高效液相色谱分析法.ppt

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1、第六章第六章第六章第六章高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法Chapter 6Chapter 6HHigh igh P Performance erformance L Liquid iquid C Chromatographyhromatography本章学习应该关注的几个问题本章学习应该关注的几个问题本章学习应该关注的几个问题本章学习应该关注的几个问题问题一问题一高效液相色谱法与其它色谱法有何不同？高效液相色谱法与其它色谱法有何不同？高效液相色谱法利用什么设备实现分离？高效液相色谱法利用什么设备实现分离？问题二问题二高效液相色谱法有何应用？高效液相色谱法有何应用？问题三

2、问题三问题一问题一高效液相色谱法与其他色谱法有何不同？高效液相色谱法与其他色谱法有何不同？问题问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？问题问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？问题问题1.3 高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述问题问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？一、高效液相色谱法与经典液相色谱法一、高效液相色谱法与经典液相色谱法固定相固定相颗粒大小颗粒大小

3、流动相流动相 输送压力输送压力样品样品 分离速度分离速度检测器检测器 灵敏度灵敏度采用颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。采用颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述问题问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？一、高效液相色谱法与经典液相色谱法一、高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相色谱经典液相色谱高效液相色谱高效液相色谱色谱柱：色谱柱：柱长柱长10200cm，内径，内径1050mm色谱柱：色谱柱：柱长柱长1025cm，内径，内径210mm常压或减压常压或减压高压：高压：

4、4050MPa填料颗粒大：填料颗粒大：75600 m（20030目）目）填料颗粒小：填料颗粒小：250 m（2500300目）目）柱效低：柱效低：2050块塔板块塔板/m柱效高：柱效高：4000060000块塔板块塔板/m分析速度慢：分析速度慢：120h分析速度快：分析速度快：0.051.0h色谱柱只用一次色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用色谱柱可重复多次使用不能在线检测不能在线检测能在线检测能在线检测高效和经典液相色谱法比较表高效和经典液相色谱法比较表第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述问题问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？二、高效液相

5、色谱法与气相色谱法二、高效液相色谱法与气相色谱法流动相流动相选择范围选择范围分离过程分离过程样品状态样品状态色谱柱色谱柱 柱温柱温分离对象分离对象性质性质第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述问题问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？二、高效液相色谱法与气相色谱法二、高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法和气相色谱法比较表高效液相色谱法和气相色谱法比较表气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱只能分析只能分析挥发性挥发性物质（约物质（约20%的物质）的物质）几乎可以分析几乎可以分析各种各种物质物质不能用于不能用于热不稳定物质热不稳定物质的分析

6、的分析可以用于可以用于热不稳定物质热不稳定物质的分析的分析用毛细管柱色谱可得到很高的柱效用毛细管柱色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长，柱效不会很高色谱柱不能很长，柱效不会很高有很灵敏的检测器（有很灵敏的检测器（ECD）和较灵敏）和较灵敏的通用检测器（的通用检测器（FID,TCD)有灵敏度较高的通用检测器有灵敏度较高的通用检测器（ELSD）流动相为流动相为惰性气体惰性气体，与组分无作用，与组分无作用流动相为流动相为不同极性液体不同极性液体，与组分作用，与组分作用运行和操作容易，运行成本低运行和操作容易，运行成本低运行和操作较难，运行成本高运行和操作较难，运行成本高仪器制造难度较小仪器制造难度较小

7、仪器制造难度较大仪器制造难度较大第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述问题问题1.3 高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？三、高效液相色谱分离理论三、高效液相色谱分离理论可忽略可忽略a.采用合适的流动相，控制相对较小的流动相流速；采用合适的流动相，控制相对较小的流动相流速；b.采用颗粒直径极小的固定相；采用颗粒直径极小的固定相；c.色谱柱填充均匀；色谱柱填充均匀；d.减小固定相液膜厚度；减小固定相液膜厚度；影响高效液相色谱峰扩张影响高效液相色谱峰扩张的主要因素：的主要因素：A和和Cu项项u最佳最佳Hu0AB/uCu问题二问题二高效液相色谱法利用什么设

8、备实现分离？高效液相色谱法利用什么设备实现分离？问题问题2.1 高效液相色谱仪由哪几部分组成？高效液相色谱仪由哪几部分组成？问题问题2.2 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？一、高效液相色谱仪流程一、高效液相色谱仪流程储液器储液器进样器进样器色色谱谱柱柱检测器检测器数据处理数据处理系统系统馏分馏分收集器收集器高压泵高压泵高压输液系统高压输液系统梯度洗梯度洗脱装置脱装置第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱

