现代分子生物学复习.ppt

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1、2012分子生物学复习要点分子生物学研究的基本定理分子生物学研究的基本定理：1.构构成成生生物物体体有有机机大大分分子子的的单单体体在在不不同同生生物物中都是相同的；中都是相同的；2.生生物物体体内内一一切切有有机机大大分分子子的的构构成成都都遵遵循循共共同的规则同的规则；3.某某一一特特定定生生物物体体所所拥拥有有的的核核酸酸及及蛋蛋白白质质分分子决定了它的属性。子决定了它的属性。在在凝凝胶胶电电泳泳中中，加加入入溴溴化化乙乙锭锭（ethidiumbromide，EtBr）染染料料对对核核酸酸分分子子进进行行染染色色，然然后后放放置置在在紫紫外外光光下下观观察察，可可灵灵敏敏而而快快捷捷地地

2、检检测测出出凝凝胶胶介介质质中中DNA的的谱谱带带部部位位，即即使使每每条条DNA带带中中仅仅含含有有g的的微微量量DNA，也可以被清晰地检测出来。，也可以被清晰地检测出来。溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧光，易于鉴定。荧光，易于鉴定。组蛋白的一般特性：进化上的保守性保守程度：H1 H2A、H2B H3、H41、组蛋白 上海生化所分子遗传学1998年试题：在真核生物核内

3、。五种组蛋白（H1 H2A H2B H3 和H4）在进化过程中，H4极为保守，H2A最不保守（）简述真核生物染色体上组蛋白的种类，组蛋白修饰的种类及其生物学意义中国科学院2003年硕士研究生入学生物化学与分子生物学试题2)C值反常现象（C-value paradox)C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。C值矛盾上海第二军医大硕士研究生入学考试试题：基因组的特点（真核、原核比较）（五）原核生物和真核生物基因组结构特点比较DNA双螺旋模型是哪年由谁提出的?简

4、述其基本内容.为什么说该模型的提出是分子生物学发展史上的里程碑,具有划时代的贡献?浙江大学医学院2003生物化学（硕士）1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。（一）DNA的半保留复制（semi-conservative replication）3、DNA半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)：拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转

5、录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶1 1、双链的解开、双链的解开 DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori(或o）、富含A、T的区段。基本概念：上海生化所1998年分子遗传学试题：真核生物复制起始点的特征包括（）A富含GC区 B富含AT区 C Z DNA D无明显特征DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication)DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。在DNA复制时，合成

6、方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。3、DNA链的延伸链的延伸 在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。四、DNA的修复 (DNArepairing)DNADNA修复是细胞对修复是细胞对DNADNA受损伤后的一种反应，但有时并非能完全受损伤后的一种反应，但有时并非能完全消除消除DNADNA的损伤，只是使细胞能够耐受这的损伤，只是使细胞能够耐受这DNADNA的损伤而能继续生存。的损伤而能继续生存。DNA损伤来源损伤来源

7、1 1、碱基的脱落（酸和热）、碱基的脱落（酸和热）2 2、碱基或核苷的改变（电离辐射和烷化剂等）、碱基或核苷的改变（电离辐射和烷化剂等）3 3、错误碱基、错误碱基4 4、碱基的缺失或插入、碱基的缺失或插入5 5、嘧啶碱基的二聚化、嘧啶碱基的二聚化6 6、链的断裂（化学试剂或电离辐射）、链的断裂（化学试剂或电离辐射）7 7、DNADNA链的交联链的交联大肠杆菌中大肠杆菌中DNA的修复系统的修复系统DNADNA修复系统修复系统功功 能能错配修复错配修复(mismatch repair)(mismatch repair)恢复错配恢复错配切除修复切除修复(碱基、核苷酸切除碱基、核苷酸切除修复修复)切除

8、突变的碱基和核苷酸片段切除突变的碱基和核苷酸片段重组修复重组修复(recombinant repair)(recombinant repair)复制后的修复，重新启动停滞复制后的修复，重新启动停滞的复制叉的复制叉DNADNA直接修复直接修复(direct repair)(direct repair)修复嘧啶二体或甲基化修复嘧啶二体或甲基化DNADNASOSSOS系统系统DNADNA的修复，导致变异的修复，导致变异 扼要说明细胞中扼要说明细胞中DNA修复系统有哪几种（修复系统有哪几种（8分）分）中国科学院中国科学院2002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题年硕士学位研究生入学分子遗传学试题5 5

