高效液相色谱法及超临界流体色谱法.ppt

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1、现代分析技术现代分析技术 第十章第十章第十章第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法10.1 10.1 概述概述概述概述10.2 10.2 高效液相色谱法的基本原理高效液相色谱法的基本原理高效液相色谱法的基本原理高效液相色谱法的基本原理10.3 10.3 高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型 10.4 10.4 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪10.5 10.5 超临界流体色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法10.6 10.6 实验技术实验技术实验技术实验技术2 210.1 概

2、述概述HPLC HPLC high velocity,high resolutionhigh velocity,high resolutionand high sensitivityand high sensitivityHHigh-igh-P Performance erformance L Liquid Chromatographyiquid ChromatographyHHigh-igh-P Pressureressure L Liquid Chromatographyiquid ChromatographyHHigh-igh-P Pricerice L Liquid Chromatog

3、raphyiquid Chromatography3 34 45 510.2 HPLC的基本原理的基本原理GCGC的基本理论、基本概念适用于的基本理论、基本概念适用于的基本理论、基本概念适用于的基本理论、基本概念适用于HPLCHPLC。液相色谱的液相色谱的液相色谱的液相色谱的van Deemtervan Deemter方程方程方程方程6 6涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项板高板高板高板高H H越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面越小，分

4、离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面综合考虑，综合考虑，综合考虑，综合考虑，提高提高HPLC的柱效的措施的柱效的措施采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；流动相采用小分子溶剂，减小粘度流动相采用小分子溶剂，减小粘度流动相采用小分子溶剂，减小粘度流动相采用小分子溶剂，减小粘度(H

5、 H2 2OO、ACNACN、MeOH)MeOH)；适当提高柱温，增大适当提高柱温，增大适当提高柱温，增大适当提高柱温，增大D Dmm；采用一定的流动相流速采用一定的流动相流速采用一定的流动相流速采用一定的流动相流速u u(一般一般一般一般1 1 mLmL/min/min)7 7柱外效应柱外效应柱外效应柱外效应：柱前峰展宽柱后峰展宽：柱前峰展宽柱后峰展宽：柱前峰展宽柱后峰展宽：柱前峰展宽柱后峰展宽柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前后展宽检测器流通池和连接管引起柱前后

6、展宽检测器流通池和连接管引起柱前后展宽检测器流通池和连接管引起柱前后展宽检测器流通池和连接管引起10.3 HPLC的类型的类型 I 液液分配色谱法液液分配色谱法 Liquid Liquid Partition Chromatography,LLPC固定相与流动相均为液体固定相与流动相均为液体(互不相溶互不相溶)；基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离；：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离；固定相固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：将：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游

7、离羟基上。各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。8 8（1 1 1 1）寿命长寿命长寿命长寿命长，固定液不易流失，柱稳定性高；固定液不易流失，柱稳定性高；（2 2 2 2）传质快传质快传质快传质快，表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快；表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（4 4 4 4）选择性好选择性好选择性好选择性好，可键合不同基团改变其选择性；可键合不同基团改变其选择性；（5 5 5 5）耐受各种溶剂，）耐受各种溶剂，）耐受各种溶剂，）耐受各种溶剂，有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；流动相类别流动相类别流动相流动相按极性分

8、：按极性分：极性极性(乙腈、甲醇、水乙腈、甲醇、水)；弱极性弱极性(氯仿、乙酸乙酯氯仿、乙酸乙酯)；非极性非极性(己烷己烷)；9 9正相色谱法正相色谱法反向色谱法反向色谱法采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。改进分离或调整出峰时间。II 液固吸附色谱法液固吸附色谱法Liquid Solid Absorption Chromatography,LSAC 1 10 0固定相：固体吸附剂（硅胶）固定相：固体吸附剂（硅胶）基本原理基本原理基本原理基本原理：根据组分在固定相

9、上的吸附作用的不同进行分离；：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离；样品分子样品分子(X X)被流动相带入柱内，与流动相分子被流动相带入柱内，与流动相分子(S S)在吸附剂的表面在吸附剂的表面发生竞争性的吸附作用发生竞争性的吸附作用.吸附平衡常数吸附平衡常数 K K 越大，保留值越大。越大，保留值越大。LASCLASC中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂，中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂，己烷乙酸乙酯；己烷氯仿己烷乙酸乙酯；己烷氯仿III 离子交换色谱法离子交换色谱法 Ion Exchange Chromatography,IECK K 越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子

