药物分析课件甾体激素类药物的分析.ppt

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1、第十章第十章 甾体激素类药物的分析甾体激素类药物的分析n甾体激素类药物甾体激素类药物（steroid hormone drugs）：）：是指分子结构中含有是指分子结构中含有甾体母核甾体母核的激素类药物。的激素类药物。分子结构中均具有分子结构中均具有环戊烷并多氢菲环戊烷并多氢菲母核，是临母核，是临床上较为重要的一类药物。床上较为重要的一类药物。来源来源：天然物、人工合成品。：天然物、人工合成品。如如：氢化可的松氢化可的松、睾酮睾酮、雌二醇雌二醇、黄体酮黄体酮等。等。中国药典收载本类药物及其各种制剂中国药典收载本类药物及其各种制剂97个品种。个品种。第一节第一节 基本结构和分类基本结构和分类n一、

2、基本结构：一、基本结构：环戊烷并多氢菲母核环戊烷并多氢菲母核二、分类与结构特征二、分类与结构特征n分类分类 两大类两大类 肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素 性激素性激素 简称简称皮质激素皮质激素 雄性激素与蛋白同雄性激素与蛋白同化激素化激素 雌激素、孕激素雌激素、孕激素（一）肾上腺皮质激素（一）肾上腺皮质激素n本类药物均可视作本类药物均可视作皮质酮皮质酮的的衍生物衍生物 （I）皮质酮皮质酮 （II）氢化可的松氢化可的松 corticosterone hydrocortisone （III）地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 （IV）醋醋酸氟轻松酸氟轻松主要结构特征主要结构特征n（1）A环环的的C3上有上

3、有酮基酮基；C4/C5间有间有双键双键，并，并与与C3酮基共轭酮基共轭，称为，称为，-不饱和酮不饱和酮，标记为，标记为 4-3-酮酮。n（2）D环环的的C17上有上有-醇酮基醇酮基（-ketol）侧）侧链（链（）。）。n（3）合成甾体合成甾体抗炎药在结构上多具有抗炎药在结构上多具有C1/C2间间双键双键；C6-、C9-卤素卤素；C16-羟基羟基、甲基甲基；C17-羟基羟基等取代基。等取代基。如：地塞米松磷酸钠、醋酸氟轻松。如：地塞米松磷酸钠、醋酸氟轻松。（二）雄性激素与蛋白同化激素（二）雄性激素与蛋白同化激素n睾酮睾酮（睾丸素睾丸素）衍生物衍生物n某些蛋白同化激素在某些蛋白同化激素在C10上上

4、无无19-角甲基角甲基，如，如苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙。n中国药典收载的原料与制剂：丙酸睾酮、十一酸睾酮、甲睾酮、硫酸普拉中国药典收载的原料与制剂：丙酸睾酮、十一酸睾酮、甲睾酮、硫酸普拉睾酮钠。睾酮钠。（V）睾丸素睾丸素 （VI）苯苯丙酸诺龙丙酸诺龙 testosterone nandrolone phenylpropionate 可供分析主要结构特征可供分析主要结构特征：A环的环的 4-3-酮酮结构结构（三）雌激素（三）雌激素n雌二醇雌二醇及其及其C17-羧酸酯类羧酸酯类：戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇n C17-乙炔基衍生物乙炔基衍生物：炔雌醇、炔雌醚、尼尔雌醇炔雌醇、炔雌醚

5、、尼尔雌醇 （VII）雌二醇雌二醇 estradiol （VIII）炔雌醇炔雌醇ethinylestradioln可供分析结构特征可供分析结构特征（1）A环环苯环苯环，具有，具有C3-酚羟基酚羟基；（2）D环的环的C17上具有上具有-乙炔基乙炔基。（四）孕激素（四）孕激素（黄体激素）（黄体激素）n黄体酮黄体酮及其及其衍生物衍生物n如：己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮如：己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 （IX）黄体酮黄体酮 progesteronen可供分析结构特征：可供分析结构特征：（1）A环具有环具有 4-3-酮酮结构结构 （2）D环的环的C17上有

6、上有甲酮基甲酮基（ketone）侧链（）侧链（）（五）其它（五）其它n中国药典收载的口服避孕药：中国药典收载的口服避孕药：炔诺酮炔诺酮及及衍生物衍生物n如：如：炔孕酮炔孕酮、炔诺孕酮炔诺孕酮、左炔诺孕酮左炔诺孕酮 （X）炔诺酮炔诺酮 norethisteronen结构特征：在结构上具有上述各类性激素的结构特征：在结构上具有上述各类性激素的特征特征 （1）A环具有环具有 4-3-酮酮结构（皮质激素、雄性激素、孕激素类）结构（皮质激素、雄性激素、孕激素类）（2）D环的环的C17上多具有上多具有-炔基炔基（雌激素类）（雌激素类）（3）C10上多上多无无19-角甲基角甲基（雌激素类）（雌激素类）炔诺孕