9、、SOSSOS反应（反应（SOS responseSOS response）nSOS反应是反应是细胞细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑受到损伤或复制系统受到抑制制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。急措施。nSOS反应包括诱导反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与胞癌变也与SOS反应有关。反应有关。nSOS反应广泛存在于原核和真核生物中，主要反应广泛存在于原核和真核生物中，主要包括两个方面：包括两个方面：DNA的修复的修复，利

10、于细胞的存活，具有重要意，利于细胞的存活，具有重要意义；义；产生变异，可能产生不利的后果，如导致细胞产生变异，可能产生不利的后果，如导致细胞的癌变。的癌变。DNA复制具有那些特点复制具有那些特点?复制是复制是半保留半保留的。的。原核生物一般只有一个复制原点，真核生物有多个复原核生物一般只有一个复制原点，真核生物有多个复制原点。制原点。复制可复制可单向单向进行，也可进行，也可双向双向进行，后者更为常见。进行，后者更为常见。复制是复制是半不连续半不连续的，两条链都是以的，两条链都是以5 3 方向合成，方向合成，其中，前导链是连续合成的，随从链其中，前导链是连续合成的，随从链(滞后链滞后链)是不连续

11、是不连续合成的，即先合成短的合成的，即先合成短的冈崎片段冈崎片段，再连接成随从链。，再连接成随从链。复制开始时需要一段复制开始时需要一段引物引物RNA，在复制进行到一定程，在复制进行到一定程度后被度后被切除切除，并以一段，并以一段DNA代替。代替。复制具有严格的保证复制准确性的机制。在复制过程复制具有严格的保证复制准确性的机制。在复制过程中，有中，有多种酶和蛋白质多种酶和蛋白质参与，可能就是保证复制准确参与，可能就是保证复制准确性所必需的，性所必需的，DNA聚合酶的校正聚合酶的校正作用，也可能是保证作用，也可能是保证复制准确性的数种途径之一。复制准确性的数种途径之一。（二）转座子的类型和结构特

12、征1.原核生物转座子的类型：1、插入序列、插入序列(insertionalsequence,IS)2、复合转座子、复合转座子(compositetransposon)3、TnA家族家族插入序列（插入序列（插入序列（插入序列（insertionalsequence,ISinsertionalsequence,IS）P P5757 1.最简单的转座子最简单的转座子,不含有任何宿主基因。不含有任何宿主基因。2.是很小的是很小的DNA片段片段(约约1 1kb)，末端具有倒置重复末端具有倒置重复 序列。序列。3.转座时常复制宿主靶位点转座时常复制宿主靶位点4 41515bp的的DNA形成正形成正向重复区

13、。向重复区。4.大部分大部分IS序列只有一个开放读码框。序列只有一个开放读码框。5.是细菌染色体或质粒是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。的正常组成部分。以基因的形式荷载遗传信息，是生命遗传的物以基因的形式荷载遗传信息，是生命遗传的物质基础质基础。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存（DNA复制）。作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动的信息基础。的信息基础。DNA的生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生物个体性状（基因表达）。DNA的基本功能：的基本功能：基因表达基因表达(gen

14、eexpression)：是指细胞在生命过程：是指细胞在生命过程中中,把储存在把储存在DNA顺序中遗传信息经过顺序中遗传信息经过转录转录和和翻译翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。转变成具有生物活性的蛋白质分子。转录模板 DNA分子上转录出分子上转录出RNA的区段，称为的区段，称为结构基因。结构基因。一一段段从从启启动动子子开开始始至至终终止止子子结结束束的的DNA序序列列为为一一个个转录单元转录单元。DNA双双链链按按碱碱基基配配对对规规律律能能指指引引转转录录生生成成RNA的的一一股股单单链链，称称为为模模板板链链(templatestrand)，也也称称作作反意义链反意义链或或Wast