10、的保留越强；越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；分析对象：离子分析对象：离子分析对象：离子分析对象：离子(各种无机阴阳离子各种无机阴阳离子各种无机阴阳离子各种无机阴阳离子)：SOSO4 42+2+、NONO3 3、ClCl、NaNa、MgMg等等等等 有机酸碱、氨基酸有机酸碱、氨基酸有机酸碱、氨基酸有机酸碱、氨基酸1111固定相固定相：离子交换树脂：离子交换树脂(聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂)流动相

11、流动相：含有反离子的水溶液：含有反离子的水溶液(柠檬酸根离子、柠檬酸根离子、COCO3 3、F F)基本原理基本原理基本原理基本原理：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；12121313IV 离子对色谱法离子对色谱法 Ion Pair Chromatography,IPC固定相：固定相：固定相：固定相：C18/C8C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂的离子对试剂的离子对试剂的离子对

12、试剂流动相流动相流动相流动相：有机溶剂：有机溶剂：有机溶剂：有机溶剂(甲醇甲醇甲醇甲醇/乙腈水乙腈水乙腈水乙腈水)加入离子对试剂加入离子对试剂加入离子对试剂加入离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂：烷基铵类：烷基铵类：烷基铵类：烷基铵类：(C(C4 4H H9 9)4 4N N+OHOH-、C C1616H H3333(CH(CH3 3)3 3 N N+OHOH-(分析分析分析分析X X)烷基磺酸类烷基磺酸类烷基磺酸类烷基磺酸类 ：己烷磺酸钠己烷磺酸钠己烷磺酸钠己烷磺酸钠C C6 6H H1313SOSO3 3Na (Na (分析分析分析分析X X)基本原理基本原理基本原理基本原

13、理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。1414生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。分析对象：有机酸、有机碱等分析对象：有机酸、有机碱等分析对象：有机酸、有机碱等分析对象：有机酸、有机碱等ColumnColumn：IonPac NS1IonPac NS1、NG1NG1El

14、uent Eluent：2 mM TBAOH,24%2 mM TBAOH,24%48%ACN in 10 min48%ACN in 10 minFlow rateFlow rate：1.0 mL/min 1.0 mL/minDetectionDetection：Conductivity (suppressor type)Conductivity (suppressor type)RegeneratorRegenerator：10 mN H10 mN H2 2SOSO4 4 1.Methanesulfonic acid 5.0 g/mL(ppm)1.Methanesulfonic acid 5.

15、0 g/mL(ppm)4.1-Hexanesulfonic acid 8.8 4.1-Hexanesulfonic acid 8.8 5.1-Heptanesulfonic acid 8.9 5.1-Heptanesulfonic acid 8.9 6.1-Octanesulfonic acid 8.9 6.1-Octanesulfonic acid 8.90 0Retention time(min)Retention time(min)121216168 8 S S4 41 16 62 23 34 45 57 7反相离子对反相离子对反相离子对反相离子对色谱色谱色谱色谱分离分离分离分离有机酸有

16、机酸有机酸有机酸V 离子色谱法离子色谱法 Ion Chromatography,IC固定相固定相固定相固定相：离子交换树脂：离子交换树脂：离子交换树脂：离子交换树脂 流动相流动相流动相流动相：电解质溶液（高电导）：电解质溶液（高电导）：电解质溶液（高电导）：电解质溶液（高电导）分离原理分离原理分离原理分离原理：同：同：同：同IECIEC，离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测特点特点特点特点：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变：抑制柱将样品离子转

17、变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变成低电导成分降低背景干扰。成低电导成分降低背景干扰。成低电导成分降低背景干扰。成低电导成分降低背景干扰。1616分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等抑制器的作用抑制器的作用废废液液Back GroundBack Ground：Na Na2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3(700S)(700S)N

18、aF,NaCl,NaNONaF,NaCl,NaNO3 3NaNa2 2HPOHPO4 4,Na,Na2 2SOSO4 4Retention timeRetention timeC Co on nd du uc ct ti iv vi it ty yNaFNaFNaClNaClNaNONaNO3 3NaNa2 2HPOHPO4 4NaNa2 2SOSO4 4Back GroundBack Ground：Na Na2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3(700S)(700S)Retention timeRetention timeC Co on nd du uc ct ti iv vi

