组化和免疫组化染色结果的定量测定.ppt

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1、第十四章第十四章.组化和免疫组化染色结果的定量测定组化和免疫组化染色结果的定量测定(The Quantitation Assay of Histochemistry&Immunohistochemistry Staining)将组化将组化,免疫组化和原位杂交等的染色结果分析免疫组化和原位杂交等的染色结果分析提高到定量水平提高到定量水平.最常用的有图像分析术最常用的有图像分析术(Image analysis technique),显微分光光度术显微分光光度术(Microspectrophotometry technique),流式细胞术流式细胞术,(Technique of flow cytom

2、etry,FCM)和和 激光扫描共聚焦激光扫描共聚焦显微镜术显微镜术(Technique of laser scanning confocal microscopy,LSCM)等等.1I.图像分析术图像分析术A.目测半定量目测半定量:依据反应产物的面积和颜色深浅依据反应产物的面积和颜色深浅,主观性主观性大大.B.图像分析仪图像分析仪(Image analyzer):又称图像分析系统又称图像分析系统.1.主要结构和工作原理主要结构和工作原理:a.显微镜显微镜:获取染色结果的光学信息获取染色结果的光学信息.b.图像输入装置图像输入装置:摄像机或扫描器摄像机或扫描器,将光学信息输入电脑将光学信息输入

3、电脑.c.电脑电脑:将光学信息转换成电子信息将光学信息转换成电子信息.将光学信号的将光学信号的灰度灰度分分为为256级可发现染色深浅的微小差别级可发现染色深浅的微小差别.彩色有两种彩色有两种:真彩色真彩色(Real color)是指标本染色的真实颜色是指标本染色的真实颜色,而而假彩色假彩色(Pseudo color)是指将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度是指将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度.d.输出装置输出装置:显示器或打印机等给出图象显示器或打印机等给出图象表面几何形状表面几何形状测量测量(体积体积/面积面积/表面积表面积/长度等长度等)和和图象密度图象密度测量测量(数目数目)等客

4、观等客观数据数据.22.应用应用:定量给出组织细定量给出组织细胞形态的几何参数和组织胞形态的几何参数和组织结构结构(包括宏观和微观包括宏观和微观)的的特征性参数特征性参数,从平面测从平面测量推算到空间参数和组织量推算到空间参数和组织结构的三维图像重建结构的三维图像重建.3.注意事项注意事项:a.照片高质量高倍照片高质量高倍.对照对照组照片的放大倍数应相同组照片的放大倍数应相同.b.复染会影响灰度值的准复染会影响灰度值的准确性确性.c.必要时要进行图像的加工处理必要时要进行图像的加工处理,如阳性区选择和图像切割如阳性区选择和图像切割等等.3左侧左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体睾丸和附睾体

5、部精子结合抗原蛋白异构体 11(SPAG11E)免疫组化染色免疫组化染色.西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏.2010.左侧睾丸左侧睾丸:A.左侧假手术对左侧假手术对照组照组;B.精索静脉曲张精索静脉曲张(ELV)2周组周组周周;C.ELV4周周.附睾体部附睾体部:D.左侧假手术对左侧假手术对照组照组;E.ELV2周周;F.ELV4周周.4ELV大鼠睾丸和附睾大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果免疫组化灰度值测定结果:睾丸睾丸:ELV 2周和周和4周组周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组蛋白的平均灰度值与其相应的对照

6、组比较未见明显改变比较未见明显改变(P0.05);附睾附睾:ELV2周和周和 4周组周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱蛋白的表达均较同期对照组显著减弱(P0.05或或P0.01),ELV4周组附睾周组附睾SPAG11E蛋白的表达较蛋白的表达较ELV2周组显周组显著减弱著减弱(P0.01).5II.显微分光光度术显微分光光度术A.简介简介:细胞分光光度计细胞分光光度计(cytospectrophotometer),是一种以物质分子是一种以物质分子对光波的选择性吸收对光波的选择性吸收为基础为基础,对生物对生物样品中的样品中的化学物质化学物质进行定量测定的精密仪器进行定量测定的精密仪

