hu仪器分析第3章分子发光分析法.ppt

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1、仪仪 器器 分分 析析第三章第三章 分子发光分析分子发光分析法法molecular luminescenceanalysis3.1分子荧光和磷光分子荧光和磷光Molecularfluorescenceandphosphorescence3.2分子荧光和磷光分析法分子荧光和磷光分析法Molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis3.3分子发光分析分子发光分析Chemiluminescenceanalysis第三章 分子发光分析法一、分子荧光与磷光产生过程一、分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular f

2、luorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系 Relation between fluorescence and molecular structure四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素Factor influenced fluorescence第一节第一节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光molecular luminescenceanalysis molecular fluoresce

3、nce and phosphorescence3.1.1荧光与磷光的产生过程 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基基态态(S0)激激发发态态(S1、S2、激激发发态态振振动动能能级级)：吸吸收收特特定定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势激发态寿

4、命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2；3.1分子荧光和磷光分子荧光和磷光2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)；平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定(洪洪特特规规则则)，三三重重态态能能级级比比相相应应单重态能级低；单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；S0T1禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见能级图

5、见能级图)；进入的几率小；进入的几率小；分子吸收辐射后分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为为+1/2和和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为。则该分子所处的电子能态称为激发单重态激发单重态,用符号用符号S表示。表示。（S1S2S3）电子被激发且伴随着自旋方向的改变电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为为+1/2和和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为。则该分子所处的电子能态称为激发三重态激发三重态,用符号用符号T表示。（表示。（T1T2T3）S03.激发态基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳

6、定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；磷光磷光：10-410s；第一激发；第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；S2S1S

7、0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3外转换外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫 辐射能量传递辐射能量传递（发射光子）（发射光子）非辐射能量传递非辐射能量传递 化学反应化学反应去活化（激发态去活化（激发态基态）三种形式：基态）三种形式：荧光荧光磷光磷光振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越外转换外转换非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换内转换：同多重度电子能级同多重度电子能级中,等能级间的

8、无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（多为多为S1S0跃迁跃迁），发射波长为），发射波长为 2的荧光；的荧光；1

9、0-710-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长；2 2 1；磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（T1S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫T1发光速度很慢：发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。（1 1）荧光的激发光谱）荧光的激发光谱 激发光谱：激发光谱：表示不同激发波长下所

10、引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱：绘制激发光谱：固定发射波长固定发射波长(选选最最大大发发射射波波长长),),然然后后以以不不同同波波长长的的入入射射光光激激发发荧荧光光物物质质，以以荧荧光光强强度度F对对激发波长激发波长 作图，即为激发光谱。作图，即为激发光谱。荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。谱）。3.1.2 激发光谱与荧光激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长

11、ex（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，度。绘制发射光谱时，使使激发光波长固定在激发光波长固定在 ex处处，然后对发，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度以荧光强度F 对发射波长对发射波长 作图作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.a.Stokes位移位移 激激发

12、发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2,1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如 2)。c.镜像规则镜像规则通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样样）成镜像对

13、称关系。成镜像对称关系。镜像规则的解释 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能级分布类似；能级分布类似；基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的二二振振动动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然迁也然。3.1.3荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有

14、一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，如如外外转转换换过程速度快，不出现荧光发射；过程速度快，不出现荧光发射；与激发态分子失活过程的速率常数有关与激发态分子失活过程的速率常数有关发射过程中的发射过程中的速率常数速率常数其他过程有关的速率常其他过程有关的速率常数，主要取决于环境数，主要取决于环境（1）、长 *共轭结构共轭结构：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。数小，有利于荧光的产生。大多数能产生荧光的物大多数能产生荧光的物

15、质都含有芳香环或杂环具有共轭的质都含有芳香环或杂环具有共轭的 *跃迁。其跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，波长长移。共轭程度愈大，荧光效率也愈大，波长长移。2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光苯萘蒽维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm0.110.290.36 刚性结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具刚性结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。的荧光，酚酞却没有。分子的刚性和共平面性越大，分子的

16、刚性和共平面性越大，越大，越大，荧光强度越强。荧光强度越强。1(非荧光物质非荧光物质)（2）分子的刚性）分子的刚性 有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。用这一特点可以间接测定金属离子。（3）取代基团对分子荧光的影响）取代基团对分子荧光的影响给给电

17、电子子取取代代基基：能能增增加加分分子子的的电电子子共共轭轭程程度度，使使荧荧光光效效率率提高。如提高。如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等；等；吸吸电电子子取取代代基基：可可减减弱弱分分子子电电子子共共轭轭性性，使使荧荧光光减减弱弱甚甚至至熄灭。而熄灭。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等等还还有有一一类类取取代代基基则则对对荧荧光光的的影影响响不不明明显显，如如R、SO3H、NH3等。等。影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1、温度 当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加