19、 it ty yHFHFHClHClHNOHNO3 3H H3 3POPO4 4H H2 2SOSO4 4Retention timeRetention timeBack GroundBack Ground：H H2 2COCO3 3(15S)(15S)C Co on nd du uc ct ti iv vi it ty y1717抑制器w 安装在安装在安装在安装在电导电导电导电导池之前池之前池之前池之前w 提高待提高待提高待提高待测测测测离子的离子的离子的离子的电导电导电导电导率率率率：NaNa+,ClCl-H H+,ClCl-提高灵敏度提高灵敏度提高灵敏度提高灵敏度w 降低背景降低背景降低

20、背景降低背景电导电导电导电导(淋洗液淋洗液淋洗液淋洗液):NaNa+,HCOHCO3 3-H H2 2COCO3 3 减少噪音减少噪音减少噪音减少噪音NaNa+,OHOH-HH2 2OO1818Y Y+NaNa+抑制器的工作原理抑制器的工作原理(阴离子阴离子)X X X X-:样样品中的阴离子品中的阴离子Y Y Y Y+:样样品中的阳离子品中的阳离子H H2 2O OH H2 2O OOHOH-NaNa+Y Y+H H2 2O NaO Na+Y Y+X X-Na Na+CO CO3 32 2-(样样品品,淋洗液淋洗液)H H+H H+CO+CO3 32-2-H H+X X-至至检测检测器器H

21、H2 2COCO3 3H H+X X-H H+O+O2 2H H2 2O OH H2 2 +OH+OH-H H2 2O ONaNa+OHOH-,H,H2 2H H2 2O,OO,O2 2 废废液液废废液液电电电电极极极极 （）（）（）（）电电电电极极极极 （）（）（）（）纯纯水或来自水或来自检检测测器的流体器的流体 H H+H H+H H+H H+阳离子交阳离子交换换膜膜阳离子交阳离子交换换膜膜1919H H2 2O OH H2 2O OH H+O+O2 2H H2 2O OH H2 2 +OH+OH-H H2 2O O废废液液/气体气体废废液液H H2 2O SOO SO4 42-2-Y Y

22、+X X-H H+MSA MSA-(样样样样品品品品e,e,淋洗液）淋洗液）淋洗液）淋洗液）OHOH-OHOH-MSAMSA-SOSO4 42-2-X X-OHOH-MSAMSA-SOSO4 42-2-X X-H H+MSAMSA-,O,O2 2H H2 2O,HO,H2 2H H+OH+OH-Y Y+OH+OH-H H+抑制器的工作原理抑制器的工作原理(阳离子阳离子)至至检测检测器器H H2 2O OY Y+OHOH-X X X X-:样样品中的阴离子品中的阴离子Y Y Y Y+:样样品中的阳离子品中的阳离子电电电电极极极极 （）（）（）（）电电电电极极极极 （）（）（）（）阴离子交阴离子交

23、换换膜膜阴离子交阴离子交换换膜膜纯纯水或来自水或来自检测检测器的液体器的液体 20202020VI 空间排阻色谱法空间排阻色谱法 Size Exclusion Chromatography,SEC2222固定相固定相固定相固定相：多孔性凝胶：多孔性凝胶：多孔性凝胶：多孔性凝胶 流动相流动相流动相流动相：水溶液或有机溶液：水溶液或有机溶液：水溶液或有机溶液：水溶液或有机溶液分离原理分离原理分离原理分离原理：分离组分的分子尺寸分离组分的分子尺寸分离组分的分子尺寸分离组分的分子尺寸 凝胶的孔径大小凝胶的孔径大小凝胶的孔径大小凝胶的孔径大小(葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶，琼脂

24、糖凝胶葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶)动画动画动画动画特点特点特点特点：体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来分析对象分析对象分析对象分析对象：高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）VII 亲和色谱法亲和色谱法 Affinity Chromatography,AC固定相固定相固定相固定相：固定相表面键合特异性配基：固定相表

25、面键合特异性配基：固定相表面键合特异性配基：固定相表面键合特异性配基流动相流动相流动相流动相：类似：类似：类似：类似LLPCLLPC（乙腈乙腈/甲醇、水等）甲醇、水等）分离原理分离原理分离原理分离原理：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离分离过程：一般流动相携带试样分离过程：一般流动相携带试样分离过程：一般流动相携带试样分离过程：一般流动相携带试样 亲和物与配基结合亲和物与配基结合亲和物与配基结合亲和物与配基结合强洗脱能力的流动相强洗脱能力的流动相强洗脱能力的流动相强洗脱能力的流动相 洗脱