15、on链链。相相对对的的另另一一股股单单链链是是编编码码链链(codingstrand)，也也称为称为有意义链有意义链或或Crick链链。u转录与复制的相似之处：转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都是酶促的核苷酸聚合过程；都以都以DNA为模板；为模板；都需依赖都需依赖DNA的聚合酶；的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从都从5至至3方向延伸成新链多聚核苷酸；方向延伸成新链多聚核苷酸；都遵从碱基配对规律都遵从碱基配对规律但转录忠实性要低于但转录忠实性要低于DNA复制复制。转录与复制都受到严格的调控转录与复制都受到严格的调控二、转录与

16、复制的异同 u转录和复制的区别转录和复制的区别引物引物有有无无高度进行性高度进行性中途不停止中途不停止可一段一段复制可一段一段复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链子代双链DNA（半保留复制）半保留复制）产物产物RNA聚合酶（聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶聚合酶酶酶NTPdNTP原料原料模板链转录（不对称转录）模板链转录（不对称转录）两股链均复制两股链均复制模板模板转录转录复制复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链子代双链DNA（半保留复制）半保留复制）产物产物RNA聚合酶（聚合酶（RNA-pol

17、）DNA聚合酶聚合酶酶酶NTPdNTP原料原料模板链转录（不对称转录）模板链转录（不对称转录）两股链均复制两股链均复制模板模板转录转录复制复制（一）（一）原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶RNA聚合酶（大肠杆菌为例）全酶=核心酶+因子第二节第二节DNA指导下的指导下的RNA聚合酶聚合酶核心酶核心酶(coreenzyme)全酶全酶(holoenzyme)第第三三节节与转录起始和终止有关的与转录起始和终止有关的DNA结构结构一、原核生物的启动子和终止子一、原核生物的启动子和终止子启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。5 3 3 5 结构基因结构基因调控序列调控序列

18、RNA-pol原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。（一）启动子结构（一）启动子结构转录单元转录单元1、Pribnow框：框：10区，保守序列为区，保守序列为TATAAT。Pribnow框框是是RNA聚合酶的牢固结合位点，聚合酶的牢固结合位点，u细菌中常见两种启动子突变：细菌中常见两种启动子突变：启动子上升突变，提高转录活性；启动子上升突变，提高转录活性；启动子下降突变，降低转录水平。启动子下降突变，降低转录水平。的存在保的存在保证原核生物原核生物RNA聚合聚合酶只能与启只能与启动子区而不是其它区域形成子区

19、而不是其它区域形成稳定的二元复合物。定的二元复合物。2、Sextama框：框：35区，保守序列为区，保守序列为TTGACA。Sextama框框是是RNA聚合酶中聚合酶中的识别位点，的识别位点，也是也是RNA聚合酶的初始结合位点。聚合酶的初始结合位点。lPribnow框与框与Sextama框之间的碱基序列并不重要，但框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距两个序列之间的距离十分重要；离十分重要；l天然启动子这段距离多为天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。素之一。l实验表明：两个序列之间的距离为实验表明：两个序列之间

20、的距离为17bp时，转录效率最高。时，转录效率最高。3、CAP位点位点：（乳糖：（乳糖操纵子的启动子序列）操纵子的启动子序列）vCAP即即分解代谢物基因激活蛋白分解代谢物基因激活蛋白(catabolitegeneactivationProtein)也称环腺苷酸受体蛋白（也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。）。uCAP分子内有两个结构域：分子内有两个结构域：羧基末端结构域是羧基末端结构域是DNA结合区；结合区；氨基末端结构域是氨基末端结构域是cAMP结合位点。结合位点。uCAP与与cAMP的结合能提高的结合能提高CAP对双链对双链DNA的亲和力；的亲和力；uCAP与启动子（与启动子（CAP位点）的结

21、合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。位点）的结合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。（二）终止子结构（二）终止子结构提供转录终止信号的序列称为终止子（提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）;终止信号存在于终止信号存在于RNA聚合酶已聚合酶已经转录过的序列之中。经转录过的序列之中。u原核生物终止子分为两类：原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于一类是不依赖于因子的转录终止；因子的转录终止；一类是一类是依赖依赖因子的转录终止；因子的转录终止；u两类终止子有共同的序列特征：两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。在转录终止点之前有一段间断的回文结构。u两类终止子

