细胞生物学-细胞周期的调控.ppt

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1、第二节第二节细胞周期的调控细胞周期的调控 MPF的发现及其作用的发现及其作用细胞周期运转的调控细胞周期运转的调控 卵细胞促成熟因子卵细胞促成熟因子,matuation-promoting factor 细胞促分裂因子细胞促分裂因子,mitosis-promoting factor M期促进因子期促进因子,M-phase-promoting factor一、一、MPF的发现及其作用的发现及其作用Johnson和和Rao(1970)将将Hela细胞细胞同步于同步于不同阶段，然不同阶段，然后与后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合。期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合。结果结

2、果-使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝集，核被膜破裂及核仁消失，将这种集，核被膜破裂及核仁消失，将这种集，核被膜破裂及核仁消失，将这种集，核被膜破裂及核仁消失，将这种现象叫做现象叫做染色体超前凝集染色体超前凝集(prematurechromosomecondensation)。Meaning?Meaning?M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即细胞分期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即细胞分裂促进因子裂促进因子(

3、maturationpromotingfactor，MPF)。人人M期细胞与袋鼠（期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导期细胞融合诱导PCC卵细胞提取物注射实验卵细胞提取物注射实验Masui和和Markert在体外用孕酮诱导非洲爪蟾的卵母细胞成熟在体外用孕酮诱导非洲爪蟾的卵母细胞成熟Meaning?Meaning?：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，即促成熟因子的因子，即促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）。用成熟卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞，发现可以促进卵母用成熟

4、卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞，发现可以促进卵母细胞成熟。细胞成熟。19881988年年MallerMaller实验室的实验室的 J.Lohka J.Lohka 纯化了爪蟾的纯化了爪蟾的MPFMPF，经鉴定，经鉴定由由32KD32KD和和45KD45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。MPF的纯化的纯化细胞周期基因的发现细胞周期基因的发现LelandHartwellLelandHartwell 七十年代初，美国西雅图的华盛七十年代初，美国西雅图的华盛顿大学顿大学 Leland Hartwell，以芽殖酵母以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不

5、同细胞周为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株，分离出了期阶段的温度敏感突变株，分离出了几十个与细胞分裂有关的基因几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，cdc)。他发现他发现的一群基因，成为八十年代和九十年的一群基因，成为八十年代和九十年代人们研究细胞周期的主要对象。如芽殖酵母的代人们研究细胞周期的主要对象。如芽殖酵母的cdc28基因，基因，在在G2/M转换点发挥重要的功能。转换点发挥重要的功能。也也在在七七十十年年代代 ，英英国国牛牛津津大大学学的的 Paul Paul Nurse Nurse，用用另另外外一一种种酵酵母母裂裂殖殖酵酵母母为为

6、实实验验材材料料，同同样样发发现现了了许许多多细细胞胞周周期期调调控控基基因因，如如 ：裂裂殖殖酵酵母母cdc2 cdc2；通通过过对对它它们们的的分分子子生生物物学学和和生生物物化化学学研研究究，进一步的研究发现进一步的研究发现cdc2cdc2和和cdc28cdc28的的都都编编码码一一个个34KD34KD的的蛋蛋白白激激酶酶。这这个个酶酶的的激激活活和和失失活活调调控控细细胞胞周周期期运运转转，特特别别是是G2/M期期转转变变。但但研研究究者者很很快快发发现现，p34cdc28 或或p34cdc2单单独独并并不不具具有有激激酶酶活活性性，需需要要同同相相关关蛋蛋白白结结合后才具有活性（如合

7、后才具有活性（如p34cdc2和蛋白和蛋白p56cdc13结合）。结合）。PaulNurse和和和和美国科罗拉多大学的美国科罗拉多大学的美国科罗拉多大学的美国科罗拉多大学的MallerMaller合作证明合作证明合作证明合作证明（1990）证明证明P32实际上是实际上是CDC2的同源物。的同源物。1983年年英国的汉特实验室英国的汉特实验室 TimothyHunt发现海胆卵受精发现海胆卵受精后，卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在后，卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，时达到高峰，M结束后突然消失，结束后突然消

