用于基因克隆的载体.ppt

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1、第三章第三章 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒（质粒（plasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA考斯质粒（考斯质粒（cosmid）与噬菌粒与噬菌粒人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征 载体的功能及特征载体的功能及特征3.1.1 载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件3.1.2 载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可

2、转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.2 质粒载体质粒载体3.2.1 质粒的基本特征质粒的基本特征A:质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；B:质粒常见于原核细菌和真菌中；质粒常见于原核细菌和真菌中；C:绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA

3、型的；型的；D:绝大多数的天然绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即状的分子结构，即cccDNA；E:质粒质粒DNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 kb。双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（超螺旋）环（超螺旋）开环双螺旋开环双螺旋（一个裂口）（一个裂口）线状双螺旋（两线状双螺旋（两个裂口）个裂口）质粒的分子形式质粒的分子形式 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)Covalent close circular DNA呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）线形线形DNA（linear，L-DNA）一条链上有一至数个缺口。一条链

4、上有一至数个缺口。开环开环DNA（open circular，ocDNA）同一质粒尽管分子量相同，不同的同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：构型电泳迁移率不同：scDNA最快、最快、L DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL3.2.2.4 质粒空间构型与电泳速率质粒空间构型与电泳速率3.2.3 质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多

5、寡，质粒可分为两大复制类型：数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒严紧型质粒 1-3 拷贝拷贝 stringent plasmid松弛型质粒松弛型质粒 10-60 拷贝拷贝 stringent plasmid任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群相容性，不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F

6、、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容3.2.4 质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性：分子机制质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，复制时受到同一种拷贝数控制系两种含有相似复制子结构的不同质粒，复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势后的细胞分裂周期中更具优势两种含有不同复制子结构的质粒，复制时受各自

7、拷贝数控制系统的调节，两种含有不同复制子结构的质粒，复制时受各自拷贝数控制系统的调节，使两种质粒的最终拷贝数恒定，经过若干复制和细胞分裂周期后仍能共处使两种质粒的最终拷贝数恒定，经过若干复制和细胞分裂周期后仍能共处同一细胞内。同一细胞内。3.2.5 质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，如如F、Col、R质粒等质粒等非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的

8、其它成员的其它成员某些非接合型质粒（某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能在接合型质粒的存在和协助下，也能发生发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bom 和和mob 基因决定。基因决定。大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunction）3.2.6 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属、毒性阴离子、有机

9、物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义3.2.7 质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。pSC101 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.

10、5 kb 拷贝数拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 天然质粒的缺陷天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。但只有一个但只有一个EcoR I切点充当克隆位切点充当克隆位点，点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。（2）筛选标记不理想）筛选标记不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。）。可以通

11、过插入失活筛选。但细菌群体容易自可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗发突变出抗colicin E1的细胞的细胞colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，形质粒的菌，形成成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。正好位于这个基因的内部。理想载体条件理想载体条件A、较小的分子和较高的拷贝数较小的分子和较高的拷贝数B、多个单一的限制性内切酶位点多个单一的限制性内切酶位点C、两种以上的选择标记两种以上的选择标记D、易导入宿主细胞并复制和表达易导入宿主细胞并复制和表达质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：氨苄

12、青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr）四环素抗性四环素抗性 （Tetr）链霉素抗性链霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的青霉素的衍生物。衍生物。a）抑菌原理，）抑菌原理，通过干扰细菌细胞壁合成的末端通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。反应，杀死生长的细菌。b）细菌抗性原理：）细菌抗性原理：Ampr基因编码基因编码-内酰胺酶，内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的特异地切割氨苄青霉素的-

13、内酰胺环。内酰胺环。ii）氯霉素（）氯霉素（chloramphenicol，Cml）b）细菌抗性原理：）细菌抗性原理：Cmlr 编码乙酰转移编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理：）抑菌原理：通过与通过与50S核糖体亚基结核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。的形成。杀死生长的细菌。a）杀菌原理：）杀菌原理：通过与通过与70S核糖体结合，导核糖体结合，导致致mRNA发生错读。杀死细菌。发生错读。杀死细菌。iii）卡那霉素（）卡那霉素（kanamycin，Kan）b）细菌抗性原理：