7、器.通过测定通过测定核酸核酸,蛋白质蛋白质,脂类脂类,酶类或其它化学成分的光吸收酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而计算它们的相对含量和微区面积而计算它们的相对含量.B.主要结构和工作原理主要结构和工作原理:1.光源光源:有白炽灯和汞灯有白炽灯和汞灯,疝灯疝灯.白炽灯可作为标准光白炽灯可作为标准光源源,辐射光谱在辐射光谱在400700nm间间,用于一般测量用于一般测量.汞灯为汞灯为激发荧光的理想光源激发荧光的理想光源,疝灯的辐射光谱在疝灯的辐射光谱在2501100nm间间.2.单色器和滤光片单色器和滤光片:保证进入显微镜的光波亮度充足保证进入显微镜的光波亮度充足,波长单一且可调波长单一且可调

8、.3.光电组合件光电组合件:将测量区内的光学信号转变为电子信号将测量区内的光学信号转变为电子信号,产生测量数据产生测量数据.6C.基本步骤基本步骤:1.标本制备标本制备:凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测定测定,但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致.72.测量方法测量方法:a.单波长法单波长法:用一种波长的光测量用一种波长的光测量,所测物质分布如果是所测物质分布如果是均匀的均匀的,因此测量法所得数值因此测

9、量法所得数值,其误差就小其误差就小.b.扫描测量法扫描测量法:能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的分布误差分布误差,和由于面积不规则造成的面积测量误差和由于面积不规则造成的面积测量误差.扫描扫描法的原理是法的原理是通过积分通过积分的方法的方法,虽然被测物质分布不均匀虽然被测物质分布不均匀,但可以将被测物质的面积分成许多小区但可以将被测物质的面积分成许多小区,将各个小区的数将各个小区的数值相加值相加.c.荧光光度法荧光光度法:凡被测物质能产生荧光凡被测物质能产生荧光(原发荧光原发荧光,诱发荧诱发荧光光,荧光或免疫荧光标记荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光

10、光度法测定的都可以应用荧光光度法测定.广泛用于测定细胞内的核酸广泛用于测定细胞内的核酸(DNA和和RNA),氨基酸氨基酸,蛋白质蛋白质,糖原糖原,生物胺生物胺,抗体和酶的相对含量抗体和酶的相对含量.D.应用范围应用范围:对细胞的对细胞的DNA,RNA,蛋白质蛋白质,酶酶,糖糖,脂脂等大分子物质以及免疫活性物质等都能定性等大分子物质以及免疫活性物质等都能定性,定位和定量定位和定量测定测定.8III.流式细胞术流式细胞术A.简介简介:可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类分类,每秒测定达数千万个细胞每秒测定达数千万个细胞,且有高度的重复性且有高度的

11、重复性.在单个细胞中在单个细胞中,可同时测得可同时测得DNA,RNA及细胞体积及细胞体积3个参数个参数,也可测定核与细胞的比例也可测定核与细胞的比例,蛋白质和免疫标记的其它参量蛋白质和免疫标记的其它参量.B.主要结构和工作原理主要结构和工作原理:1.液流系统液流系统:先制备先制备荧光等染色的单细胞悬液荧光等染色的单细胞悬液,放入样品放入样品管中管中,使其在气体压力下进入流动室使其在气体压力下进入流动室;流动室内充满鞘液流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下在鞘液的约束下,细胞排列成细胞排列成单行单行,由流动室的喷嘴喷由流动室的喷嘴喷出出,成为细胞柱液成为细胞柱液,依次恒速通过测量区依次恒速通过测量区

12、.2.激发光器件激发光器件:在在测量区内测量区内发射波长可调的激光柱发射波长可调的激光柱,垂直垂直照射细胞液柱照射细胞液柱,细胞受激光照射后发生散射光和荧光细胞受激光照射后发生散射光和荧光.93.信号检测系统信号检测系统:测定细胞发出荧光的角度测定细胞发出荧光的角度,波长和大小波长和大小,可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量.4.控制系统控制系统:校准调节上述系统校准调节上述系统.10C.样品染色样品染色:绝大多数用绝大多数用荧光染料荧光染料进行标记进行标记.1.DNA含量含量:溴化乙啶溴化乙啶(EB)和碘化丙啶和碘化丙啶(PI)嵌插入嵌插入DNA的双螺旋的