22、碱基组成的不同点：两类终止子碱基组成的不同点：不依赖不依赖因子因子 回文结构富含回文结构富含G-C G-C 下游富含下游富含A-TA-T 依赖依赖因子因子 G-CG-C含量较少含量较少 下游无特征下游无特征u类启动子分两部分：类启动子分两部分：405称为近启动子，决定转录起始的位点；称为近启动子，决定转录起始的位点；16540称为远启动子，影响转录的频率。称为远启动子，影响转录的频率。（一）（一）RNA聚合酶聚合酶的启动子的启动子即即rRNA基因的启动子，称基因的启动子，称类启动子。类启动子。二、真核生物的启动子和终止子二、真核生物的启动子和终止子真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复

23、杂，它和原核的启动子有很多不同（二）（二）RNA聚合酶聚合酶的启动子的启动子1、帽子位点（、帽子位点（capsite）：）：即转录起始位点，其碱基大多为即转录起始位点，其碱基大多为A。2、TATA框：框：又称又称Hogness框，位于框，位于25附近，由含有附近，由含有TATA的的67个核苷酸组成，保守序个核苷酸组成，保守序列为列为TATA（A/T）A（A/T）。但但TATA框的两侧富含框的两侧富含G-C碱基对。碱基对。即即mRNA基因的启动子，称基因的启动子，称类启动子类启动子l核心启动子元件核心启动子元件作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始。其序列的完整与准确对维持启作用：选择正确的

24、转录起始位点，保证精确起始。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。动子的功能是必需的。3、CAAT框：框：位于位于75附近，保守序列为附近，保守序列为GGNCAATCT。头两个。头两个G非常重要，一但突非常重要，一但突变，转录效率大大下降。变，转录效率大大下降。4、GC框：框：位于位于110附近，以附近，以5CCGCC3序列为特征。序列为特征。l上游启动子元件上游启动子元件作用：作用：控制着转录起始的频率。控制着转录起始的频率。5、增强子（、增强子（enhancer）：）：l能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性

25、表达，增强启动子转录活性的活性的DNA序列。序列。l 增强子作用特点增强子作用特点：增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应增强效应与其所处的位置和取向无关：与其所处的位置和取向无关：增强子以增强子以5353或或 3535排列对启动子都有作用。排列对启动子都有作用。大多为重复序列：长约大多为重复序列：长约50bp50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。强效应所必需。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。没有基因专一性。没有基因专

26、一性。许多增强子受外部信号的调控。许多增强子受外部信号的调控。五、五、RNA生物合成抑制剂生物合成抑制剂概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢 过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。l分三类：分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与、通过与DNA结合而改变模板的功能；结合而改变模板的功能；3、与、与RNA聚合酶结合而影响其活力。聚合酶结合而影响其活力。（一）利福霉素及利福平（一）利福霉素及利福平作用作用：抗结核药物，特异地抑制细菌：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶聚合酶的活性，因而抑制细菌的活性，因而抑制细菌RN

27、A的合成。的合成。机制机制：利福霉素可与利福霉素可与RNA聚合酶的聚合酶的亚基基结合，合，并阻止起始位点的填充，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸抑制二核苷酸RNA的形成；的形成；利福平利福平则阻止阻止RNA聚合聚合酶的移的移动，抑制，抑制头三个核苷酸的形成。三个核苷酸的形成。因此，因此，利福霉素和利福平都是利福霉素和利福平都是RNA链合成合成起始起始过程的抑制程的抑制剂。（二）利迪链菌素（二）利迪链菌素作用：作用：与细菌的与细菌的RNA聚合酶聚合酶亚基基结合，抑制合，抑制转录过程中程中RNA链的延的延长反反应。（三）（三）-鹅膏蕈碱膏蕈碱作用作用：抑制真核生物的：抑制真核生物的RNA聚合酶，

