质粒DNA的提取及定量定性分析.ppt

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1、Q&A关于关于PCRPCR结果分析结果分析关于产物回收关于产物回收漂洗作用：换缓冲液，除杂漂洗作用：换缓冲液，除杂乙醇：保存目的产物乙醇：保存目的产物离心：去乙醇，除液体，保证后续工作离心：去乙醇，除液体，保证后续工作补救：勿轻易弃置；补救：勿轻易弃置；高盐结合，重复漂洗。高盐结合，重复漂洗。关于实验室安全关于实验室安全关于无菌操作关于无菌操作 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12Fig.1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products.Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA mar

2、ker（from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）问题：问题：10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？启动不够？回收，重新电泳鉴定。回收，重新电泳鉴定。1、12泳道：未加引物或模板或泳道：未加引物或模板或.图表自明：图表自明：胶融！外溢胶融！外溢非特异性！非特异性！PCRPCR仪中的仪中的位置位置质粒质粒DNADNA的提取的提取及其定性定量分析及其定性定量分析 基因的克隆与表达专题之二基因的克隆与表达专题之二主要内容主要内容一、质粒一、质粒DNADNA提取提取二、琼脂糖电泳

3、鉴定及半定量二、琼脂糖电泳鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测三、紫外吸收定量及纯度检测基本原理基本原理结构差别结构差别分子量差别分子量差别变性复性变性复性SDS碱裂解碱裂解碱变性碱变性一、质粒一、质粒DNADNA的提取流的提取流 程程接含接含pETBlue-2pETBlue-2质粒的单菌落于质粒的单菌落于4mL LB 4mL LB 羧苄（羧苄（50ug/mL 50ug/mL）和四环素（和四环素（ug/mLug/mL）液体培养基中）液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜4000rpm4000rpm、离心、离心1min1min，收集所有菌体，收集所有

4、菌体150uL150uL溶液溶液I I悬浮菌体（旋涡混匀），室温悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min10min加入加入200uL200uL溶液溶液IIII（轻轻混匀（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清），室温静置菌液裂解变清 接菌接菌培养培养收菌收菌碱裂解碱裂解加入加入200uL200uL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀!），冰上静置），冰上静置15min15min质粒质粒DNADNA复性复性12000rpm12000rpm，离心，离心10min10min上清加上清加等体积等体积的酚：氯仿：异戊醇（的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀旋涡混匀）12000rpm12000rpm，离心，离心5min

5、5min上清加上清加等体积等体积的氯仿：异戊醇（的氯仿：异戊醇（旋涡混匀旋涡混匀）12000rpm12000rpm，离心，离心5min5min复性回收复性回收纯化纯化上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（倍体积的无水乙醇（旋涡混匀旋涡混匀），室温），室温 30min 30min12000rpm12000rpm，离心，离心10min10min沉淀用沉淀用75%75%乙醇乙醇1mL1mL洗涤两次（洗涤两次（振荡混匀、离心振荡混匀、离心）12000rpm12000rpm，离心，离心5min5min沉淀于超净台中风干沉淀于超净台中风干（5min5min20min20min）沉淀加入沉淀加入20uL RT

6、E20uL RTE，60600 0C C水浴水浴3030分钟溶解分钟溶解-20-200 0C C保存保存醇沉回收醇沉回收溶解溶解保存保存离心离心标识标识碱裂解碱裂解溶液溶液冰浴冰浴剧烈振荡剧烈振荡10 min10 min溶液粘稠混浊溶液粘稠混浊碱裂解碱裂解溶液溶液现用现配现用现配切勿振荡！颠倒混匀切勿振荡！颠倒混匀T 5minT 5minSDSSDS包被包被 ！复性回收复性回收溶液溶液冰上预冷冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀切勿振荡！颠倒混匀15min15min仅质粒复性？在哪相？仅质粒复性？在哪相？！制制 胶：胶：1%1%琼脂糖（琼脂糖（30 30 mLmL/组组，1xTAE)1xTAE)缓冲液：

7、缓冲液：1xTAE1xTAE，300 300 mLmL/两组两组制制 样：质粒样：质粒MarkerMarker：5L5L电电 泳：恒压泳：恒压8080伏，结束后成像保存伏，结束后成像保存结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量二、质粒二、质粒DNA的电泳的电泳测定流程：测定流程：3L3L质粒质粒DNADNA 297L TE 297L TE缓冲液缓冲液双波长检测：双波长检测：定量：定量：C=ODC=OD260260*50*50*稀释倍数（稀释倍数（g/mLg/mL ）纯度指标：纯度指标：三、质粒三、质粒DNA的紫外吸收检测的紫外吸收检测260nm260nm核酸核酸

8、280nm280nm蛋白蛋白 OD OD260260/OD/OD280280比值范围：比值范围：1.81.82.02.0污染成分：蛋白污染成分：蛋白,酚酚 质粒质粒DNA RNADNA RNA混匀混匀下次实验的简介与准备下次实验的简介与准备DNA DNA 重重 组组酶切和连接酶切和连接基因的克隆与表达专题之三基因的克隆与表达专题之三预习：在实验中如何进行对照？预习：在实验中如何进行对照？思考：工程菌的常用种类及用途？思考：工程菌的常用种类及用途？质粒的种类及特性？质粒的种类及特性？分子生物学中常用的内切酶？连接酶？分子生物学中常用的内切酶？连接酶？抗生素种类？为什么应用抗生素？抗生素种类？为什么应用抗生素？灭菌：灭菌：1mL1mL、200200L L、1010L L枪头各一盒枪头各一盒 小指管小指管 4040个个20001000750500200100M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C关于关于PCR退火条件摸索退火条件摸索