上的差别vVoyager-DE-PRO使离子通过反射镜后并在源后裂解使离子通过反射镜后并在源后裂解PSD进进行肽的测序，获得真实的行肽的测序

41、，获得真实的MS/MS数据数据v可通过碰撞诱导解离可通过碰撞诱导解离(CID)来增加裂解的程度，从而获得更多来增加裂解的程度，从而获得更多的结构信息的结构信息v包括操作和数据系统软件：自动调整仪器、采集数据、处理包括操作和数据系统软件：自动调整仪器、采集数据、处理数据、打印报告数据、打印报告应用应用v蛋白质精确分子量测定蛋白质精确分子量测定v差异表达蛋白样品的鉴定差异表达蛋白样品的鉴定v重组蛋白药物的肽图分析重组蛋白药物的肽图分析v理论肽库构建及实际肽图比对分析理论肽库构建及实际肽图比对分析Data Explorer Data Explorer softwaresoftwareData Explorer softwareData Explorer softwarePMFPMF中的同位素峰中的同位素峰AutoMSAutoMSFit Fit 检索报告检索报告操作流程图操作流程图2D-GEL Image样品制备样品制备 2D Gel 电泳电泳图象分析图象分析差异点差异点MS鉴定鉴定已知已知未知！？未知！？