28、且聚合酶，且RNApol极为敏感。对细菌极为敏感。对细菌RNA聚合酶作用极弱。聚合酶作用极弱。一、一、mRNA的前体加工的前体加工1、5 端形成端形成帽子结构帽子结构(m7GpppNp)2、3 端加上端加上多聚腺苷酸尾巴多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)3、中部剪接、中部剪接除去内含子除去内含子4、链内部核苷酸的、链内部核苷酸的甲基化甲基化hnRNA转变成转变成mRNA的加工过程包括：的加工过程包括：修饰的化学反应：修饰的化学反应：5-端的修饰在核内完成，且在转录到端的修饰在核内完成，且在转录到20个核苷酸个核苷酸时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到5端的。先于中端的

29、。先于中段剪切。段剪切。5帽子分帽子分Cap0、Cap1、Cap2。（一）（一）5-端加上帽子结构端加上帽子结构(mGpppNp）真核生物mRNA的5末端的第一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。umRNA帽子的生理功能：帽子的生理功能：帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体小亚基识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。（二）（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。polyA的出现不依赖的出现不依赖DNA模板

30、。模板。加尾信号：加尾信号：3-末端出现末端出现AAUAAA及下游的及下游的GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内丰富区。在两序列之间由特异的核酸内切酶切除多余的核苷酸，然后加上切酶切除多余的核苷酸，然后加上polyA。尾部修饰和转录终止同时进行。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段中段的剪接。的剪接。polyA的有无及长短是维持的有无及长短是维持mRNA作为翻译模作为翻译模板的活性，以及增加板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。本身稳定性的因素。翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基

31、酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是蛋白质合成的原料是核糖体mRNAtRNA20种氨基酸一、遗传密码三联子（一）三联子密码定义 mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(tripletcoden)。mRNA5GCUAGUACAAAACCU3（三）遗传密码的性质1、简并性由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。2、同工tRNA（三）tRNA的种类 代表同一种氨基酸的tRNA称

32、为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别（P112）。无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。mRNA结合部位小亚基结合或

33、接受AA-tRNA部位（A位）大亚基结合或接受肽基tRNA的部位大亚基肽基转移部位（P位）大亚基形成肽键的部位（转肽酶中心）大亚基 四、蛋白质合成的过程氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工(一)氨基酸的活化氨基酸氨基酸+tRNA氨基酰氨基酰-tRNAATPAMPPPi氨基酰氨基酰-tRNA合成酶合成酶第一节第一节基因操作的主要技术基因操作的主要技术原理原理1核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正

34、比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。7.PCR技术（基因的体外扩增法）(1).概念PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。经过经过n轮轮PCR扩增扩增循环循环,理论上理论上可以得到可以得到2n个个新生的新生的DNA分子。分子。特别注意：特别注意：(2).一个PCR体系的基本组成超纯水缓冲液Mg2+dNTPsDNA模板引物TaqD

35、NA聚合酶作业:1、用Sanger双脱氧链终止法进行DNA自动序列分析(即DNA测序分析)的原理。2、PCR技术原理。3、转化子的蓝白筛选原理。原位杂交技术原位杂交原位杂交(InSituHybridization，ISH)是是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上色体上对核酸进行定位和相对定量研究对核酸进行定位和相对定量研究的的一种手段，分为一种手段，分为RNA原位杂交原位杂交染色体原位杂交。染色体原位杂交。RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛

36、、生物素等）标记的特异性探针与地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双分子，两者杂交产生双链链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。分析。基因芯片及数据分析基因芯片（基因芯片（DNAchip），又称），又称DNA微阵列微阵列（DNAmicroarray）技术是能同时监测大）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平

37、上阐述不同生物组织或细地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。胞中各种转录本的变化规律。一、原核生物基因表达调控总论一、原核生物基因表达调控总论原核生物基因调控一般执行如下规律原核生物基因调控一般执行如下规律一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。基因的开与关是相对的。基因的开与关是相对的。开开-关的活性可以通过转录水平上进行调节。关的活性可以通过转录水平上进行调节。基因表达调控主要表现在二个方面基因表达调控主要表现在二个方面转录水平上的调控转录水平上的调控转录后水平上的调控转录后水平上的调控转录水平上的调控转录水平上的调控负转录调控负