7、酮炔诺孕酮 炔炔孕酮孕酮 （norgestrel）（ethisterone）第二节第二节 鉴别试验鉴别试验n与强酸的呈色反应与强酸的呈色反应n官能团的反应官能团的反应n测定衍生物熔点测定衍生物熔点n酯类的反应酯类的反应n紫外分光光度法紫外分光光度法n红外分光光度法红外分光光度法n薄层色谱法薄层色谱法n高效液相色谱法高效液相色谱法一、与强酸的呈色反应一、与强酸的呈色反应n甾体激素甾体激素 硫酸硫酸（硫酸（硫酸-乙醇）、磷酸、高氯酸、盐酸乙醇）、磷酸、高氯酸、盐酸 呈色呈色n反应机理：反应机理：4-3-酮酮 浓硫酸浓硫酸 质子化质子化 正碳离子正碳离子（共轭共轭体系体系）显色显色 表表10-2 某

8、些甾体激素与硫酸的呈色反应某些甾体激素与硫酸的呈色反应（溶液颜色、溶液荧光、加（溶液颜色、溶液荧光、加水稀释后现象）水稀释后现象）特点特点：甾体：甾体母核反应母核反应，操作简便，不同甾体形成溶液颜色或荧光各不相同，操作简便，不同甾体形成溶液颜色或荧光各不相同，可以互相区别。但可以互相区别。但专属性稍差专属性稍差，反应，反应较灵敏较灵敏。操作中对取样量和试剂用。操作中对取样量和试剂用量要求量要求较为严格较为严格。中国、英、日国家药典采用此方法中国、英、日国家药典采用此方法中国药典鉴别醋酸可的松中国药典鉴别醋酸可的松二、官能团的反应二、官能团的反应n酮基的反应酮基的反应nC17-醇酮基的反应醇酮基

9、的反应n甲酮基或活泼亚甲基的反应甲酮基或活泼亚甲基的反应n酚羟基的反应酚羟基的反应n氟元素的反应氟元素的反应n乙炔基的反应乙炔基的反应（一）酮基的反应（一）酮基的反应n 4-3-酮、酮、C20-酮基酮基 +羰基试剂羰基试剂 呈色呈色 （异烟肼、硫酸苯肼、（异烟肼、硫酸苯肼、2,4-二硝基苯肼）二硝基苯肼）+HCl 黄体酮黄体酮 异烟肼异烟肼 黄色黄色反应速度反应速度:4-3-酮酮（即刻反应）（即刻反应）1,4-3-酮酮(13min)C20-酮基酮基(更长时间更长时间)(二二)C17-醇酮基的反应醇酮基的反应n皮质激素分子结构中皮质激素分子结构中 C17 位上的位上的 -醇酮基醇酮基 还原性还原

10、性 氧化剂氧化氧化剂氧化 被还原析出被还原析出沉淀沉淀或或显色显色 水水合醛合醛氧化剂氧化剂：碱性碱性酒石酸铜酒石酸铜试液、试液、氨制氨制硝酸银硝酸银试液、试液、碱性碱性四氮唑四氮唑试液试液1.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应(斐林试液斐林试液)+2Cu2+4OH-醋酸泼尼松醋酸泼尼松 +Cu2O+2H2O 红色红色 水合醛水合醛 2.与氨制硝酸银试液反应与氨制硝酸银试液反应(多伦试液多伦试液)+2Ag+2OH-醋酸去氧皮质酮醋酸去氧皮质酮 +2Ag+CH3COOH 黑色黑色3.与碱性四氮唑试液反应与碱性四氮唑试液反应n四氮唑盐四氮唑盐:氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑(TTC);蓝四

11、氮唑蓝四氮唑(BT)n结构如下结构如下:还原还原 还原还原 单甲单甲 （红色）（红色）双甲双甲 （蓝（蓝色）色）n应用：应用：-醇酮基醇酮基的的鉴别鉴别皮质激素中皮质激素中“其他甾体其他甾体”TLC检出试剂检出试剂含量测定显色试剂含量测定显色试剂 TTC BT反应原理如下：反应原理如下：+H2O 醋酸泼尼松醋酸泼尼松 TTC +CH3COOH 水合醛水合醛 深红色深红色（三）甲酮基或活泼亚甲基的反应（三）甲酮基或活泼亚甲基的反应 亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠 间二硝基苯间二硝基苯 芳香醛芳香醛 呈色呈色n甲酮基甲酮基的反应的反应n亚甲基亚甲基的反应的反应1.甲酮基的反应甲酮基的反应n黄体酮约黄