18、，荧光效率降低。碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。3.1.4影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure2、溶剂（1）荧荧光光强强度在一定范度在一定范围围内可随溶内可随溶剂剂黏度的减小而减小；黏度的减小而减小；（2）溶）溶剂剂和和荧荧光物光物质质形成化合物，改形成化合物，改变变物物质质的性的性质质；（3）荧荧光波光波长长随溶随溶剂剂极性增大而极性增大而长长移。移。(4)溶溶剂剂与分子与分子轨轨道道发发生作用，改生作用，改变跃变跃迁能量特殊作用迁能量特殊作用;(5)氢键氢键、改、改变荧变荧

19、光物光物质质解离状解离状态态增溶、增敏、增稳作用。增溶、增敏、增稳作用。优点：优点：（1 1）增加荧光物质的溶解度；）增加荧光物质的溶解度；（2 2）增加摩尔吸光系数；）增加摩尔吸光系数；（3 3）增加荧光物质的稳定性。）增加荧光物质的稳定性。例如：环糊精，十二烷基磺酸钠例如：环糊精，十二烷基磺酸钠3.表面活性剂表面活性剂值值 （1 1）溶溶液液pHpH值值改改变变，物物质质分分子子和和其其离离子子间间的的平平衡衡也也随随之之发发生生变变化化，而而不不同同形形体体具具有有其其各各自自特特定定的的荧荧光光光谱和荧光效率。光谱和荧光效率。例如苯胺：例如苯胺：（2 2）溶液溶液pHpH值的改变会影响

20、配合物的组成，从而影值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。响它们的荧光性质。GaGa3+3+邻邻-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯pH3pH34 41:11:1配合物（荧光）配合物（荧光）GaGa3+3+邻邻-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯pH6pH67 71 1 2 2的配合物（无荧光）。的配合物（无荧光）。5.5.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；6.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭荧荧光光熄熄灭灭是是

21、指指荧荧光光物物质质分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或溶溶质质分分子子相相互互作作用用引引起起荧荧光光强强度度降降低低的的现现象象。引引起起荧荧光光熄熄灭灭的的物物质质称称为为荧荧光光熄熄灭灭剂剂(quenchingmedium)。如如卤卤素素离离子子、重重金金属属离离子子、氧氧分分子子以以及及硝硝基基化化合合物物、重重氮氮化化合合物物、羰羰基基和和羧羧基基化化合合物物均均为常见的荧光熄灭剂。为常见的荧光熄灭剂。碰撞猝灭；碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。7.散射光散射光 小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射

22、。改变而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光的拉

23、曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长光波长选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰a:320nm或或350nm为激发为激发光，荧光峰总是在光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在将空白溶剂分别在320nm及及350nm激发光照射下测定激发光照射下测定荧光，激发光波长为荧光，激发光波长为320nm时，拉

24、曼光波长是时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。扰，因而影响测定结果。硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱3.1.5常用常用荧荧光光试剂试剂fluorescentreagent 荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析应之后，得到强荧光性产物的标记物，从

25、而可扩大荧光分析法的使用范围法的使用范围1.1.有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析 脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物(衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。能用荧光分析法测定的有机物包括多多环环胺胺类类、萘萘酚酚类类、嘌嘌啉啉类类、吲吲哚哚类类、多多环环芳芳烃烃类类、具具有有芳芳环环或或芳芳杂杂环环结结构构的的氨氨基基酸酸类类及及蛋蛋白白质质等等；药药物物中中的的生生物物碱碱类类如如麦麦角角碱碱

26、、蛇蛇根根碱碱、麻麻黄黄碱碱、吗吗啡啡、喹喹啉啉类类及及异异喹喹啉啉类类生生物物碱碱等等；甾甾体体类类如如皮皮质质激激素素及及雌雌醇醇等等；抗抗生生素素类类如如青青霉霉素素、四四环环素素等等；维维生生素素类类如如维维生生素素A、B1、B2、B6、B12、E、抗抗坏坏血血酸酸、叶叶酸酸及及烟烟酰酰胺胺等等。此此外外，中中草草药药中中的的许许多多有有效效成成分分，不不少少是是属属于于芳芳香香性性结结构构的的大大分分子子杂杂环环类类，都都能能产产生生荧荧光光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工

