生物化学蛋白质之.ppt

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1、蛋白质化学之一氨基酸结构与功能主讲教师：张丽霞主讲教师：张丽霞大庆师范学院生命科学学院大庆师范学院生命科学学院目 录 蛋白质的分类 蛋白质的分子组成-氨基酸1.了解蛋白质的分类，掌握蛋白质元素组成的特点。2.掌握蛋白质的基本构件分子：氨基酸的结构特点，从各氨基酸的结构特点上理解氨基酸的分类。3.掌握氨基酸的理化性质，重点掌握两性电离与等电点含义、茚三酮反应及其应用。目的与要求一、蛋白质分类1.催化蛋白（酶)：2.调节蛋白：如胰岛素、生长素；3.转运蛋白：如血红蛋白、载脂蛋白、运铁蛋白等。4.运动蛋白：肌肉收缩，如肌球蛋白、肌动蛋白。（一）根据功能分类 蛋白质分类5.防御蛋白:如免疫球蛋白；6.

2、毒蛋白：如溶血蛋白；7.受体蛋白:如味觉蛋白、视觉蛋白；8.支架蛋白：如SH2;9.结构蛋白：10.异常蛋白：如甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能。（二）、根据分子形状分类1.球状蛋白质2.纤维状蛋白质3.膜蛋白质（三）、根据分子组成分类（1）简单蛋白质：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白。（2）结合蛋白质：色素蛋白、金属蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。1.完全蛋白质2.不完全蛋白质（四）、根据营养价值分类二、蛋白质的水解1.酸水解 条件：5-10倍的20%的盐酸煮沸回流16-24小时，或加压于120水解2小时。优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L-

3、氨基酸，产物单一，无消旋现象。缺点：色氨酸破坏，腐黑质，水解液呈黑色。2.碱水解条件：4mol/L Ba(OH)2或6mol/L NaOH煮沸6小时。优点：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解液清亮。缺点：产生消旋产物，破坏的氨基酸多，一般很少使用。3.蛋白酶水解条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温37-40，pH值5-8。优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。缺点：水解不完全，中间产物多。蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。蛋白质的分子组成-氨基酸一、蛋白质的元素组成 蛋白质是有机化合物，离不开C、H、O三种元素，还含有N、P、S、金属元素等。含量(%)50-5

4、56-720-2315-170.3-3微量或无元素组成CHONS其它 蛋白质中N是特征元素，且含量恒定，为16%左右，即16克氮/100克蛋白质，故可以用凯氏定氮法测定样品中总氮含量和无机氮含量,求出样品中蛋白质含量;即：蛋白质含量=(总氮含量-无机氮含量式中，即16%的倒数，为1g氮相当于蛋白质的量（克数）。有些蛋白质含有其他微量元素：P、Fe、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、I 等。二、蛋白质分子的基本组成单位-氨基酸（一）氨基酸的结构通式：1、构成蛋白质的氨基酸均为L-氨基酸。2、除R为H（甘氨酸）外，其余氨基酸均具有旋光性。3、各种氨基酸的区别在于侧基R基上。从氨基酸的结构通式可以看出：

5、（二）氨基酸的构型：构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外，均含有-碳原子，在空间各原子有两种排列方式：L-构型与D-构型，互为镜像关系。（三）氨基酸的结构与分类1.按氨基酸分子中羧基与氨基的数目分：（1）酸性氨基酸及酰胺：一氨基二羧基氨基酸，有：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;（2）碱性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸，有：赖氨酸、精氨酸、组氨酸;（3）中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸。天冬氨酸 （Asp,D）天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）谷氨酸 （Glu,E）酸性氨基酸及酰胺碱性氨基酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸 （Arg,R）组氨酸 （His,H）中性氨基酸甘氨酸 (Gly,G）丙

6、氨酸 （Ala,A）缬氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸 （Ile,I）丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 (Met,M）中性氨基酸2、按侧基R基的结构特点分：（1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（3）杂环氨基酸：脯氨酸、组氨酸中性脂肪族氨基酸甘氨酸 (Gly,G）丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸 （Ile,I）含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,SSer,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,TThr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,CCys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 (

7、Met,MMet,M）组氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）杂环氨基酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trg,W）芳香族氨基酸3、按侧基R基与水的关系分：（1）非极性氨基酸：有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。（2）极性不带电氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。（3）极性带电氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。4、按氨基酸是否能在人体内合成分：（1）必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有八种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。（2

8、）非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十种。（3）半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要的氨基酸，有：组氨酸、精氨酸。注：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸注：二十种氨基酸的结构特点含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含-氨基的氨基酸：赖氨酸（四）蛋白质中不常见的氨基酸 羟-脯氨酸 羟-赖氨酸 r-羧基谷氨酸 6-氮-甲基赖氨酸（五）非蛋白氨基