12、体酮约5mg 至置小试管中至置小试管中 加加甲醇甲醇ml 加亚硝基铁氰化钠的细粉约加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg、碳酸钠及醋酸铵各约、碳酸钠及醋酸铵各约50mg 摇匀摇匀 放置放置1030min 显显蓝紫色蓝紫色 含有含有C17-甲酮基甲酮基的黄体酮的的黄体酮的灵敏灵敏、专属专属的的鉴别方法鉴别方法甲酮基的反应原理甲酮基的反应原理 +Fe(CN)5(NO)2-+2OH-黄体酮黄体酮 +2H2O 配位阴离子配位阴离子 蓝紫色蓝紫色2.亚甲基的反应亚甲基的反应n硫酸普拉睾酮钠硫酸普拉睾酮钠约约10mg，加乙醇，加乙醇1ml溶解，加溶解，加间二硝基苯间二硝基苯约约10mg使溶解，加氢使溶解，加氢氧化

13、钠试液数滴氧化钠试液数滴 显显紫红色紫红色 +OH-+H2O 共轭结构（共轭结构（紫红色紫红色）(四四)酚羟基的反应酚羟基的反应n雌激素类具有雌激素类具有C3位酚羟基位酚羟基，C4位（芳香环的位（芳香环的 位位）上的氢较为）上的氢较为活泼活泼，能与，能与重氮苯磺酸偶合生成重氮苯磺酸偶合生成红色偶氮化合物红色偶氮化合物。+苯甲酸雌二醇苯甲酸雌二醇 红色红色偶氮化合物偶氮化合物(五五)氟元素的反应氟元素的反应 含含氟氟甾体激素类药物甾体激素类药物 （醋酸氟轻松（醋酸氟轻松 醋酸地塞米松）醋酸地塞米松）氧瓶燃烧氧瓶燃烧 无机氟化物无机氟化物 茜素氟蓝茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸亚铈 蓝紫色蓝紫色(六六)乙

14、炔基的反应乙炔基的反应 +AgNO3 +HNO3 白色乙炔盐沉淀白色乙炔盐沉淀三、测定衍生物熔点三、测定衍生物熔点 甾体激素类药物甾体激素类药物 甾体激素酯甾体激素酯类类 试剂试剂 反应反应 醇制碱液醇制碱液 水解水解 酯、肟、缩氨基脲酯、肟、缩氨基脲 游离游离甾体甾体 测熔点测熔点 （一）酮肟的生成（一）酮肟的生成 +HONH2 +H2O （盐酸（盐酸羟胺羟胺醋酸钠试液）醋酸钠试液）炔诺孕酮炔诺孕酮 沉淀沉淀 滤过滤过 水洗水洗 重结晶重结晶 测熔点约为测熔点约为195C，熔融同时分解，熔融同时分解（二）缩氨基脲的生成（二）缩氨基脲的生成 +H2NCONHNH2 （盐酸氨基脲试液盐酸氨基脲试

15、液）苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙 +H2O 熔点熔点约为约为180C 四、酯类的反应四、酯类的反应 甾体激素多以甾体激素多以羧酸酯类羧酸酯类用药用药 水解水解 乙醇制氢氧化碱乙醇制氢氧化碱 游离羧酸游离羧酸 乙醇、硫酸（乙醇、硫酸（12）共热）共热 羧酸乙酯羧酸乙酯 蒸除乙醇与硫酸共热蒸除乙醇与硫酸共热 香气香气 产生产生羧酸特臭羧酸特臭五、紫外分光光度法五、紫外分光光度法 多数甾体激素类药物多数甾体激素类药物 共轭体系共轭体系 紫外吸收紫外吸收 （规定规定 max、A、Amax/Amin）六、红外分光光度法六、红外分光光度法n甾体药物结构复杂甾体药物结构复杂 红外光谱红外光谱鉴别鉴别n各国药典收载的