13、双螺旋;神光霉素与神光霉素与G-C有特异性有特异性;Hoechst33258与与A-T有特异性有特异性;吖啶橙吖啶橙(Acridine orange,AO)可以同时可以同时染色染色DNA和和RNA.2.细胞核细胞核:DAPI(4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚苯基吲哚)是专与细胞是专与细胞核结合的荧光素核结合的荧光素.3.蛋白质含量蛋白质含量:一般用异硫氰酸荧光素一般用异硫氰酸荧光素(FITC).4.外周外周T,B和单核细胞以及和单核细胞以及T细胞的亚群分选细胞的亚群分选:结合特结合特异性单克隆抗体异性单克隆抗体.11D.应用举例应用举例:1.肿瘤学肿瘤学(Oncology):绝大多数肿瘤从空

14、间与时间上都显绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示出稳定的多倍体示出稳定的多倍体DNA含量含量,而且常常是非整倍体数而且常常是非整倍体数.FCM能诊断异常的能诊断异常的DNA干系干系,可作为指导肿瘤的治疗可作为指导肿瘤的治疗,了解病情发展了解病情发展,判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据证据.2.细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis):细胞凋亡是细胞细胞凋亡是细胞程序性程序性死亡死亡,其特征是染色体断裂和其特征是染色体断裂和DNA片段化片段化,凝胶电泳呈现梯状凝胶电泳呈现梯状条带条带;细胞皱缩细胞皱缩,致密并迅速破碎形成凋亡小体致密并迅速破碎形成凋亡小体,而而被

15、邻近细胞所吞噬被邻近细胞所吞噬.细胞凋亡时需要细胞凋亡时需要继续合成继续合成DNA,蛋白蛋白质和质和ATP.FCM检测分析可见检测分析可见DNA G0/G1峰前出现一个峰前出现一个亚二亚二倍体峰倍体峰(又称亚又称亚G1峰峰),代表细胞凋亡代表细胞凋亡,该峰下的面积该峰下的面积即是凋亡细胞的相对数量即是凋亡细胞的相对数量,可由可由FCM自动给出自动给出.12FCM检测检测HL-60细胞凋亡细胞凋亡.西安交通西安交通大学医学院人体解剖与组胚专业博大学医学院人体解剖与组胚专业博士生杜宝玲士生杜宝玲,2005.A图中可见明显的亚图中可见明显的亚G1峰峰(25.9%),提示细胞凋亡提示细胞凋亡.B图和图

16、和C图显示两种图显示两种Caspase-3反义寡反义寡核苷酸转染干扰后核苷酸转染干扰后,亚亚G1峰消失峰消失.13IV.激光扫描共聚焦显微镜术激光扫描共聚焦显微镜术A.简介简介:以激光和计算机技术为以激光和计算机技术为基础把普通基础把普通LM和和荧光荧光LM功能相功能相结合结合,用激光扫描进行用激光扫描进行“光学光学切片切片”,显微镜进行微观检测显微镜进行微观检测,计算机对资料高速实时存储和分计算机对资料高速实时存储和分析析,将形态学的将形态学的定量观察定量观察,生生理学的动态检测理学的动态检测和和生物化学的定生物化学的定量分析量分析融为一体融为一体,从而使对被从而使对被检物体的表面检物体的表

17、面,单层单层,静态静态,局部的观察进展到立体局部的观察进展到立体,断层断层扫描扫描,动态动态,全面的观察全面的观察.14B.特点特点:1.分辨率高分辨率高:LSCM以激光为光源以激光为光源,观察标本的反差明显观察标本的反差明显,最小可观察厚度为最小可观察厚度为 m.2.灵敏度高灵敏度高:采用光电倍增管来检测荧光采用光电倍增管来检测荧光,并利用不同的并利用不同的滤片可将不同的光分开滤片可将不同的光分开.3.扫描速度快扫描速度快:可达可达微秒级微秒级.因此可动态观察细胞内化学因此可动态观察细胞内化学成分如成分如Ca2+,Mg2+和和pH值的变化值的变化,也可对膜电位也可对膜电位,膜的膜的流动性等进

