ELISA试验方法的相关问题及质量控制.pptx

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1、ELISAELISA试验方法的相关问题及质量控制试验方法的相关问题及质量控制 河北医科大学第二医院检验科 李永军 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 19711971年由瑞典学者年由瑞典学者EngrallEngrall和和PerlmannPerlmann, , 荷兰学者荷兰学者VanweemanVanweeman和和SchuursSchuurs报道。报道。 开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中 微量物质测定的实验方法。微量物质测定的实验方法。酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类

2、酶免疫组化酶免疫组化酶免疫技术酶免疫技术 均相酶免疫测定均相酶免疫测定 酶免疫测定酶免疫测定 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 异相酶免疫测定异相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 （ELISA） Ag + Ab* AgAb* + Ab*均相法：均相法：抗原抗体反应后抗原抗体反应后AgAb* 中的标记物失去特性，中的标记物失去特性， 不需进行不需进行AgAb* 与与 Ab*的分离，可直接测的分离，可直接测 定游离的定游离的Ab*量，从而推算标本中的量，从而推算标本中的Ag 量。量。异相法：异相法：抗原抗体反应后，需将抗原抗体反应后，需将AgAb* 与与 Ab*，然后然后 测定测定AgAb*

3、或或 Ab*的量，从而推算标本中的的量，从而推算标本中的 Ag 量。量。ELISAELISA方法的基本原理方法的基本原理（1 1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保 持其免疫活性。持其免疫活性。（2 2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体， 并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。（3 3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反 应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物 形成水解、氧化或还原反应，形成有色物形成

4、水解、氧化或还原反应，形成有色物 质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体 的量直接相关的量直接相关。ELISA方法的基本类型方法的基本类型 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法 （二）（二） 间接法间接法 （三）（三） 竞争法竞争法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法 洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗原待测抗原（二）间接法（二）间接法洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗体待测抗体酶标抗抗体酶标抗抗体（三）竞争法（三）竞争法洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗原待测抗原酶标抗原酶标抗原双位点夹心法双位点夹心法洗涤洗涤酶标抗酶标抗BAB捕获法捕获法固相抗固相抗IgM特异特异IgM非特异

5、非特异IgM标本标本特异抗原特异抗原抗原特异酶标抗体抗原特异酶标抗体底物底物ELISA试验的方法学原理一步法一步法：Ab+Ag+Ab*AbAgAb* (a) AbAg (b) AgAb* (c) Ab*-AgAb (d)二步法二步法AbAg+Ab*AbAgAb*Ab*+AgAb*Ag (洗涤洗涤) ELISA方法的影响因素及控制n表面效应表面效应( (Surface effects)Surface effects)n蛋白质分子在吸附过程中，为了克服与固相载体之间的排斥力需要重新分布其表面的功能性基团，使疏水性基团充分暴露，然后局部接触区域的偶极分子脱氢，再通过范德华引力而固相到载体表面。表面效

6、应可直接影响抗原、抗体的够象和功能n固相导致抗原的变化固相导致抗原的变化n为了测定抗体的水平，需预先将抗原（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相蛋白质抗原，可引起分子够象和抗原性发生改变n固相对抗体的影响固相对抗体的影响n将抗体固相化时，直接吸附法固相抗体分子，除了呈团串状，不均匀分布，易解吸等外，还可发生构象改变，使抗体结合价减少甚至失活。高剂量钩镰效应高剂量钩镰效应( (HD-Hook Effects)HD-Hook Effects) 发生在固相法试验过程中的，可造成假低值甚至假阴性错误结果的特殊效应，称为HD-Hook效应。 边缘效应

7、边缘效应( (Edge effects)Edge effects)n由于微量反应板周边孔与内部孔升降温速率的差别，造成周边孔与内部孔结果的差异，这就是边缘效应或位置效应 弥散效应弥散效应( (Diffusion limits)Diffusion limits) 在固相法中抗原抗体结合，底物与酶的接触，转换的信号产物向液体内弥散的过程中，液相与固相中的分子必须穿过液面的Nernst层，也就是液固屏障，使反应速率受到限制。干扰物质干扰物质n类风湿因子n补体n嗜异性抗体n血清粘度过大、血脂过高n胆红素、血红蛋白n抗凝剂（肝素、EDTA）n酶类类风湿因子类风湿因子n类人血清中类人血清中IgM、IgG型