9、仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪二、高压输液系统二、高压输液系统作用作用为色谱分离提供流速为色谱分离提供流速恒定的流动相。恒定的流动相。储液器、高压输液泵、过储液器、高压输液泵、过滤器和压力脉动阻力器。滤器和压力脉动阻力器。组成组成密封；流量恒定；压力平密封；流量恒定；压力平稳、可调；易于更换溶剂稳、可调；易于更换溶剂。要求要求常用高压输液泵常用高压输液泵恒压泵恒压泵恒流泵恒流泵问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪三、进样系统三、进样系统作用作用定量引入样品

10、。定量引入样品。隔膜注射进样器、隔膜注射进样器、高压进样阀高压进样阀。种类种类死体积小死体积小。要求要求六通阀进样过程示意图六通阀进样过程示意图问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？柱外效应柱外效应第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪四、分离系统四、分离系统-色谱柱色谱柱作用作用实现样品组分高效分离。实现样品组分高效分离。柱管材料柱管材料柱管柱管+固定相固定相。组成组成不锈钢、聚合材料。不锈钢、聚合材料。柱管尺寸柱管尺寸内径：内径：4-5mm长度：长度：10-50cm填料直径填料直径5-10 m塔板数塔板数

11、7 000-10 000色谱柱填装好坏色谱柱填装好坏是影响柱效的重要因素是影响柱效的重要因素问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统作用作用要求要求将样品组分的量定量将样品组分的量定量转化为电信号并放大、转化为电信号并放大、输出。输出。灵敏、噪音小、响应快、灵敏、噪音小、响应快、线性范围宽、死体积小。线性范围宽、死体积小。类型类型溶质型、总体型。溶质型、总体型。种类种类紫外紫外-可见检测器可见检测器(UVD)；荧光检测器荧光检测器(FLD)；折光检测

12、器折光检测器(RID)；蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)。电化学检测器电化学检测器(ED)；问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统1.紫外紫外-可见检测器和光电二极管阵列检测器可见检测器和光电二极管阵列检测器可调波长紫外可调波长紫外-可见检测器可见检测器固定波长紫外固定波长紫外-可见检测器可见检测器溶质型溶质型问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相

13、色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统1.紫外紫外-可见检测器和光电二极管阵列检测器可见检测器和光电二极管阵列检测器特点特点灵敏度高；线形范围宽；灵敏度高；线形范围宽；对对流动相和温度变化不敏感流动相和温度变化不敏感。溶质型溶质型可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱只能用于有紫外只能用于有紫外-可见吸收的样品组分的检测可见吸收的样品组分的检测光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(PAD)问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统2.荧光

14、检测器荧光检测器特点特点灵敏度高；选择性好；灵敏度高；选择性好；线性范围窄线性范围窄。溶质型溶质型可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱只能用于有荧光的样品组分的检测只能用于有荧光的样品组分的检测问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统3.折光检测器折光检测器特点特点通用；通用；灵敏度低；灵敏度低；对温度变化敏感对温度变化敏感。总体型总体型不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱可用于所有样品组可用于所有样品组分的检测分的检测偏转式、反射式偏转式、反射式偏转式示差折光

15、检测器偏转式示差折光检测器问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？通用；灵敏度高；可提供分子的结构信息通用；灵敏度高；可提供分子的结构信息。第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪五、检测系统五、检测系统4.电化学检测器电化学检测器溶质型溶质型可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱只能用于有电化学响应的样品组分的检测只能用于有电化学响应的样品组分的检测特点特点灵敏度高；选择性好灵敏度高；选择性好。5.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱可用于所有样品组分的检测可用于所有样品组分的检测特点特点通用；灵

16、敏度高通用；灵敏度高。6.质谱检测器质谱检测器可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱可用于大部分样品组分的检测可用于大部分样品组分的检测特点特点问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪六、附属系统六、附属系统脱气装置脱气装置梯度洗脱梯度洗脱(淋洗淋洗)装置装置恒温设备恒温设备自动进样器自动进样器馏分收集器馏分收集器当样品组成复杂，组分性质差别较大，组分在流动当样品组成复杂，组分性质差别较大，组分在流动相和固定相中的分配系数差别很大时使用相和固定相中的分配系数差别很大时使用在双泵系统中