18、行测定流动性等进行测定.4.光学切片与细胞光学切片与细胞CT:将样品各深度的切片叠加在一起进行将样品各深度的切片叠加在一起进行三维重组三维重组,观察不同断面中细胞成分的变化观察不同断面中细胞成分的变化,即即“细胞细胞CT”.5.图像存取方便图像存取方便:计算机可快速及时保存图像计算机可快速及时保存图像,其数据存其数据存取方便取方便,可随时调用可随时调用.15C.功能功能:1.静态观察静态观察:a.单染色样品的观察和分析单染色样品的观察和分析:可对一种荧光标记的样品可对一种荧光标记的样品进行观察和分析进行观察和分析,获得细胞平均荧光强度获得细胞平均荧光强度,积分荧光积分荧光强度强度,细胞的周长细

19、胞的周长,截面积和形态因子等参数截面积和形态因子等参数.b.双染色样品的观察和分析双染色样品的观察和分析:可将同一部位的不同扫描可将同一部位的不同扫描图像叠加起来图像叠加起来,用于双染用于双染,三染甚至四染样品三染甚至四染样品,但需但需注意各种荧光染料的激发和发射波长注意各种荧光染料的激发和发射波长互不干扰互不干扰.c.自动图像扫描观察分析自动图像扫描观察分析:用于一个平皿中多个散在并用于一个平皿中多个散在并可能同时发生变化的细胞的同时观察可能同时发生变化的细胞的同时观察.d.荧光强度的定量测定荧光强度的定量测定:用于高灵敏度快速的免疫荧光用于高灵敏度快速的免疫荧光测定测定,以准确地监测抗原表

20、达以准确地监测抗原表达,细胞结合和杀伤及定细胞结合和杀伤及定量的形态学特性量的形态学特性.162.动态观察动态观察:a.细胞内各种离子浓度的测定细胞内各种离子浓度的测定:用于动态观察一段时间内用于动态观察一段时间内细胞内细胞内Ca2+,Mg2+,pH值的变化并可进行定量测定值的变化并可进行定量测定.其其点扫描点扫描,线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速变化的快速变化.b.细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定:细胞膜荧光探针受到极化光线激细胞膜荧光探针受到极化光线激发后发后,其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转,而这而

21、这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性.173.生物活性物质笼锁生物活性物质笼锁(Caged)和解笼锁和解笼锁(Uncaged)的测定的测定:笼锁化合物与生物活性物质笼锁化合物与生物活性物质(如第二信使如第二信使,核苷酸核苷酸,神神经递质经递质,Ca2+等等)结合可抑制后者的活性结合可抑制后者的活性,使其处于笼使其处于笼锁状态锁状态.当用当用LSCM强度和时间可人为控制的特异性波长强度和时间可人为控制的特异性波长的光的光瞬间瞬间照射后照射后,光活化解笼锁光活化解笼锁,使该活性物质释放使该活性物质释放,其直接在光解部位发挥的作用为其直接在光

22、解部位发挥的作用为LSCM所检测所检测.4.贴壁细胞的分选贴壁细胞的分选:用高能量激光杀灭不需要的细胞用高能量激光杀灭不需要的细胞(荧荧光标记光标记),留下需要的活细胞继续培养留下需要的活细胞继续培养.185.荧光光漂白恢复荧光光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleach,FRAP):用来测定活细胞的动力学参数用来测定活细胞的动力学参数.FRAP借助高强度脉冲借助高强度脉冲激光来照射细胞某一区域激光来照射细胞某一区域,造成该区域荧光分子的光粹灭造成该区域荧光分子的光粹灭,该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域该区域周围的非粹灭荧光分子