14、）细菌抗性原理：Kanr 编码的氨基糖苷磷编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。核糖体结合作用。iv）链霉素（）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理：）杀菌原理：通过与通过与30S核糖体亚基结核糖体亚基结合，导致合，导致mRNA错译。杀死细菌。错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理：）细菌抗性原理：Strr 编码一种氨基糖苷编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体核糖体30S亚基结合作用。亚基结合作用。v）四环素（）四环素（Tetracycline，Tet）b

15、）细菌抗性原理：）细菌抗性原理：Tetr 编码特异性蛋白质，编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。细胞膜进入细菌细胞内。a）抑菌原理：）抑菌原理：通过于通过于30S核糖体亚基结合，核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。杀死生长的细菌。质粒的分类质粒的分类高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自pSC101 拷贝数小于拷贝数小于10 表达某些毒性基因表达

16、某些毒性基因温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动

17、子等元件的克隆筛选3.2.8 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 3.2.8.1 pBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50-100/cell用于基因克隆用于基因克隆 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322 由F.Bolivar和和R.L.Rodriguez人工构建人工构建 复制起点复制起点 ori：pMB1系列（来源于系列（来源于 ColE1）的高拷贝型复制起点）的高拷贝

18、型复制起点 Ampr基因：基因：pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因 Tetr基因：基因：pSC101的的Tetr 基因。基因。元件来源元件来源4363bp氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。9个导致个导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind）；）；3个导致个导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（2）长度）长度（3）选择标记）选择标记（4）克隆位点）克隆位点 双抗菌素抗性选择标记：双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两插入失活，分两次先后选择：次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细

19、胞 在在Amp或或Tet中都死亡。中都死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一中死亡。其中之一中死亡。（5）pBR322的优点的优点外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡 分子小，克隆能力大：载体越小越好。分子小，克隆能力大：载体越小越好。10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全：失去了转移蛋白基因安全：失去了转移蛋白基因mob（mo

20、bilization）。不能通过接合转移。）。不能通过接合转移。pBR3224363抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板3.2.8.2 pUC18 3.2.8.2 pUC18/19/19：拷贝数拷贝数 2000-3000/cell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZpBR322的的 ori大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的-肽链序列，肽链序列，是是LacZ 的氨基端片断。的氨基端片断。pBR322的的Ampr基因，

21、基因，但其上失但其上失去了克隆位点。去了克隆位点。（1）元件来源）元件来源 复制起点复制起点 Ampr 基因基因 lacZ的启动子的启动子 lacZ基因基因约约10个连续的单一限制酶切位点，个连续的单一限制酶切位点，位于位于lacZ基因的基因的5端。端。（2）长度）长度（3）克隆位点）克隆位点pUC18/19pUC18/19：正选择标记：正选择标记 lacZ 的显色原理的显色原理-半乳糖苷酶能把无色的化合物半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成分解成半乳糖和一个深蓝色的物质半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝-半乳糖苷酶半乳糖苷

22、酶1）-肽（肽（lacZ）：）：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片端的一段氨基酸片断（断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变（突变（lacZM15）受体菌基因组的受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活聚体的活性酶，不能分解性酶，不能分解

23、Xgal 受体菌株：受体菌株：JM系列、系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个缺失肽与这个缺失突变的突变的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它能形成，使它能形成4聚聚体。又能分解体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。产生蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4）互补的插入失活互补的插入失活 pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位点端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰区，

24、本身虽不干扰LacZ的合成，但插入的合成，但插入外源基因就会阻止外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。的合成。不能互补。lacZ 5 3 肽移码突变肽移码突变lacZ 5 3 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNA IPTG的诱导作用的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ 肽都表达。从而互补。肽都表达。从而互补。IPTGIPTG诱导的结果：诱导的结果：更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750b

25、p。选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS）。）。测序方便测序方便（5）pUC系列载体的优点系列载体的优点.pGEM-3Z由由pUC派生而来派生而来,与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的的两侧分别加了一个噬菌体两侧分别加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合聚合酶，在试管里就可以转录酶，在试管里就可以转录mRNA

26、 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。MCS与与pUC18的完全一样。的完全一样。pGEM-3Z的特点：的特点：.PMD18-T.PMD18-T3.3 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效高特异性地侵染宿主细胞，然噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使它们的下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使它们的DNA能能被开发成为基因工

27、程的有用载体，因为：被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增3.3.1 3.3.1 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：生物结构生物结构噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA-DNA组成组成 -DNA-DNA全长全长4850248502个核苷酸个核苷酸-DNA-DNA上至少有上至少有6161个基因个基因 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：生物结构生物