38、转录调控（negativetrnscriptionregulation)调节基因的产物是阻遏蛋白调节基因的产物是阻遏蛋白正转录调控（正转录调控（positivetranscriptionregulation)调节基因的产物是激活蛋白调节基因的产物是激活蛋白负转录调控负转录调控负控诱导负控诱导阻遏蛋白不与效应物阻遏蛋白不与效应物结合时基因不转录。结合时基因不转录。负控阻遏负控阻遏阻遏蛋白与效应物结阻遏蛋白与效应物结合时，基因不转录。合时，基因不转录。正转录调控正转录调控正控诱导正控诱导有效应物时，激活蛋白有效应物时，激活蛋白处于活性状态基因转录。处于活性状态基因转录。正控阻遏正控阻遏有效应物时，

39、激活蛋有效应物时，激活蛋白处于无活性状态基白处于无活性状态基因不转录。因不转录。负控诱导负控诱导负控阻遏负控阻遏正控诱导正控诱导正控阻遏正控阻遏弱化子弱化子在操纵区与结构基因之间的一段可以在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录终止转录作用的核苷酸序列，称为弱化子。作用的核苷酸序列，称为弱化子。B、弱化子对基因活性的影响、弱化子对基因活性的影响有葡萄糖的存在即使在培养基中加入乳糖、半乳有葡萄糖的存在即使在培养基中加入乳糖、半乳糖等诱导物，操纵子也不会启动，这种现象称为糖等诱导物，操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。C、降解物对基因活性的

40、调节、降解物对基因活性的调节当细菌生长过程中，氨基酸全面缺乏时，细菌将会当细菌生长过程中，氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生应急反应，停止全部基因的表达。产生应急反应，停止全部基因的表达。产生应急反应的信号是鸟苷四磷酸产生应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五和鸟苷五磷酸（磷酸（pppGpp），是由空载的），是由空载的tRNA所引起的所引起的。D、细菌的应急反应、细菌的应急反应空载空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大大量合成，量合成，ppGpp的出现会关闭许多基因，的出现会关闭许多基因，PpGpp与与pppGpp的作用能够影响一大批操纵的作用能够影响一大批

41、操纵子，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。子，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。5、环腺苷酸受体蛋白对转录的调控、环腺苷酸受体蛋白对转录的调控cAMP受受 体体 蛋蛋 白白 CRP（cAMP receptorprotein），cAMP与与CRP结结合合后后所所形形成成的的复复合合物称激活蛋白物称激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）。）。二、乳糖操纵子二、乳糖操纵子法国法国Jacob和和Monod等人等人1961年提出年提出(lacoperon)学说学说。JacobMonod乳糖乳糖(lac)操纵子的表达调控操纵子的表达调控1、阻遏蛋白的负性调控、阻遏蛋白的负性调控没有乳糖

42、时，没有乳糖时，1ac操纵子处于阻遏状态。操纵子处于阻遏状态。i基因在自身的基因在自身的启动子启动子Pi控制下，产生阻遏蛋白控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与以四聚体形式与操纵子操纵子o结合，阻碍结合，阻碍RNA聚合酶与启动子聚合酶与启动子P的结合。的结合。2、CAP的正性调控的正性调控cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖供给能量时，利用葡萄糖供给能量时，cAMP含量降低；无含量降低；无葡萄糖时，葡萄糖时，cAMP含量升高。含量升高。cAMP与与CRP结合变为结合变为CAP，并以二聚体的方，并以二聚体的方式与特定的式与特定的DNA序列结合

43、。序列结合。三、半乳糖（三、半乳糖（gal)操纵子操纵子不同于不同于lac操纵子操纵子,没有葡萄糖时可以被诱导没有葡萄糖时可以被诱导,有葡萄糖存在有葡萄糖存在时时gal也能被诱导，因此认为也能被诱导，因此认为gal中可能存在两个启动子。中可能存在两个启动子。(二二)弱化子及其作用弱化子及其作用当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。这种调控现象与色氨酸操纵子特浓度呈负相关。

44、这种调控现象与色氨酸操纵子特殊的结构有关。殊的结构有关。先导序列含有先导序列含有3对反向重复序列，在被转录生成对反向重复序列，在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构，使转录终止。时都能够形成发夹式结构，使转录终止。、终止转录的作用（弱化机制）、终止转录的作用（弱化机制）A.当色氨酸浓度低时，生成的当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp量就少，使核量就少，使核糖体沿糖体沿mRNA翻译移动的速度慢，赶不上翻译移动的速度慢，赶不上RNA聚合聚合酶沿酶沿DNA移动转录的速度，这时核糖体占据移动转录的速度，这时核糖体占据1位的机位的机会较多，使会较多，使1、2不能配对，不能配对，2、3配对，阻止了配