8、风湿因子可以与型风湿因子可以与ELISAELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FCFC段直接段直接 结合，导致假阳性。结合，导致假阳性。n将热变性IgG（63，10分钟）加入到标本稀释液中。n用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中，使RF降解。补体n在固相化和标记抗体的过程中，抗体FC段的补体C1q分子结合位点被暴露，使C1q可以将二者连接起来，造成假阳性。n用EDTA稀释标本。n用63，10分钟或56，30分钟加热使C1q灭活。嗜异性抗体n人类血清中含有能与齿齿类动物（鼠）Ig结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，造成假阳性。n在标本稀释液中

9、加入过量的动物Ig。标本溶血n标本溶血可使红细胞破坏溶解释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白，从而导致非特异性显色。标本受细菌污染n菌体中含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本，在以辣根过氧化物酶为标记物的ELISA测定中，会导致非特异性显色。标本保存不当n在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会造成假阳性。n标本放置时间过长，有时抗原或抗体的免疫活性减弱，亦可出现假阴性。n5天内测定的血清标本可存放4，1周后测定的血清标本应低温冻存。标本凝集不全n在没有促凝剂和抗凝剂的情况下，正常血液采集后1/22小时开始凝固，1824小时完

10、全凝固。强行分离血清，血清中会有纤维蛋白原残留，形成假阳性。n充分凝固后分离血清；用带分离胶的采血管或采血管中加入抗凝剂。添加物质的影响n抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3)、分离胶等可干扰ELISA测定。ELISA试验的有关问题洗涤液洗涤液 洗涤的目的洗涤的目的：除去未结合的免疫反应物；终止抗原抗体的继续结合；除去血清中与反应无关的其它成份和游离的酶结合物；以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。洗涤液的种类：洗涤液的种类：n蒸馏水蒸馏水n吐温吐温- -蒸馏水蒸馏水n吐温吐温- -生理盐水生理盐水nPBS-PBS-吐温吐温- -蒸馏水蒸馏水nTrisTris- -吐

11、温吐温- -蒸馏水蒸馏水n（PH均为7.2或7.4）nTween Tween 2020月桂酸月桂酸 （液体）（液体） nTweenTween 40 40棕榈酸棕榈酸 （液体）（液体）nTweenTween 60 60硬脂酸硬脂酸 （固体）（固体）nTweenTween 80 80油酸油酸 （液体）（液体）阈值阈值( (Cut offCut off值，阴阳界值值，阴阳界值) )n进行大量阴性标本OD值的检测，统计阴性标本的平均值和标准差。n以X+SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为68%。n以X+2SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为95%。n以X+3SD为界值，

12、一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为99%。为什么阴性标本会略显色而不是完全无色呢为什么阴性标本会略显色而不是完全无色呢？ 由于目前分离、纯化、检测技术等方面的 限制，基因工程抗原和合成多肽都不可能达 到100%纯度，往往含有2-5%的杂蛋白。同时 ELISA反应板的非特异性吸附也不可避免。阳性标本不显色阳性标本不显色 （2）基因基因工程工程抗原抗原和合和合成多成多肽抗肽抗原的原的差别差别ELISA试验的影响因素及对策 灵敏度：能检测到的分析物的最小量，灵敏度：能检测到的分析物的最小量， 表示检测下限的能力。表示检测下限的能力。 相对灵敏度相对灵敏度= =真阳性真阳性/ /（真阳性（真阳性