27、作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：1荧荧光光胺胺(fluorescamine)：能能与与脂脂肪肪族族或或芳芳香香族族伯伯胺胺类类形形成成高度荧光衍生物，典型反应如下：高度荧光衍生物，典型反应如下：荧荧光光胺胺及及其其水水解解产产物物不不显显荧荧光光。100mg荧荧光光胺胺溶溶于于100ml无无水水丙丙酮酮中中，放放置置24小小时时后后即即可可使使用用。取取相相当当于于10mg药药物物的的甲甲醇醇或或水水溶溶液液，加加适适宜宜pH值值的的磷磷酸酸缓缓冲冲溶溶液液5ml，加加荧荧光光胺胺试试剂剂，混混合合，放放置置15分分钟钟后后测测定定荧荧光光强强度度。荧荧光光条条件件为为：ex=27

28、5、390nm，em=480nm。2邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)在在2 巯巯基基乙乙醇醇存存在在下下，pH910的的缓缓冲冲溶溶液液中中OPA能能与与伯伯胺胺类类、特特别别是是除除半半胱胱氨氨酸酸、脯脯氨氨酸酸及及羟羟脯脯氨氨酸酸外外的的a 氨氨基基酸酸生生成成灵灵敏敏的的荧荧光光产产物物。取取OPA500mg溶溶于于10ml乙乙醇醇中中，加加200ml2 巯巯基基乙乙醇醇，将将此此混混合合液液加加至至1L3的的硼硼酸酸溶溶液液中中，再再用用KOH调调节节至至pH10，即即为为常常用用试试剂剂溶溶液。荧光条件为：液。荧光条件为：ex=340nm，em=455nm。31 二甲氨基二甲氨基 5

29、氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯，丹酰氯)能能与与伯伯胺胺、仲仲胺胺及及酚酚基基的的生生物物碱碱类类反反应应生生成成荧荧光光性性产产物物。取取50mg或或100mg试试剂剂，溶溶解解于于500ml无无水水丙丙酮酮中中即即可可使使用用。与与丹丹酰酰氯氯类类似似的的一一个个试试剂剂是是丹丹酰酰肼肼(DansylNHNH2)，它它能能与与可可的的松松的的羰羰基基缩缩合合，产产生生强强烈烈荧荧光光。荧荧光光条条件件为为：ex=365nm，em=500nm左右。左右。丹丹酰酰氯氯试试剂剂不不稳稳定定，其其水水解解产产物物Dansyl OH呈呈蓝蓝色色荧荧光光，必须暗处保存，每周重新配制。

30、必须暗处保存，每周重新配制。无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约合物后，可测量约6060种元素及离子种元素及离子 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定2.无机化合物的分析无机化合物的分析第三章第三章 分子发光分析法分子发光分析法3.2.1仪器与结构流程仪器与结构流程instrumentandgeneralprocess3.2.2荧光分析法和应用荧光分析法和应用f

31、luorescenceanalysisandapplication3.2.3磷光分析法的应用磷光分析法的应用phosphorescenceanalysisandapplication第二节第二节 分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis 仪器结构流程仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，

32、光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测量测量)波长的第二单色器波长的第二单色器；光光源源：氙氙灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器检测器：光电倍增管。1.荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源I0透射光透射光检测器检测器信号显示系统信号显示系统FIt狭缝狭缝 ex、I0 em、If荧光光谱仪与紫外荧光光谱仪与紫外-可见分光光度计光路设计有什么区别？可见分光光度计光路设计有什么区别？2.荧光光谱仪的

33、主要部件荧光光谱仪的主要部件发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器为荧光测定提供为荧光测定提供足够强度的、稳定的激发光足够强度的、稳定的激发光氙灯、高压汞灯氙灯、高压汞灯将光源发出的复合光分解为单色光将光源发出的复合光分解为单色光光栅、滤光片光栅、滤光片盛放试样盛放试样石英、四面透光石英、四面透光将荧光物质产生的将荧光物质产生的荧光分解为单色光荧光分解为单色光光栅、滤光片光栅、滤光片将荧光信号将荧光信号转换为电学转换为电学信号信号灵敏灵敏光电倍增管光电倍增管同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定

34、波长差()和固定能量差及可变波长三种；同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发 射 光 谱 严 重 重 叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光谱图光光谱图磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命

35、的的差差别别，采采用用磷磷光光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室室温温测测量量时时，不不需需要要杜瓦瓶。杜瓦瓶。3.2.2荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；个数量级；为什么？为什么？检测下限：检测下限：g/cmg/cm-3-3 相对灵敏度：奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。相对灵敏度：奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射