28、结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基头部合成基因因尾部合成基尾部合成基因因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l-DNA 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：溶菌周期溶菌周期E.coli吸附吸附LamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解 噬菌体生物学特性：溶菌周期噬菌体生物学特性：溶菌周期体内包装体内包装100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNA的的75-105%即即 3

29、6-51 kbDA 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：溶原状态溶原状态 噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其DNA直直接接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNA上上，并并不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，这这种种情情况况为为溶溶原原状状态态。DNA重重组组技技术术一一般般需需要要 噬噬菌菌体体进进入入溶溶菌菌状状态。态。噬菌体感染细菌的早期：双链进行噬菌体感染细菌的早期：双链进行 型复型复制。制。3.3.2 DNA的复制的复制 模型模型（1）型复制型复制（2）滚环复制）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。感染的晚

30、期：启动滚环复制机制。形成多联体形成多联体 DAN分子。分子。这种多联体分子必须在这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分位点被切断成单体分子才能被包装起来。子才能被包装起来。（1）构建原理：）构建原理：3.3.3.噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（2）构建过程）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体 删除删除 DNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点删除删除 噬菌体的非必需区，留出插入空间。噬菌体的非必需区，留出插入空

31、间。（3）人工构建的人工构建的 噬菌体载体有两种类型：噬菌体载体有两种类型：插入型载体（插入型载体（insertion vectors)：如如 gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（物区域（cI基因）内。基因）内。EcoR IcI gt10插入导致载体不能合成阻遏物，插入导致载体不能合成阻遏物，载体载体DNA不不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。噬菌斑。没有外源没有外源DNA插入的插入的 载体感染受体菌形成混载体感

32、染受体菌形成混浊噬菌斑。浊噬菌斑。选择标记选择标记:如如 NM1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因内部。基因内部。2）-半乳糖苷酶失活型载体：半乳糖苷酶失活型载体：在在 基因组中引入了基因组中引入了LacZ序列。（其上含序列。（其上含有一个有一个EcoR I 克隆位点）。克隆位点）。感染感染LacZ突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利的诱导，利用用Xgal的显色反应作选择标记。的显色反应作选择标记。LacZ EcoR ICharon16A选择标记选择标记:替换型载体（替换型载体（substitution

33、 vectors)两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于 DNA的非必须区两端。的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源同样酶切成的外源DNADNA片断置换。片断置换。可置换区可置换区MCSMCS如：如：EMBL4、Charon40等。等。1）EMBL4 EMBL4的可置换片断内部还有的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。酶切位点。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂EcoR I BamH I Sal ISal

34、I BamH I EcoR ISal I Sal I EMBL42）Charon40Charon40的可置换片断是由的可置换片断是由DNA短片重复构短片重复构成，片断之间有成，片断之间有Hae I 切点。切点。在克隆的时候，可以用在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。片断切成小片断，以防止重新与载体连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片断中如果包含可取代片断中如果包含LacZ，可，可用用Xgal显色作筛选标记。显色作筛选标记。（4）载体的筛选标记载体的筛选标记 插入型载体插入型载体根据

35、插入所引起的表型突变。根据插入所引起的表型突变。置换型载体置换型载体 DNA象质粒载体那样直接转化细菌象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。时效率远比质粒低。3.3.4 载体的体外包装载体的体外包装 在试管中与在试管中与 噬菌体的头部和尾部蛋白人工装噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组组DNA注入受体菌中。注入受体菌中。（1）体外包装：）体外包装：l 的的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。）。（2）体外包

36、装过程）体外包装过程 噬菌体外壳蛋白的合成噬菌体外壳蛋白的合成E 基因基因l的的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的蛋白的70%）。）。D基因基因E基因基因突突变只合成尾只合成尾部蛋白和部蛋白和包装包装识别蛋白蛋白D基因基因突突变合成合成头部蛋部蛋白和尾部蛋白和尾部蛋白，但不能白，但不能聚合和包装聚合和包装DNA提取尾提取尾部蛋白部蛋白提取提取头部和尾部和尾部蛋白部蛋白重重组的的 载体体DNA体外包装体外包装成活性噬成活性噬菌体菌体外源的重组外源的重组 DNA载体被诱发与内源载体被诱发与内源性原性原 DNA发生重组。发生重组。（3）体外包装存在的问