8、失，下轮间期又重新合成，故命名为下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白周期蛋白(cyclin)。细胞周期蛋白细胞周期蛋白(cyclin)的发现的发现 TimHuntTimHunt和和和和MallerMaller合作证明合作证明合作证明合作证明P45是是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。联系在一起。PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)催化亚基催化亚基活性有赖于周活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期期

9、蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,Cdks);调节亚基：调节亚基：周期蛋白周期蛋白(cyclin)。MPFMPF的结构组成的结构组成由两个不同的亚基组成的异质二聚体由两个不同的亚基组成的异质二聚体:Leland H.Hartwell R.Timothy(Tim)Hunt 2001年年诺贝尔生理学与医学生理学与医学奖授予了美国科学家授予了美国科学家Leland Hartwell和英国科学家蒂和英国科学家蒂TimHuntTimHunt、PaulNursePaulNurse，以表彰他，以表彰他们发现了了细胞周期的关胞周

10、期的关键调节机制。机制。三、周期蛋白三、周期蛋白 自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊，在脊椎动物的椎动物的A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。等。周期蛋白框，介导周期蛋白与周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合结合.M期G1期不同周期蛋白的表不同周期蛋白的表达时期不同，与不达时期不同，与不同的同的CDK结合，结合，调节不同调节不同CDK激激酶的活性。酶的活性。部分哺

11、乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。激酶活性的关系。已知已知30余种，在脊椎动物中为余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分为等。分为4类：类：G1型、型、G1/S型、型、S型、型、M型。型。不同类型的CDK/cyclin复合体四、四、CDK激酶和激酶和CDK激酶抑制物激酶抑制物 在酵母在酵母cdc2和和cdc28基因被分离后，几个实验室同时工基因被分离后，几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库，得到了一系列与文库，得到了一系

12、列与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段类似的氨基酸序列，二是都必须和类似的氨基酸序列，二是都必须和细胞周期蛋白结合才具细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。已经命名的已经命名的CDK激酶包括：激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被发现，最早被发现，被命名为被命名为CDK1。各种。各种CDK分子都含有一段类似的分子都含有一段类似的CDK激激酶结构域，其中一段酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋

13、的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。关。动物中已知动物中已知7种种CDK，均含有一段相似的保守序列即均含有一段相似的保守序列即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。与周期蛋白的结合有关。CDK激酶类似的激酶类似的CDK蛋白分子图解蛋白分子图解时 相 蛋白激酶 周期蛋白 G2M Cdk1 周期蛋白A，B G1S Cdk2 周期蛋白E S Cdk2 周期蛋白A?Cdk3?G1 Cdk4 周期蛋白D1，D2，D3 G1 Cdk5 周期蛋白D1，D2，D3 G1 Cdk6 周期蛋白D1，D2，D3 哺乳动物细胞

14、周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶哺乳动物细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶这类蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于细胞周期，这类蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于细胞周期，包包括括DNADNA合成的启动和终止，核膜、核仁的崩解和重新形成，合成的启动和终止，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纤层的降解和重新聚合，核纤层的降解和重新聚合，纺缍体的形成和消失等。它们纺缍体的形成和消失等。它们可根据作用的时期不同分为可根据作用的时期不同分为G1、G1/S、S期期CDK，及，及M期期CDK。细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CDK

15、I）对细胞周期起负调控作用，目前发现）对细胞周期起负调控作用，目前发现的的CDKI分为两大家族：分为两大家族：Ink4(Inhibitorofcdk4)，如，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制，特异性抑制cdk4cyclinD1、cdk6cyclinD1复合物。复合物。CIP/Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括：包括P21cip/waf1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数等，能抑制大多数CDK的激酶

16、活性，的激酶活性，P21cip/waf1还能与还能与DNA聚合酶聚合酶的辅助因子的辅助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）结合，直接抑制）结合，直接抑制DNA的合成。的合成。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子vCdk activity can be suppressed both by inhibitory phosphorylation and by inhibitory proteins(CKIs).P27Cdk inhibitor proteins(CKIs)蛋白激酶的活性可以受到某些激酶的磷酸化作用所抑制，蛋白激酶的活