9、酸 鸟氨酸 胍氨酸 高半胱氨酸 高丝氨酸 -丙氨酸 -氨基丁酸等 三.氨基酸的理化性质（一）物理性质1.形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。3.熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。4.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。5.光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收。（二）化学性质1.两性电离及等电点：氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可电离出H+，所以氨基酸具有酸碱两性性质。通常情况下，氨基酸以两性离子的形式

10、存在，如下图所示：从上图可知：氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。在某一pH环境下，以两性离子（兼性离子）的形式存在。该pH称为该氨基酸的等电点。所以氨基酸的等电点可以定义为：氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH。氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被碱滴定，应该具有两性电离的性质，现以甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点。一氨基一羧基一氨基一羧基AA的等电点的等电点计算：计算：pI=2pK1+pK2左图是甘氨酸的电离酸碱滴定曲线，从左向右是用NaOH滴定的曲线，溶液的pH由小到大逐渐升高；从右向左是用盐酸滴定的曲线，溶液的pH由大到小逐渐降低。曲线中从

11、左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50%的状态，第二个拐点是氨基酸的等电点，第三个拐点是氨基酸氨基解离50%的状态。一氨基二羧基一氨基二羧基AA的的等电点计算：等电点计算：pI=2pK1+pK2二氨基一羧基二氨基一羧基AA的的等电点计算：等电点计算：pI=2pK2+pK3谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算 在酸性条件下，丙氨酸以阳离子形式存在，可以看作是一个二元弱酸，有两个可以解离的H+，即COOH上的H+和NH3上的H+。物质的解离常数是用滴定曲线的实验方法求得，画出曲线。加入酸碱使丙氨酸的净电荷等于0时，丙氨酸所带的正负电荷相等，这时的pH值就是丙氨酸的等电点。PI:两性电解质所

12、带正负电荷相等时溶液的pH值。PI=两性离子状态两侧的基团的PK值之和的一半（）中性氨基酸：pI=(pK1+pK2)/2pK1为-羧基的解离常数,pK2为-氨基的解离常数。氨基酸等电点的计算2.由-氨基参加的反应：(1)与亚硝酸反应：放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚硝酸，在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量，此反应可用于测定蛋白质的水解程度。(2)与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。2.由-氨基参加的反应：(3)(3)与与2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（2,4-DN

13、FB2,4-DNFB）的反应）的反应（SangerSanger反应）：生成黄色的二硝基苯反应）：生成黄色的二硝基苯-氨基酸衍氨基酸衍生物。生物。(4)(4)与苯异硫氰酸酯与苯异硫氰酸酯（PITCPITC）反应（）反应（EdmanEdman反应）：反应）：生成苯乙内酰硫脲生成苯乙内酰硫脲-氨基酸。氨基酸。(5)(5)与丹磺酰氯与丹磺酰氯（DNS-ClDNS-Cl）的反应：生成荧光物）的反应：生成荧光物质质DNS-DNS-氨基酸。氨基酸。(3)、(4)、(5)反应用于蛋白质的N-末端的测定。2.由-氨基参加的反应：羧基参加的反应：(1)与碱反应成盐 (2)与醇反应成酯(3)与酰化试剂反应成酰氯 氨

14、基与氨基与-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应 与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成基酸生成蓝紫色化合物蓝紫色化合物。脯氨酸脯氨酸与与羟脯氨酸羟脯氨酸为为黄色化合物黄色化合物。(1)Millon反应：检测Tyr或含Tyr的蛋白质的反应。Millon试剂：汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液。产物：红色的化合物。(2)Folin反应：检测Tyr或含Tyr的蛋白质的反应。Folin试剂：磷钼酸、磷钨酸混合溶液。产物：蓝色的钼蓝、钨蓝。(3)坂口反应：检测Arg或含Arg的蛋白质的反应。坂口试剂：-萘酚的碱性次溴酸钠溶液。产物：砖红色的沉淀。

15、5.侧链反应（颜色反应）：(4)Pauly反应：检测His、Tyr及含His、Tyr蛋白质的反应。试剂：对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液.产物：橘红色的化合物。(5)乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层现象，界面出现紫色环。(6)Cys的反应：Cys或含Cys蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶液中，产生一种红色的化合物。四.氨基酸的分离测定（一）层析法 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。当流动相流进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。常见的层析法有：滤纸层析、薄层层析、离子交换层析、亲和层析（二）电泳法 电泳是指带电的颗粒在电场中向着以其颗粒所带电荷相反的电极移动的现象。生物化学主讲教师：张丽霞主讲教师：张丽霞大庆师范学院生命科学学院大庆师范学院生命科学学院