45、对，阻止了3、4生成终止信号的结构，生成终止信号的结构，trp操纵元处于开放状态。操纵元处于开放状态。B.当色氨酸浓度增高时，核糖体沿当色氨酸浓度增高时，核糖体沿mRNA翻译移翻译移动的速度加快，占据到动的速度加快，占据到2段的机会增加，段的机会增加，2、3配对配对的机会减少，的机会减少，3、4形成终止结构的机会增多，转录形成终止结构的机会增多，转录减弱。减弱。C.当所有氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度当所有氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于的序列，结果有利于1、2和和3、4发夹结构的形成，于是转录停止。等于告诉细发夹结构的形成

46、，于是转录停止。等于告诉细菌：菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量合成蛋白质，不如不合成以节省能量”。原核与真核生物基因表达的原核与真核生物基因表达的差异差异RepeptitivegeneOverlappinggeneSplittinggenenointronPost-transcriptiontranscription&translationRNAprocessingsynchronizelyEukaryote Eukaryote Prokaryote DNA+histonchromatinNakedDNA回顾回顾

47、回顾回顾原核生物与真核生物基因原核生物与真核生物基因表达调控机制具有惊人的相似性表达调控机制具有惊人的相似性共同的起源与共同的分子基础共同的起源与共同的分子基础调控机理上调控机理上调控层次上调控层次上核酸分子间的互作核酸分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作transcriptionallevelposttranscriptionalleveltranslationallevelposttranslationallevel真核生物主要采用正控制模式真核生物主要采用正控制模式无无调节蛋白存在蛋白存在时，基因关，基因关闭有有调节蛋白存在蛋白

48、存在时，基因开启，基因开启n n真核真核RNApol对其启其启动子的子的亲和性和性n n转录的启的启动是依是依赖多种激活蛋白的作多种激活蛋白的作用（与多个用（与多个顺式元件式元件结合）。合）。真核生物正调控的必要性和优真核生物正调控的必要性和优越性越性n n特异性特异性特异性特异性:真核基因真核基因真核基因真核基因组组很大很大很大很大,某种某种某种某种顺顺式元件出式元件出式元件出式元件出现现的几率高。的几率高。的几率高。的几率高。这这种情况下种情况下种情况下种情况下,保保保保证证基因特异表达的方法之一是使用多个基因特异表达的方法之一是使用多个基因特异表达的方法之一是使用多个基因特异表达的方法之

49、一是使用多个调调控控控控蛋白蛋白蛋白蛋白,并同并同并同并同时时与与与与顺顺式元件式元件式元件式元件结结合形成复合物合形成复合物合形成复合物合形成复合物,才能启才能启才能启才能启动转录动转录,而而而而且必且必且必且必须须是正是正是正是正调调控。如果是控。如果是控。如果是控。如果是负调负调控控控控,只要有一个只要有一个只要有一个只要有一个调调控蛋白与控蛋白与控蛋白与控蛋白与顺顺式元件式元件式元件式元件结结合合合合,即可关即可关即可关即可关闭闭基因。基因。基因。基因。一个多一个多一个多一个多细细胞生物基因的胞生物基因的胞生物基因的胞生物基因的调节调节位点位点位点位点(顺顺式元件式元件式元件式元件)至

50、少是至少是至少是至少是5 5个。个。个。个。由于一种由于一种由于一种由于一种顺顺式元件可与多个式元件可与多个式元件可与多个式元件可与多个调调控蛋白控蛋白控蛋白控蛋白结结合合合合,几个不同的几个不同的几个不同的几个不同的顺顺式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，式元件以适当有功能的方式排列在一起的随机性几乎没有，也保也保也保也保证证了基因的特异性表达。了基因的特异性表达。了基因的特异性表达。了基因的特异性表达。n n经济经济:在分化了的在分化了的在分化了的在分化了的细细胞中胞中胞