17、性可以受到某些激酶的磷酸化作用所抑制，脱磷酸而有活性。脱磷酸而有活性。二、细胞周期运转调控二、细胞周期运转调控CDK激酶对细胞周期起着核心性的调控作用。激酶对细胞周期起着核心性的调控作用。不同种类的周期蛋白和不同种类的不同种类的周期蛋白和不同种类的CDK结合结合,构成构成不同的不同的CDK激酶。不同的激酶。不同的CDK激酶在细胞周期的激酶在细胞周期的不同时期表现出活性不同时期表现出活性,因而对细胞周期的不同时期因而对细胞周期的不同时期进行调节。进行调节。Cdk associates successively with different cyclins to trigger the diffe

18、rent events of the cycle.Cdk activity is usually terminated by cyclin degradation.酵母细胞周期的调控酵母细胞周期的调控哺乳动物哺乳动物细胞周期的调控细胞周期的调控哺乳动物的细胞周期受一个小型哺乳动物的细胞周期受一个小型Cdks家族的调节。在哺乳动家族的调节。在哺乳动物细胞周期中起作用的物细胞周期中起作用的Cdks,Cdk1、Cdk2、Cdk3等。哺乳等。哺乳动物细胞中也能表达多种周期蛋白动物细胞中也能表达多种周期蛋白:周期蛋白周期蛋白A、B、D和和E。（一）（一）G2/M期转化与期转化与CDK1激酶的关键性调控作

19、用激酶的关键性调控作用 CDK1激酶（激酶（p34cdc2激酶），由激酶），由p34cdc2蛋白（或蛋白（或p34cdc28蛋蛋白）与周期蛋白白）与周期蛋白B组成。组成。Cyclin B的合成在的合成在G2/M时达到高峰，时达到高峰，随着随着M期的结束而发生降解，细胞从期的结束而发生降解，细胞从G2期向期向M期的转变受此蛋期的转变受此蛋白的调节。白的调节。周期蛋白在周期蛋白在CDK1激酶活性调节中的作用激酶活性调节中的作用CDK1激酶的激活促进细胞进入分裂期激酶的激活促进细胞进入分裂期在在S期期,Weel1活性高，活性高，可以促进可以促进Thr14和和Tyr15的磷酸化，的磷酸化，Cdc25活

20、性低。活性低。在期在期Cdc25活性增强，促进活性增强，促进Thr14和和Tyr15的去磷酸化的去磷酸化CAK=CDK1-Activiting Kinase细胞中细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控激酶的活性受到多种因素的调控 CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。酸），参与细胞的多种功能。cyclinB/A与与CDK1结合，结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜

21、解体等下游细胞周期事件（二）（二）M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化细胞周期运转到中期后，细胞周期运转到中期后，M期期周期蛋白周期蛋白A和和B降降解，解，CDK1激酶活性丧失，蛋白去磷酸化，由中期激酶活性丧失，蛋白去磷酸化，由中期向后期转化。向后期转化。M期周期蛋白期周期蛋白N端有端有破坏框破坏框。在中期当。在中期当MPF活性达到最高活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活泛素酶复合物，将泛素连接在时，通过一种未知的途径，激活泛素酶复合物，将泛素连接在M期周期蛋白上，导致期周期蛋白上，导致其其被蛋白酶体降解被蛋白酶体降解.泛素激活酶泛素激活酶(E1)的半胱氨

22、酸残基形成硫酯键而激活。的半胱氨酸残基形成硫酯键而激活。E1转移到转移到泛素结合酶泛素结合酶(E2)的半胱氨酸残基。的半胱氨酸残基。3.E2和和泛素连接酶泛素连接酶(E3)一起将泛素转移到底物蛋白的赖氨酸一起将泛素转移到底物蛋白的赖氨酸残基残基,在那里进行泛素的聚合化在那里进行泛素的聚合化,最后作为蛋白酶体的降解底最后作为蛋白酶体的降解底物物,被快速降解。被快速降解。泛素加到周期蛋白上需要三种不同的酶介导泛素加到周期蛋白上需要三种不同的酶介导:泛素连接酶泛素连接酶(E3)又称为又称为后期促进复合物后期促进复合物(anaphase-promotingcomplex,APC)至少有至少有8 8种成