26、亲和物（大分子）洗脱亲和物（大分子）洗脱亲和物（大分子）洗脱亲和物（大分子）2323分离对象：分离对象：分离对象：分离对象：酶与基质（或抑制剂）酶与基质（或抑制剂）酶与基质（或抑制剂）酶与基质（或抑制剂）抗原与抗体抗原与抗体抗原与抗体抗原与抗体激素与受体激素与受体激素与受体激素与受体外源凝集素与核酸的碱基对外源凝集素与核酸的碱基对外源凝集素与核酸的碱基对外源凝集素与核酸的碱基对10.4 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2424仪器特点：仪器特点：仪器特点：仪器特点：高压、高效、高速高压、高效、高速高压、高效、高速高压、高效、高速分离对象分离对象分离对象分离对象：生物大分子、天然产物、高分子化合物、

27、大多数高沸点有机化合物生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物 工作过程：工作过程：工作过程：工作过程：高压输液系统高压输液系统核心部件：核心部件：核心部件：核心部件：高压泵高压泵高压泵高压泵压力范围：压力范围：压力范围：压力范围：30 30 50 50 KPaKPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 7pH7不够不够不够不够灵敏。灵敏。灵

28、敏。灵敏。3333原理原理原理原理：利用待测物流入反应池时在工作电利用待测物流入反应池时在工作电利用待测物流入反应池时在工作电利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。通过，电流大小与待测物质浓度成正比。通过，电流大小与待测物质浓度成正比。通过，电流大小与待测物质浓度成正比。要点：要点：要点：要点：具有电活性物质具有电活性物质具有电活性物质具有电活性物质示差折光检测器示差折光检测器 differential refrac

29、tive index detector原原理理：样样品品组组分分的的折折射射率率与与流流动动相相折折射射率率有有差差异异，当当组组分分洗洗脱脱出出来来时时，会会引引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。要点要点：灵敏度低，不能用于梯度洗脱灵敏度低，不能用于梯度洗脱3434蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 evaporative light-scattering detector,ELSD 3535流出液流出液流出液流出液雾化器雾化雾化器雾化雾化器雾化雾化器雾化加热漂移加热漂移加热漂移加热漂移管加热管加热管加热管加热溶剂蒸发溶

30、剂蒸发溶剂蒸发溶剂蒸发激光束照在激光束照在激光束照在激光束照在溶质颗粒溶质颗粒溶质颗粒溶质颗粒产生光散射产生光散射产生光散射产生光散射散射光强只与溶质颗粒大小和数散射光强只与溶质颗粒大小和数散射光强只与溶质颗粒大小和数散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。量有关。量有关。量有关。要点要点：通用型质量检测器，通用型质量检测器，可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱分析对象分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测10.5 超临界流体色谱超临界流体色谱 supercritical fluid chromatography,SFC3636定义定义

31、定义定义：以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有GCGC和和和和HPLCHPLC的优点，的优点，的优点，的优点，适于分析适于分析适于分析适于分析GCGC不能分析的高沸点、低挥发性的试样。不能分析的高沸点、低挥发性的试样。不能分析的高沸点、低挥发性的试样。不能分析的高沸点、低挥发性的试样。超临界流体超临界流体超临界流体超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于

32、在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。液体和气体之间。液体和气体之间。液体和气体之间。超临界流体既不是气体，也不是超临界流体既不是气体，也不是超临界流体既不是气体，也不是超临界流体既不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的液体，而是一种介于二者之间的液体，而是一种介于二者之间的液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。一种对分离很有利的流体。一种对分离很有利的流体。一种对分离很有利的流体。超临界流体的特性超临界流体的特性37371 1 1 1）性质介于液体和气体之间；）性质介于液体和气体之间；）性质介于液体和气体之间；）性质介于液体和气体之间；气体气

33、体气体气体的的的的低黏度低黏度低黏度低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；，传质阻力小，可以快速高效的分离；，传质阻力小，可以快速高效的分离；，传质阻力小，可以快速高效的分离；液体液体液体液体的的的的高密度高密度高密度高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；SFCSFC的的的的扩扩扩扩散散散散系系系系数数数数、粘粘粘粘度度度度和和和和溶溶溶溶解解解解力力力力都都都都是是是是密密密密度度度度的的的的函函函函数数数数，可可可可通通通通过过过过改改改改变变变变SFCSFC