16、甾体激素类药物，各国药典收载的甾体激素类药物，几乎都采用几乎都采用红外光谱作为鉴别方法之一。红外光谱作为鉴别方法之一。n中国药典收载甾体激素原料药中国药典收载甾体激素原料药40种，种，37种采种采用红外光谱作为鉴别。用红外光谱作为鉴别。n表表10-3 甾体激素某些基团的特征吸收频率甾体激素某些基团的特征吸收频率七、薄层色谱法七、薄层色谱法n薄层色谱法（薄层色谱法（TLC）一些国家用作甾一些国家用作甾体激素类体激素类药物制剂药物制剂的主要的主要鉴别方法鉴别方法之一。之一。n中国药典用中国药典用TLC鉴别的药物和制剂有十余个品鉴别的药物和制剂有十余个品种。种。n例：醋酸泼尼松片的鉴别例：醋酸泼尼松

17、片的鉴别 薄层板：硅胶薄层板：硅胶G板板 展开剂：二氯甲烷展开剂：二氯甲烷-乙醚乙醚-甲醇甲醇-水（水（385:60:15:2）显色剂：显色剂：碱性四氮唑蓝碱性四氮唑蓝 对照品：醋酸泼尼松对照品：醋酸泼尼松八、高效液相色谱法八、高效液相色谱法nHPLC鉴别法鉴别法：一般采用在含量测定项：一般采用在含量测定项下记录的下记录的HPLC图中图中供试品供试品峰的保留时间峰的保留时间应与应与对照品对照品峰的峰的保留时间一致保留时间一致。n特点特点：简便、快速、高分离效能。：简便、快速、高分离效能。n中国药典采用中国药典采用HPLC鉴别鉴别醋酸氟轻松软膏醋酸氟轻松软膏等十余个品种。等十余个品种。第三节第三

18、节 特殊杂质检查特殊杂质检查n杂质杂质：原料原料、中间体中间体、异构体异构体、降解产物降解产物、试剂试剂、溶剂溶剂。n检查项目检查项目：n 特殊杂质特殊杂质（有关物质）（有关物质）“其他甾体其他甾体”（主要主要）n 其它检查项目其它检查项目n 地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠 游离磷酸游离磷酸n 地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 甲醇甲醇、丙酮丙酮n 醋酸氟轻松醋酸氟轻松 氟氟n 炔诺孕酮炔诺孕酮 乙炔基乙炔基n 醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、泼尼松龙醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、泼尼松龙 硒硒一、游离磷酸一、游离磷酸n来源：磷酸酯化时残存的来源：磷酸酯化时残存的过量磷酸过

19、量磷酸n检查方法：检查方法：钼蓝比色法钼蓝比色法n原理：磷酸原理：磷酸+钼酸铵钼酸铵 酸性溶液酸性溶液 磷钼酸铵磷钼酸铵 还原还原 磷铵酸蓝（磷铵酸蓝（钼蓝钼蓝）=740nm 有有最大吸收最大吸收 例：中国药典收载的地塞米松钠的检查例：中国药典收载的地塞米松钠的检查 结果：结果：在在740nm处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得 大于对照溶液的吸收度。大于对照溶液的吸收度。二、甲醇和丙酮二、甲醇和丙酮 地塞米松磷酸钠中地塞米松磷酸钠中甲醇甲醇和和丙酮丙酮的检查的检查n来源来源：在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮：在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮n检查检查：气相色谱

20、法气相色谱法n规定规定：含丙酮不得过：含丙酮不得过0.5%(g/g)，含，含甲醇甲醇不得不得 过过0.3%(g/g)。n为什么药典规定作甲醇与丙酮残留量检查？n由于甲醇对人体有害，若用丙酮冲洗数次即可除尽甲醇。故药典规定采用由于甲醇对人体有害，若用丙酮冲洗数次即可除尽甲醇。故药典规定采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。三、硒三、硒n来源来源：生产中使用：生产中使用二氧化硒二氧化硒脱氢工艺脱氢工艺n检查原理检查原理：氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法破坏破坏 Se（VI）盐酸羟胺盐酸羟胺 Se（IV）2,3-二氨基萘二氨基萘 pH2 4,5-苯并硒二唑苯并硒二唑 环己烷提取环己

21、烷提取 378nm最大吸收最大吸收测定供试品溶液和对照品溶液在测定供试品溶液和对照品溶液在378nm波长处的吸收度并进行波长处的吸收度并进行比较，来判断供试品中的硒是否超过了限量。比较，来判断供试品中的硒是否超过了限量。四、其他甾体四、其他甾体n 其他甾体其他甾体（有关物质有关物质）甾体激素类药物甾体激素类药物主要杂质主要杂质n 限量检查限量检查 甾体激素药物甾体激素药物纯度检查重要项目纯度检查重要项目n 检查方法检查方法 TLC、HPLC（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法n1.方法方法：主成分自身对照法主成分自身对照法（高低浓度对照法高低浓度对照法）即将供试品制成高、低二种浓度的溶液。即将供试