23、分组成，分别称为种成分组成，分别称为APC1APC1至至APC8APC8。APCAPC可以促使可以促使M M期周期蛋白泛素化途径降解，此外也调节其他一期周期蛋白泛素化途径降解，此外也调节其他一些与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解。些与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解。后期促进因子后期促进因子APCAPC活性的受到多种调节。活性的受到多种调节。首先，首先，APCAPC活性受活性受MPFMPF的调节。的调节。其次，其次，APC 受到受到Cdc20的正调控；的正调控；Cdc20位于染色体的动粒上位于染色体的动粒上.v在未被在未被被动粒微管捕捉的动粒上被动粒微管捕捉的动粒上Mad2

24、 蛋白蛋白与与Cdc20结合抑制结合抑制其活性其活性v若动粒被动粒微管捕捉若动粒被动粒微管捕捉,则则Mad2从动粒上消失从动粒上消失,对对Cdc20的抑制的抑制解除解除,促使促使APC活化，纺锤体装配不完全，或所有动粒不能被动活化，纺锤体装配不完全，或所有动粒不能被动粒微管全部捕捉，粒微管全部捕捉，APC则不能被激活。则不能被激活。纺锤体装配检验点纺锤体装配检验点（三）（三）G1/S期转化与期转化与G1期周期蛋白依赖性期周期蛋白依赖性CDK激酶激酶细胞由细胞由G1G1向向S S期转化受期转化受G1G1期周期蛋白依赖性激酶期周期蛋白依赖性激酶所所控制：控制：G1 G1期激酶：期激酶：CDK4CD

25、K4、CDK6CDK6 G1G1期周期蛋白期周期蛋白：cyclin D,Ecyclin D,E。cyclin D cyclin D 的合成对细胞生长因子有强烈的依赖性的合成对细胞生长因子有强烈的依赖性RbbindwithE2FtranscriptionfactorRb是是G1/S期转化的负性调控因子期转化的负性调控因子,在在G1晚期通过磷酸化而失活晚期通过磷酸化而失活 Rb蛋白磷酸化蛋白磷酸化与之结合的转录因子（与之结合的转录因子（E2F）释放）释放S期所需期所需的基因转录的阻断被解除的基因转录的阻断被解除细胞进入细胞进入S期；期；Rb蛋白为蛋白为视网膜母细胞瘤（视网膜母细胞瘤（retinob

26、lastoma，Rb）基因）基因编码编码周期蛋白周期蛋白E与与CDK2结合，使之激活结合，使之激活,使使与与RB RB 类似的蛋白质类似的蛋白质底底物物p107p107磷酸化而解除其对磷酸化而解除其对E2F的抑制作用，的抑制作用，促进细胞通过促进细胞通过G1/S限制点而进入限制点而进入S期。期。周期蛋白周期蛋白E在在G1晚期表达晚期表达,进入进入S期后降解期后降解.除除G1期周期蛋白依赖性期周期蛋白依赖性CDK激酶外激酶外,细胞内还存在其它的细胞内还存在其它的多种因子对多种因子对DNA复制起始活动的调节复制起始活动的调节.复制起始点识别复合体（复制起始点识别复合体（Originrecognit

27、ioncomplex,ORC），识别并结合），识别并结合DNA复制起始点是复制起始点是DNA复制所必须的复制所必须的.一、名词：一、名词：细胞周期、中期中细胞、静止期细胞、终末分化细胞、联会、细胞周期、中期中细胞、静止期细胞、终末分化细胞、联会、联会复合体、联会复合体、MPFMPF、PCCPCC、周期蛋白、周期蛋白、CDKCDK二、问答：二、问答：1 什么是细胞周期？细胞周期各时期的主要变化是什么？什么是细胞周期？细胞周期各时期的主要变化是什么？2 细胞周期同步化有哪些方法？比较其优缺点。细胞周期同步化有哪些方法？比较其优缺点。3 细胞通过什么机制将染色体排列到赤道板上？细胞通过什么机制将染色体排列到赤道板上？4 说明细胞分裂后期染色单体分离和向两极移动的机制。说明细胞分裂后期染色单体分离和向两极移动的机制。5 细胞周期中有哪些主要检验点，各起何作用？细胞周期中有哪些主要检验点，各起何作用？6 简述简述MPF的组成和在的组成和在G2/M期进程中的作用。期进程中的作用。