34、的密度调节组分分离的密度调节组分分离的密度调节组分分离的密度调节组分分离，超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。传质阻力小传质阻力小 适于低温适于低温SFC的固定相和流动相的固定相和流动相3838SFCSFC色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱：填充柱填充柱填充柱填充柱 ：颗粒：颗粒：颗粒：颗粒d dp p:3 3 10 10 m,Lm,Lcolcol:25 cm,25 cm,固定液膜厚：固定液膜厚：固定液膜厚：固定液膜厚：几几几几mm mm 交联毛细管柱交联毛细管柱交联毛细管柱交联毛细管柱：颗粒：颗粒：颗粒：颗粒 d df f:0

35、.05 0.05 1 m 1 m ,L,Lcolcol:10 20 cm,10 20 cm,固定液膜厚固定液膜厚固定液膜厚固定液膜厚0.05 0.05 1 m 1 m SFCSFC的固定相的固定相的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物要点：要点：COCO2 2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；性好，在紫外光区无吸收；缺点缺点：极性太弱；加少量甲醇等

36、改性；：极性太弱；加少量甲醇等改性；SFCSFC的流动相的流动相的流动相的流动相：超临界流体色谱仪器超临界流体色谱仪器3939 与与与与HPLCHPLC差别：差别：差别：差别：1.1.HPLCHPLC只在柱入口加压，只在柱入口加压，只在柱入口加压，只在柱入口加压，而而而而SFCSFC整个都处于高压整个都处于高压整个都处于高压整个都处于高压下，使流动相处于高密下，使流动相处于高密下，使流动相处于高密下，使流动相处于高密度状态；度状态；度状态；度状态；2.2.SFCSFC必须装有毛细管限必须装有毛细管限必须装有毛细管限必须装有毛细管限流器，以实现限流器两流器，以实现限流器两流器，以实现限流器两流器

37、，以实现限流器两端相的转变端相的转变端相的转变端相的转变高压泵高压泵高压泵高压泵 无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算 机控制流动相的密度和流量；机控制流动相的密度和流量；检测器检测器检测器检测器 可采用可采用HPLCHPLC的检测器的检测器(UV,FL)UV,FL)，也可采用也可采用GCGC的的FIDFID检测器检测器.SFC中的压力控制中的压力控制4040压力效应压力效应压力效应压力效应：在在SFCSFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加

38、提高溶剂效率，淋洗时间缩短。度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。COCO2 2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：7.0 9.010 7.0 9.0106 6 PaPa，则：则：则：则：C C1616HH3434的保留时间：的保留时间：的保留时间：的保留时间：25 25 5 min 5 min。程序升压程序升压程序升压程序升压SFC的应用的应用 I聚苯醚低聚物的聚苯醚低聚物的聚苯醚低聚物的聚苯醚低聚物的SFCSFC分析分析分析分析色谱柱：色谱柱：毛细管柱毛细管柱(10 (10 cmcm 63 63 m.)m.)固定相：固定相：键合

39、二甲基聚硅氧烷；键合二甲基聚硅氧烷；流动相：流动相：COCO2 2 ；柱温：柱温：120 120 C C；程序升压；程序升压；SFCSFC既可分析既可分析既可分析既可分析GCGC中不适用的中不适用的中不适用的中不适用的高沸点、低挥发性样品高沸点、低挥发性样品高沸点、低挥发性样品高沸点、低挥发性样品和和和和HPLCHPLC中缺少检中缺少检中缺少检中缺少检测功能团的样品，它又比测功能团的样品，它又比测功能团的样品，它又比测功能团的样品，它又比HPLCHPLC有更高的柱效和更快的分析速度。有更高的柱效和更快的分析速度。有更高的柱效和更快的分析速度。有更高的柱效和更快的分析速度。分析对象分析对象分析对