17、应用很广在双泵系统中应用很广在分离过程中，使流动相组成随时间改变而改变。在分离过程中，使流动相组成随时间改变而改变。梯度洗脱梯度洗脱通过不断改变色谱柱中流动相的极性、离子强度、通过不断改变色谱柱中流动相的极性、离子强度、pH等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。高分离效率。问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？要求要求刚性固体刚性固体表面多孔型表面多孔型问题问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第三节第三节第三节第三节 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色

18、谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相一、固定相一、固定相比表面极大（颗粒小）；颗粒均匀；比表面极大（颗粒小）；颗粒均匀；耐压耐压。类型类型全多孔型全多孔型硬胶硬胶应用范围广应用范围广应用于离子交换和尺寸排阻色谱应用于离子交换和尺寸排阻色谱二、流动相二、流动相1.高效液相色谱对流动相的要求高效液相色谱对流动相的要求a.合适的极性和选择性合适的极性和选择性b.与检测器匹配与检测器匹配c.高纯度高纯度d.稳定稳定e.低黏度低黏度f.安全、低毒安全、低毒常用流动相：常用流动相：水、乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、正己烷水、乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、正己烷等等问题问题

19、2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？高效液相色谱仪各部分的功能如何？第三节第三节第三节第三节 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相二、流动相二、流动相2.描述流动相性质的特性参数描述流动相性质的特性参数通过改变流动相的性质，可以改变组分的通过改变流动相的性质，可以改变组分的k值，改善分离效果。值，改善分离效果。a.溶解度参数溶解度参数 溶剂极性的尺度溶剂极性的尺度纯液体中各种分子间力的总和。纯液体中各种分子间力的总和。b.极性参数极性参数P溶剂极性的另一尺度溶剂极性的另一尺度根据根据Rohrschneider报道的

20、溶解度数据编制的。报道的溶解度数据编制的。c.溶剂强度参数溶剂强度参数 0溶剂对化合物洗脱能力的一种治标溶剂对化合物洗脱能力的一种治标3.混合溶剂混合溶剂问题三问题三高效液相色谱法有何应用？高效液相色谱法有何应用？问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？问题问题3.2 高效液相色谱法如何进行定性分析？高效液相色谱法如何进行定性分析？问题问题3.3 高效液相色谱法如何进行定量分析？高效液相色谱法如何进行定量分析？问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱法的主要类型高效液相

21、色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型一、液一、液-液分配色谱法液分配色谱法1.分离原理分离原理不同样品组分在不同样品组分在固定相固定相和和流动相流动相中中溶解能力溶解能力(分配系数分配系数)不同不同2.固定相固定相与气相色谱相同与气相色谱相同涂在担体表面涂在担体表面3.流动相流动相与固定相不互溶；与固定相极性差别大与固定相不互溶；与固定相极性差别大4.分离对象分离对象正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱非极性、弱极性化合物非极性、弱极性化合物极性化合物极性化合物流动相极性流动相极性 小于小于 固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性 大于大于 固定相极性固定相极性问题问

22、题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法1.分离原理分离原理不同样品组分与不同样品组分与固定相固定相和和流动相流动相中中作用力作用力不同不同2.固定相固定相键合在载体表面键合在载体表面3.流动相流动相与固定相极性相反与固定相极性相反4.分离对象分离对象正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱非极性、弱极性化合物非极性、弱极性化合物极性化合物极性化合物固定相直接键合在担体表面固定相直接键合在担体表面烷基、氨

23、基、氰基、羟基等烷基、氨基、氰基、羟基等反相：硅胶反相：硅胶-C18、C8、C3正相：硅胶正相：硅胶-CN、NH2、OH正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱流动相：烃类流动相：烃类+氯仿、醇氯仿、醇流动相：水、甲醇、乙腈流动相：水、甲醇、乙腈何种极性的先流出？何种极性的先流出？流动性极性改变，组分流动性极性改变，组分保留时间如何变化？保留时间如何变化？问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型三、液三、液-固吸附色谱法固吸附色谱法1.分

24、离原理分离原理固定相固定相对样品组分对样品组分吸附能力吸附能力和和流动相流动相对样品组分对样品组分溶解能力溶解能力的不同的不同2.固定相固定相固体吸附剂固体吸附剂3.流动相流动相极性大的试样：强极性洗脱剂极性大的试样：强极性洗脱剂4.分离对象分离对象各类化合物各类化合物硅胶、氧化铝、聚酰胺等硅胶、氧化铝、聚酰胺等极性小的试样：弱极性洗脱剂极性小的试样：弱极性洗脱剂问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型四、离子交换色谱法四、离子交