22、品制成高、低二种浓度的溶液。高浓度溶液作为供试溶液；低浓度作为对照溶液。高浓度溶液作为供试溶液；低浓度作为对照溶液。n2.判定法判定法：供试溶液图谱中供试溶液图谱中杂质斑点杂质斑点的的数目数目和和颜色颜色与对与对照溶液图谱的照溶液图谱的主斑点主斑点进行进行比较比较，即通过杂质总数和各单一杂，即通过杂质总数和各单一杂质的量进行控制。质的量进行控制。n3.检查示例检查示例：醋酸氟轻松中其他甾体的检查醋酸氟轻松中其他甾体的检查n薄层板：硅胶薄层板：硅胶G 结果判断：结果判断：供试品溶液如显杂质斑点，供试品溶液如显杂质斑点，不不n展开剂：氯仿展开剂：氯仿-甲醇（甲醇（97:3）得多于得多于2个，其颜个

23、，其颜色与对照色与对照n显色剂：显色剂：四氮唑蓝四氮唑蓝 溶液的主斑点溶液的主斑点比较，比较，不得更不得更深。深。（二）高效液相色谱法（二）高效液相色谱法n1.色谱条件色谱条件n2.方法方法：主成分自身对照法主成分自身对照法或或面积归一化法面积归一化法n3.判定法判定法：供试溶液的色谱图中杂质峰的数目和各单一供试溶液的色谱图中杂质峰的数目和各单一杂质峰面积及其总和，与对照溶液的主峰面积比较或用归一杂质峰面积及其总和，与对照溶液的主峰面积比较或用归一化法计算相对含量。化法计算相对含量。n4.检查示例检查示例：甲睾酮甲睾酮中其他甾体的检查法中其他甾体的检查法n 结果判断结果判断：供试溶液如显杂质峰

24、，：供试溶液如显杂质峰，不得超过不得超过3个个，各杂质峰，各杂质峰面积及其总和分别面积及其总和分别不得大于不得大于对照溶液主峰面积的对照溶液主峰面积的1/2和和3/4。第四节第四节 含量测定含量测定n依据依据：不同类别不同类别的的特征基团特征基团的性质的性质n方法方法：紫外分光光度法紫外分光光度法、比色法比色法、色谱法色谱法n 高效液相色谱法高效液相色谱法n 紫外分光光度法紫外分光光度法n 四氮唑盐比色法四氮唑盐比色法n 异烟肼比色法异烟肼比色法n 柯柏比色法柯柏比色法一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法n2000年版收载甾体激素类原料药与各种制剂年版收载甾体激素类原料药与各种制剂97种，种，

25、65个品种采用个品种采用HPLC测定含量。测定含量。nRP-HPLC ：n色谱柱填料（色谱柱填料（ODS）n流动相流动相（甲醇甲醇-水水 or 乙腈乙腈-水水）；少数药物使用磷酸盐或醋酸）；少数药物使用磷酸盐或醋酸盐缓冲液；流动相中加冰醋酸或三乙胺；个别药物在流动相盐缓冲液；流动相中加冰醋酸或三乙胺；个别药物在流动相中加入四氢呋喃、异丙醇、乙醚等有机改性剂，以改善峰形、中加入四氢呋喃、异丙醇、乙醚等有机改性剂，以改善峰形、提高分离效能。提高分离效能。n检测检测：4-3-酮酮或或苯苯 紫外检测，检测波长紫外检测，检测波长240nm或或280nm附近。附近。n示例：黄体酮、地塞米松磷酸钠含量测定（

26、祥见讲义）示例：黄体酮、地塞米松磷酸钠含量测定（祥见讲义）二、紫外分光光度法二、紫外分光光度法n max=240nm or 280nm附近附近 UV测定测定nUV法专属性较差（相对于法专属性较差（相对于HPLC），但），但简便简便易行易行，有，有可靠的准确度可靠的准确度。n在中国药典中在中国药典中UV法应用仅次于法应用仅次于HPLC。三、四氮唑盐比色法三、四氮唑盐比色法n反应原理同前反应原理同前n四氮唑盐还原产物在可见光区有最大吸收，反四氮唑盐还原产物在可见光区有最大吸收，反应可定量完成，生成的有色甲应可定量完成，生成的有色甲 具一定稳定具一定稳定性，可用于甾体激素类药物的比色分析。性，可用于甾体激素类药物的比色分析。n测定方法及反应各种影响因素祥见讲义测定方法及反应各种影响因素祥见讲义自学内容自学内容n四、异烟肼比色法四、异烟肼比色法n五、柯柏比色法五、柯柏比色法