40、象分析对象：天然产物、高聚物、表面活性剂等。：天然产物、高聚物、表面活性剂等。：天然产物、高聚物、表面活性剂等。：天然产物、高聚物、表面活性剂等。SFC的发展现状的发展现状4343SFCSFC的三次起落：的三次起落：的三次起落：的三次起落：1.1.19601960s s的先驱性研究；的先驱性研究；的先驱性研究；的先驱性研究；2.2.19801980s s初初初初形形形形成成成成浪浪浪浪潮潮潮潮，认认认认为为为为会会会会掀掀掀掀起起起起分析方法的革命；分析方法的革命；分析方法的革命；分析方法的革命；3.3.目目目目前前前前，大大大大公公公公司司司司纷纷纷纷纷纷纷纷撤撤撤撤去去去去SFCSFC分分

41、分分离离离离设备，放弃进一步发展的计划。设备，放弃进一步发展的计划。设备，放弃进一步发展的计划。设备，放弃进一步发展的计划。缺点缺点：a.a.整个体系都要在高压下进行；整个体系都要在高压下进行；b.b.流动相的选择有限流动相的选择有限(COCO2 2)；c.c.仪器制造复杂，昂贵；仪器制造复杂，昂贵；(American Lab 1998,(9),1415)(American Lab 1998,(9),1415)指出指出指出指出成功和普及并成成功和普及并成为为定量分析方法定量分析方法必必须须具具备备：易于使用，操作易于使用，操作费费用低，用低，能能够够得到准确，可重复的定量得到准确，可重复的定量

42、结结果，果，要能要能够够解决至少一个分析化学中的重要解决至少一个分析化学中的重要问题问题.如，如，19601960s s的的GCGC用于石油和石化用于石油和石化产产品分析；品分析；19701970s s的的HPLCHPLC用于用于药药物、物、代代谢谢物和生物化学品的分析。物和生物化学品的分析。超临界流体萃取超临界流体萃取 Supercritical Fluid Extraction,SFE 4444超临界萃取超临界萃取超临界萃取超临界萃取：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差：

43、基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度表面张力接近零，较容易渗透到

44、固体的孔隙里，使分离效率和速度表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度大为提高。大为提高。大为提高。大为提高。常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，超临界萃取的特点超临界

45、萃取的特点 4545基本解决了溶剂对环境的污染基本解决了溶剂对环境的污染基本解决了溶剂对环境的污染基本解决了溶剂对环境的污染1.1.1.1.萃取时间短萃取时间短萃取时间短萃取时间短:15 45 15 45 minmin2.2.萃取更彻底萃取更彻底萃取更彻底萃取更彻底3.3.可进行热敏样品及痕量样品萃取可进行热敏样品及痕量样品萃取可进行热敏样品及痕量样品萃取可进行热敏样品及痕量样品萃取4.4.节省萃取费用节省萃取费用节省萃取费用节省萃取费用 COCO2 2有毒吗有毒吗有毒吗有毒吗？10.6 实验技术实验技术4646b.b.衍生化技术：柱前衍生衍生化技术：柱前衍生衍生化技术：柱前衍生衍生化技术：柱

46、前衍生 柱后衍生柱后衍生柱后衍生柱后衍生紫外衍生反应紫外衍生反应紫外衍生反应紫外衍生反应（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯（苯甲酰化反应、二硝基氟代苯反应、苯基异硫氰酸酯反应）反应）反应）反应）荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂（丹（丹（丹（丹磺酸磺酸磺酸磺酸酰氯、丹酰氯、丹酰氯、丹酰氯、丹磺酸磺酸磺酸磺酸酰阱、荧光胺、酰阱、荧光胺、酰阱、荧光胺、酰阱、荧光胺、OPAOPA等）等）等）等）a.a.分离方式的选择分离方式的选择分离方式的选择分离方式的选择c.梯度洗脱

47、梯度洗脱4747HPLCHPLC中的梯度洗脱相当于中的梯度洗脱相当于中的梯度洗脱相当于中的梯度洗脱相当于GCGC中的程序升温。中的程序升温。中的程序升温。中的程序升温。梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的：在一个分析周期内，按一定的程序连续的改变流动相中溶剂的组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离组成和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离组成和配

48、比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离固定相固定相：C18C18流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇-水水100%100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/2%/minmin流流 速：速：1 1mL/minmL/min柱柱 温：温：50 50 C C检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器d.发展趋势发展趋势发展趋势发展趋势e.e.（LC/MS/FRIR/NMR LC/LC/GCLC/MS/FRIR/NMR LC/LC/GC）1 13 34 43 34 4B BC C1 14 43 3A A1 12 24 43 3五味子五味子五味子五味子第十章第十章 习题习题Page 246Page 246Q.9Q.9，4949