25、换色谱法1.分离原理分离原理不同待测离子与不同待测离子与固定相固定相的离子交换能力不同的离子交换能力不同2.固定相固定相离子交换树脂离子交换树脂强、弱强、弱阳阳离子交换树脂离子交换树脂 强、弱强、弱阴阴离子交换树脂离子交换树脂3.流动相流动相具有一定盐浓度的具有一定盐浓度的pH缓冲溶液缓冲溶液4.分离对象分离对象固定相为离子交换树脂固定相为离子交换树脂多孔型多孔型薄膜型薄膜型表面多孔型表面多孔型键合性键合性无机离子无机离子生物大分子生物大分子（氨基酸、蛋白质、核酸）（氨基酸、蛋白质、核酸）问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四

26、节 高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型五、尺寸排阻色谱法五、尺寸排阻色谱法1.分离原理分离原理按照待测物按照待测物分子大小分子大小(尺寸、形状尺寸、形状)不同实现分离不同实现分离2.固定相固定相凝胶凝胶3.流动相流动相与凝胶极性相似、黏度小与凝胶极性相似、黏度小4.分离对象分离对象四氢呋喃、甲苯、氯仿、四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF)、水、水凝胶凝胶(渗透渗透)色谱法色谱法软性软性凝胶：葡聚糖、琼脂糖凝胶：葡聚糖、琼脂糖半刚性半刚性凝胶：聚苯乙烯凝胶：聚苯乙烯刚性刚性凝胶：硅胶、多孔玻璃凝胶：硅胶、多孔玻璃大

27、分子大分子物质物质分子量大和分子量小的大分子化合物何者先流出色谱柱？分子量大和分子量小的大分子化合物何者先流出色谱柱？问题问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？高效液相色谱法可用于分离那些物质？第四节第四节第四节第四节 高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型六、亲和色谱法六、亲和色谱法分离原理分离原理生物大分子与固定相表面存在生物大分子与固定相表面存在特异性亲和力特异性亲和力七、分离类型的选择七、分离类型的选择1.什么是高效液相色谱法？什么是高效液相色谱法？HPLC高效的原因是什么？高效的原因是什么？2.与经典液相色谱相比，高效

28、液相色谱法有何特点？与经典液相色谱相比，高效液相色谱法有何特点？3.与气相色谱相比，高效液相色谱法有何特点？与气相色谱相比，高效液相色谱法有何特点？4.高效液相色谱仪有哪几部分组成？各有何功能？高效液相色谱仪有哪几部分组成？各有何功能？5.什么是梯度洗脱？梯度洗脱有何优点？什么是梯度洗脱？梯度洗脱有何优点？6.高效液相色谱检测器主要有哪几种？各适用于何种样品检测？高效液相色谱检测器主要有哪几种？各适用于何种样品检测？7.高效液相色谱常用的流动相有哪些？高效液相色谱常用的流动相有哪些？8.高效液相色谱法可分为哪几类？各自的分离原理如何？高效液相色谱法可分为哪几类？各自的分离原理如何？9.何为正相

29、色谱？适用于何种样品分离分析？判断组分流出顺序何为正相色谱？适用于何种样品分离分析？判断组分流出顺序10.何为反相色谱？适用于何种样品分离分析？何为反相色谱？适用于何种样品分离分析？判断组分流出顺序判断组分流出顺序11.何为化学键合固定相？何为化学键合固定相？12.如何根据样品性质选择色谱分离分析方法？如何根据样品性质选择色谱分离分析方法？仪器分析方法：仪器分析方法：UV-Vis,MF,AAS,EC,GC,HPLC每种方法基本概念：定义、分类、优缺点、应用对象每种方法基本概念：定义、分类、优缺点、应用对象每种方法基本原理及相关名词每种方法基本原理及相关名词每种方法涉及仪器：组成每种方法涉及仪器：组成,结构结构,功能功能,相关测试条件相关测试条件各种定量分析方法：标准曲线法各种定量分析方法：标准曲线法,标准加入法标准加入法,内标内标法法,归一化法归一化法相关计算：标准曲线法相关计算：标准曲线法,标准加入法标准加入法,内标法内标法,归一化归一化法法,塔板数塔板数,分离度分离度,相对保留值相对保留值,柱长选择柱长选择