6流式细胞术的质量控制和影响因素.pptx
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1、一、标本的采集和固定方法的质量控制一、标本的采集和固定方法的质量控制 标本采集是十分重要的环节标本采集是十分重要的环节,在标本的采在标本的采集过程集过程,需注意:,需注意:手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时材时,要避免出血坏死组织要避免出血坏死组织。标本采集后要及时固定或深低温保存标本采集后要及时固定或深低温保存,以免组织发生自溶以免组织发生自溶,DNA降解降解,而造成而造成测试结果的误差测试结果的误差。固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度度。 例如例如70%的乙醇固定比的乙醇固定比75%以上的以上的浓度固定效果好浓度固定
2、效果好,因为因为高浓度的乙醇常高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜造成细胞表面快速形成一个蛋白膜,致致使细胞内的物质固定不良使细胞内的物质固定不良。 有作者分析研究了自溶对有作者分析研究了自溶对DNA测定测定的影响的影响,发现自溶的组织细胞常出现假发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体性异倍体,且不固定的组织细胞随时间且不固定的组织细胞随时间的延长的延长,DNA含量呈梯度降低含量呈梯度降低 根据检测的目的根据检测的目的,选择什么类型的选择什么类型的固定剂固定剂,对流式检测质量也有显著的影对流式检测质量也有显著的影响响。 例如细胞例如细胞DNA的分析的分析,使用醇类固使用醇类固定剂较好而不选
3、择定剂较好而不选择醛醛类固定剂类固定剂,醛,醛类固类固定剂明显影响细胞定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度荧光发射强度。实验证明实验证明,醛,醛类固定剂对插入性荧光染类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用料与核酸的结合有很强的干扰作用,其其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右左右。 如果作流式免疫研究工作如果作流式免疫研究工作,采用新采用新鲜组织是最好的选择鲜组织是最好的选择。在不能及时检测在不能及时检测又没有低温保存条件时又没有低温保存条件时,要根据所测物要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面质在细胞内还是在细胞膜表面,在膜表在膜表
4、面的抗原物质面的抗原物质,以以醛醛类固定剂为宜类固定剂为宜,尽尽管管醛醛类固定剂产生的非特异性荧光较强类固定剂产生的非特异性荧光较强,但不宜采用醇类但不宜采用醇类固固定剂定剂,因醇类固定剂因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失失,失去标记的位点失去标记的位点。 如所测抗原物质在细胞内如所测抗原物质在细胞内,可以使用可以使用醇类固定剂醇类固定剂,这种固定方法简便易行这种固定方法简便易行,无无需特殊低温冷冻条件需特殊低温冷冻条件,在一般冰箱在一般冰箱(0-4)放置即可放置即可,能很好的保持细胞形态和生物能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。化学成
5、分不发生变性。 二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织的组织,尤其是血和骨髓细胞是天然的尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料单分散细胞材料,其中的细胞成分在生其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态理状态下呈单分散状态,它是流式分析它是流式分析最合适的样品来源最合适的样品来源。 二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制 全血中含有多种有形成分全血中含有多种有形成分,流式细流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象胞检测是以某一群细
6、胞为检测对象,因因此在检测前须将所测的某群细胞成分分此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来离出来。例如例如,以淋巴细胞以淋巴细胞DNA定量分定量分析为例析为例,就须把淋巴细胞分离出来就须把淋巴细胞分离出来,而而将其他有核细胞或红细胞去除将其他有核细胞或红细胞去除,对于血对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤离心速度造成血小板膜的损伤,出现血出现血小板凝集小板凝集 新鲜实体组织单细胞样品的制备新鲜实体组织单细胞样品的制备,实体组织是流式分析工作的主要材料实体组织是流式分析工作的主要材料来源来源,但对其分散单细胞样品的技术但对其分散单