37、题：）体外包装存在的问题：包装错误：包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的内源性原既能包装用于生产头部蛋白的内源性原 DNA，也能包装重组的，也能包装重组的 DNA载体。载体。重组：重组：体外包装的容量限制：体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的必须在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之间。）之间。既不能超过正常野生型容量的既不能超过正常野生型容量的5%5%；又不能低于正常野生型容量的又不能低于正常野生型容量的75%75%野生型野生型 DNA的必须区是的必须区是28kb，所以，所以 载体的载体的最大克隆容量是最大克隆容量是23kb。（实际上为。（实际上为15kb）。）。3.3.5

38、3.3.5-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：-DNA在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 -DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远大于质粒的装载量远大于质粒的装载量 重组重组-DNA分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便 -DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因片段，但不适合表达外源基因3.4 单链噬菌体载体单链噬菌体载体iii)M13、f1、fd 噬菌体噬菌体单链环状单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：M13

39、 噬菌体噬菌体3.4.1 M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：生物结构生物结构M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNA组成组成 M13 DNA全长全长6407个核苷酸个核苷酸M13 DNA上上至少有至少有10个基因个基因2700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子M13 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 3.4.2 M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的菌生长变慢，约为正常的1/23/41/23/4）M13通

40、过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须注入其性须注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、合成、合成+DNA、翻译形、翻译形成噬菌体蛋白成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞，挤出寄主细胞+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA3.4.3.M13载体的构建：载体的构建：M13基因组中只有基因基因组中只有基因II与基因与基因IV之间之间存在一段存在一段507bp的基因间隔区。的基因间隔区。

41、（1）克隆区域的选定）克隆区域的选定 基因间隔区（基因间隔区（intergenic region,IG区）区）IG区内只有一个区内只有一个 BsuI 切点。切点。其余其余9个个BsuI限制性位点分布在其它部位。限制性位点分布在其它部位。酶切位点酶切位点M13 DNA载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体系列载体lacZpolylinkerM13J.Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的复制起点，但的复制起点，但可以插入外源可以插入

42、外源DNA而不影响而不影响M13噬菌体的活力。噬菌体的活力。在在IG区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列肽序列)。利用利用-肽序列中的三个单一酶切位点（肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶切位点）加入酶切位点 在在IG区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个M13载体：载体：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各种长度的线性片断各种长度的线性片断 lac基因的基因的HindII片断片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）连接连接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG

43、区插入区插入lacZ才能存活并在才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑3.4.4 M13 DNA载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便，重组分子筛选简便，被被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大度亦越大 但但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只

44、有1.5 kb3.5 考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒 -DNA载体和载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25 kb和和 kb。包装上限固定时，缩短噬菌体包装上限固定时，缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能缩短载体的长与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能缩短载体的长度，同时又能保证重组度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再

45、携带构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。3.5.1 考斯质粒（考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有-DNA cos序列和序列和质粒复制子的特殊类型的载体质粒复制子的特殊类型的载体1978年年Collins和和Hohn发明构建发明构建1.8 kb的的-DNA片段片段+pBR322片段片段装载范围为装载范围为31-45 kbpHC796400 bpTcr fragmentc

46、osoriAprPstIBamHISalI考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞3.5.2 噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体

47、包装序列、复制子包装序列、复制子以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的装载量比常规的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易通过克隆双链通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNA重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118 pUC18+M13间隔区间隔区 IGpU

48、C119 pUC19+M13间隔区间隔区 IG500 个拷贝个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118/119表示表示M13辅助噬菌体辅助噬菌体DNA重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子噬菌体启动子PT3和和PT7强化外源基强化外源基因的转录因的转录提取出来的单链提取出来的单链DNA重组分子重组分子在噬菌体在噬菌体RNA聚合酶的存在聚合酶的存在下，又可实现

49、外源基因的体外下，又可实现外源基因的体外转录转录3.6 人造染色体载体人造染色体载体 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BA

50、C）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YAC）1983年形成基础理论年形成基础理论,等等1987年变为年变为现实。现实。3.6.1 酵母人工染色体酵母人工染色体1.YAC的特点：的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。）只能在酵母细胞中扩增。（yeast artificial chromosome,YAC)（2）克隆容量大，为）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。）构建原理，按染色体结构构建。（1）DNA复制起始点（复制起始点（ori）2.染色体复制和遗传的三个基本组件：染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI（2）着丝粒（）着丝粒（centro