13、+ +假阴性）假阴性）* *100%100%（1 1）试剂盒（运输时间太长、温度太高）试剂盒（运输时间太长、温度太高）（2 2）试剂、样品用前要平衡）试剂、样品用前要平衡（3 3）试剂开启时间长、长菌）试剂开启时间长、长菌（4 4）吸液器吸量不足）吸液器吸量不足（5 5）恒温箱不足）恒温箱不足3737或温育时间不足或温育时间不足（6 6）洗涤方式不对）洗涤方式不对（7 7）显色剂加量不足）显色剂加量不足 （8 8）显色反应时间不足）显色反应时间不足重复性：对同一样品重复分析的结果间的符合性重复性：对同一样品重复分析的结果间的符合性 变异系数变异系数CV=SD/XCV=SD/X* *100%10

14、0%（1）样品加入后未混匀（2）移液器加样量不一致（3）洗涤方式不正确（4）唾液或其它杂质掉入孔内（5）酶或显色剂B加量不一致（6）标本处理不当（7）酶标仪测定重复性差（8）保温时间及显色时间不一致（9）阈值附近的标本特异性：对阴性标本给出阴性结果的能力特异性：对阴性标本给出阴性结果的能力 相对特异性相对特异性= =真阴性真阴性/ /（真阴性（真阴性+ +假阳性）假阳性）* *100%100%（1）配制洗液的蒸馏水污染（2）酶加量过多（3）洗涤不充分，样品中其他成分残 留或有酶残留（4）显色剂暴露时间太长（5）恒温箱温度失控（6）加酶或显色剂后反应时间过长（7）吸头重复使用室内质量控制室内质量

15、控制n分析批：是一个区间（一段时间或测量样分析批：是一个区间（一段时间或测量样 本量本量)预期在此区间内检测系统预期在此区间内检测系统 的准确度和精密度是稳定的。的准确度和精密度是稳定的。n分析批长度分析批长度n厂家推荐的批长度厂家推荐的批长度n用户规定的批长度用户规定的批长度 n质控品质控品 每一分析项目在用户规定的分析批长度内必每一分析项目在用户规定的分析批长度内必 须检测质控品。须检测质控品。 质控品的成分应与检测患者样本的基质一样质控品的成分应与检测患者样本的基质一样 或相似。或相似。 质控品应均一、稳定，瓶间变异性要小于分质控品应均一、稳定，瓶间变异性要小于分 析系统的变异。析系统的

16、变异。 质控品不能作为校准品使用。质控品不能作为校准品使用。 质控品可以自制也可购买成品。质控品可以自制也可购买成品。 nELISAELISA测定每块板都要测定室内质控品。测定每块板都要测定室内质控品。n定性测定可采用弱阳性质控品的定性测定可采用弱阳性质控品的s/cos/co值作值作质控图。质控图。 定量测定参照临床化学的绘制方法。定量测定参照临床化学的绘制方法。n凝集试验的室内质控品可采用试剂盒所带凝集试验的室内质控品可采用试剂盒所带的阴阳性对照。的阴阳性对照。ELISA检测室内质量控制的方法检测室内质量控制的方法n定值标准质控物定值标准质控物n随机阳性质控物随机阳性质控物n自配定值质控物自

17、配定值质控物n将某一质控物连续测定将某一质控物连续测定2020天，测算出天，测算出其均值、标准差。其均值、标准差。 2SD 2SD为警戒值；为警戒值；3 3SDSD为失控。为失控。n定值标准质控物定值标准质控物 卫生部临床检验中心、专业试剂厂家n随机阳性质控物随机阳性质控物 进行S/CO值或OD值或定量值n自配定值质控物自配定值质控物 试剂盒中阳性对照用阴性对照稀释至弱阳 性，测定其S/CO值n新批号质控品均值及标准差的建立新批号质控品均值及标准差的建立 新批号质控品的每个项目都应和现用的质控新批号质控品的每个项目都应和现用的质控 品作平行检测。品作平行检测。 在不同天内至少做在不同天内至少做20瓶的检测。若无法在瓶的检测。若无法在20 天内得到天内得到20个数值，应至少在个数值，应至少在5天内，每天天内，每天 做不少于做不少于4次重复检测来获得。次重复检测来获得。 谢 谢