23、会以一定的速率向受照射区域扩散扩散,这个扩散速率可通过这个扩散速率可通过LSCM探测探测,得到分子运动和胞得到分子运动和胞间通讯等动力学参数间通讯等动力学参数.6.激光光陷阱技术激光光陷阱技术:即光摄技术即光摄技术,广泛应用于染色体移动广泛应用于染色体移动,细胞器移动细胞器移动,细胞骨架弹性测量细胞骨架弹性测量,细胞周期和调控研究及细胞周期和调控研究及分子动力原研究等分子动力原研究等.利用光学梯度力形成的光陷阱利用光学梯度力形成的光陷阱,产生具产生具有有传统机械挟持传统机械挟持和操纵微小物体的功能和操纵微小物体的功能.当微米级颗粒落入当微米级颗粒落入一个非均匀光场中一个非均匀光场中,它将趋于特

24、定的平衡位置它将趋于特定的平衡位置,物体不会物体不会偏离光学中心偏离光学中心,造成一个势能较低的陷阱区域造成一个势能较低的陷阱区域,这种固定这种固定是光子动量的结果是光子动量的结果,与照明强度和波长有关与照明强度和波长有关.19Overlapping distributions of corticothalamic(皮质丘脑皮质丘脑)and(丘丘脑皮层脑皮层)thalamocortical pathways.Early postnatal mouse.GABA-containing terminals(red)in close apposition to oxytocin neurons(gr

25、een).Rat hypothalamus.20V.显微照相与白平衡显微照相与白平衡A.绝对黑体绝对黑体:物体对电磁波具有吸收物体对电磁波具有吸收,透过透过,反射反射三种作用三种作用,分别以吸收率分别以吸收率,透过率透过率,反射率衡量反射率衡量,此三者相加等于此三者相加等于1.吸收率为吸收率为1而其它两项为而其它两项为0的物体的物体称称绝对黑体绝对黑体.透过率为透过率为1的叫绝对透明体的叫绝对透明体.反射率为反射率为1,表面光滑的叫镜体表面光滑的叫镜体,不光滑的叫白体不光滑的叫白体.这几种物这几种物质在现实中是不存在的质在现实中是不存在的,是理想的情况是理想的情况.B.色温色温:1.概念概念:

26、是表示光源光谱质量最通用的指标是表示光源光谱质量最通用的指标,按绝按绝对黑体来定义对黑体来定义,单位为单位为K.光源的辐射在可见区和绝光源的辐射在可见区和绝对黑体的辐射对黑体的辐射完全相同时完全相同时,黑体的温度就称此光源黑体的温度就称此光源的的色温色温.光线的色温是相当于黑体散发出同样颜色光线的色温是相当于黑体散发出同样颜色时所受到的时所受到的“温度温度”.212.色温的相对性色温的相对性:色温是物理学色温是物理学,生理学与心理生理学与心理学的综合复杂因素的一种感觉学的综合复杂因素的一种感觉,因人而异因人而异.黑眼黑眼睛的人看睛的人看9300K是白色的是白色的,因此摄影照相的色温以因此摄影照

27、相的色温以9300K为基准为基准,但是蓝眼睛的人看了就是偏蓝但是蓝眼睛的人看了就是偏蓝.6500K蓝眼睛的人看了是白色蓝眼睛的人看了是白色,黑眼睛看了就是偏黑眼睛看了就是偏黄黄.色温图色温图22C.白平衡与显微照相白平衡与显微照相:1.白平衡白平衡(White balance):在任何光源下在任何光源下,都能将白色都能将白色物体还原为白色物体还原为白色.2.调节白平衡原理调节白平衡原理:摄像机内部有三种摄像机内部有三种CCD电子耦合元电子耦合元件件,分别感受蓝色分别感受蓝色,绿色绿色,和红色的光线和红色的光线,在预置情况在预置情况下感光电路电子放大比例是下感光电路电子放大比例是1:1:1.若照片偏蓝若照片偏蓝,色温较色温较高高,白平衡调整后的电路放大比例中明显蓝的比例减白平衡调整后的电路放大比例中明显蓝的比例减少少,增加了绿和红的比例增加了绿和红的比例,使所成影像依然为白色使所成影像依然为白色.23Mount Sharp,Mars,before WB.Mount Sharp,Mars,after WB.24Trachea,after and after WB25