36、光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。：应用范围小。因为荧光或磷光分析法是在入射光的直角方向测定荧因为荧光或磷光分析法是在入射光的直角方向测定荧光强度，即在光强度，即在黑背景下进行检测黑背景下进行检测，因此可以通过入射光强，因此可以通过入射光强度度I I或者增大荧光或者磷光信号的放大倍数来提高灵敏度，或者增大荧光或者磷光信号的放大倍数来提高灵敏度，而紫外而紫外-可见法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度可见法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值相关，入射强度增大，透射光强度也和透射光强度的比值相关，入射强度增大，透射光强度也随之增

37、大，增大检测器的放大倍数也同时影响入射光和透随之增大，增大检测器的放大倍数也同时影响入射光和透射光的检测，因而限制了灵敏度的提高射光的检测，因而限制了灵敏度的提高 2.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据荧光强度荧光强度If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率：If=Ia由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c=Kc（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列

38、标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强度，在标准曲线上求出浓度；强度，在标准曲线上求出浓度；标准对比法：标准对比法：在在线线性性范范围围内内，测测定定标标样样和和试试样样的的荧荧光光强强度度，比较；比较；3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧

39、光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表 分子荧光法课堂练习分子荧光法课堂练习1.化合物分子吸收电磁波激发到电子激发态，处于激发态的分子化合物分子吸收电磁波激发到电子激发态，处于激发态的分子不稳定，通过不稳定，通过 和和 方式失活回到基态。荧光分子从第一激方式失活回到基态。荧光分子从第一激发单重态的发单重态的 能层释放电磁波返回基态，产生分子荧光。能层释放电磁波返回基态，产生分子荧光。2.荧光激发光谱，可用于确定荧光分析时的荧光激发光谱，可用于确定荧光分析时的 ；荧光发射光谱，；荧光发射光谱，可用于确定荧光分析时的可用于确定荧

40、光分析时的 。3.荧光量子产率为荧光量子产率为 与与 之比。下列各对化合物中荧光量子之比。下列各对化合物中荧光量子产率较高的分别是产率较高的分别是(1)(2)(3)(4)。4.与紫外分光光度计比较，荧光光谱仪光源强度更与紫外分光光度计比较，荧光光谱仪光源强度更 ，激发光，激发光路与发射光路呈路与发射光路呈 ，比色皿，比色皿 。5.分子荧光法测量灵敏度高的主要原因为分子荧光是在分子荧光法测量灵敏度高的主要原因为分子荧光是在 背景背景下测量的。下测量的。问题讨论问题讨论与紫外与紫外-可见分光光度计比较，荧光光度计有何特点？可见分光光度计比较，荧光光度计有何特点？分子荧光法具有哪些的优点和缺点，为什

41、么？分子荧光法具有哪些的优点和缺点，为什么？如何确定荧光定量分析的激发和发射光波长？如何确定荧光定量分析的激发和发射光波长？一、什么是分子荧光法？一、什么是分子荧光法？881.什么是分子荧光法？什么是分子荧光？什么是分子荧光法？什么是分子荧光？二、什么物质可以用分子荧光法测定？二、什么物质可以用分子荧光法测定？88-932.分子荧光或磷光是如何产生的？分子荧光或磷光是如何产生的？3.何为振动驰豫、内转换、外转换、系间跨越、荧光发射、磷光发射？何为振动驰豫、内转换、外转换、系间跨越、荧光发射、磷光发射？4.什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？什么是荧光激发光谱？什么是荧光发

42、射光谱？各有何特点和作用？5.为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？6.何谓何谓Stokes位移？位移？Stokes位移是如何产生的？何为镜像规则？位移是如何产生的？何为镜像规则？7.分子产生荧光的必备条件是什么？分子产生荧光的必备条件是什么？8.什么是荧光量子产率？什么样结构的化合物荧光量子产率高？什么是荧光量子产率？什么样结构的化合物荧光量子产率高？三、分子荧光法定量关系式如何？三、分子荧光法定量关系式如何？93-959.荧光强度与样品浓度间关系如何？该关系式成立的条件是什么？荧光强度与样品浓度间关系如何？该关系式成立的条件是什么？10.影响溶液荧光强度的

43、因素有哪些？如何影响？何为荧光猝灭？影响溶液荧光强度的因素有哪些？如何影响？何为荧光猝灭？四、分子荧光法是如何测量的？四、分子荧光法是如何测量的？95-9611.分子荧光光谱仪部分功能如何？与分子荧光光谱仪部分功能如何？与UV-Vis有何不同？有何不同？12.分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角？分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角？13.分子荧光分析法有何特点？分子荧光分析法有何特点？五、分子荧光法是如何进行定性定量分析的？五、分子荧光法是如何进行定性定量分析的？97-9914.分子荧光分析法有哪些主要定量方法？如何操作和计算？分子荧光分析法有哪些主要定量方法？如何操作和计算？