7、细胞样品的技术和方法和方法,仍存在着很多问题仍存在着很多问题,仍需大仍需大量的探索工作量的探索工作。就目前就目前,国内外对实国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法用的又通用方法,甚至同样组织甚至同样组织,用用于不同的实验目的于不同的实验目的,就需要不同的方就需要不同的方法处理法处理,或者每一种组织就是一个单或者每一种组织就是一个单独的问题独的问题 因此必须根据实际情况因此必须根据实际情况,去选择去选择合适有效的单分散方法合适有效的单分散方法,选用的方法选用的方法必须达到细胞产量高必须达到细胞产量高,细胞损伤小的细胞损伤小的目标目标,但实际工作中
8、达到这个目标是但实际工作中达到这个目标是困难的困难的,多年来对于实体组织的分散多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法解聚多采用酶学法,化学法、机械物化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等理方法以及低渗脱核方法等,根据各根据各种组织的特点种组织的特点,以及实验目的的不同以及实验目的的不同,可选择不同的方法。可选择不同的方法。 选则酶学方法时选则酶学方法时,应注应注意意选择酶类型选择酶类型的问题的问题,含有大量结缔组织的含有大量结缔组织的,选择选择胶原酶好胶原酶好,不宜选择胃蛋不宜选择胃蛋白白酶或酶或胰胰酶酶。并要注意酶的活性条件和影响因素并要注意酶的活性条件和影响因素,要注意酶的溶剂要注意酶的
9、溶剂,消化时间消化时间,pH值值,浓度等对酶活性的影响浓度等对酶活性的影响酶学方法分散组织都有一定的应用限酶学方法分散组织都有一定的应用限制制,特别用于流式免疫荧光实验时特别用于流式免疫荧光实验时,酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分,从而影响分析结果从而影响分析结果,由于酶学方法分由于酶学方法分散下来的细胞产量低散下来的细胞产量低,用组织较多用组织较多,还要注意酶的纯度还要注意酶的纯度,活性单位活性单位,以及以及生产厂家对酶的污染生产厂家对酶的污染化学方法化学方法,往往单独应用分散组织效往往单独应用分散组织效果不理想果不理想,应与酶学方法综合使用应与酶学方法综合使
10、用,分分散效果更佳。散效果更佳。 机械方法机械方法,常采用剪碎常采用剪碎,网搓研磨网搓研磨,细针抽吸等细针抽吸等,对细胞损伤大对细胞损伤大,产生的细产生的细胞碎片多胞碎片多,细胞团块多细胞团块多,在使用机械法在使用机械法时时,要给于组织适当的压力要给于组织适当的压力,这种适当这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。人员来操作。 低渗方法低渗方法,其溶液是一种低渗液体其溶液是一种低渗液体,造成细胞膜的破坏造成细胞膜的破坏,使细胞核自行释放使细胞核自行释放出来出来,是一个裸核悬液样品是一个裸核悬液样品,本方法简本方法简便便,但要避免脱核时间过长但要避
11、免脱核时间过长,造成核膨造成核膨胀碎裂。胀碎裂。 以上几种方法是目前对实体组织解以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法聚常用的方法,往往不是单用往往不是单用,常常是常常是一种或二种方法的结合使用一种或二种方法的结合使用,总的来说总的来说,对实体组织分散为单细胞还存在很多困对实体组织分散为单细胞还存在很多困难难,因此还需要深入探讨流式样品的制因此还需要深入探讨流式样品的制备技术备技术,制备出完整细胞产量高制备出完整细胞产量高,细胞细胞损伤小的合格悬液损伤小的合格悬液 , 获得更好的流式检获得更好的流式检测结果。测结果。 三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制
12、 石蜡包埋组织标本的材料选择石蜡包埋组织标本的材料选择,应经应经病理医师仔细检病理医师仔细检查,查,选取无自溶选取无自溶,坏死坏死的组织对肿瘤组织标本的组织对肿瘤组织标本,选取含肿瘤组选取含肿瘤组织细胞丰富的区域织细胞丰富的区域,且经病理形态或细且经病理形态或细胞学核实病理诊断胞学核实病理诊断三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 切取适当厚度的石蜡组织片切取适当厚度的石蜡组织片,大量研大量研究证明究证明,切取切取40-50m厚度的切片是适宜厚度的切片是适宜的的,过厚的组织片消化费时过厚的组织片消化费时,消化下来消化下来的细胞数少的细胞数少,过薄的切片可产生大
13、量的过薄的切片可产生大量的细胞碎片细胞碎片,影响检测结果影响检测结果,使肿瘤异倍使肿瘤异倍体的检出率减少体的检出率减少,我们研究了石蜡切片我们研究了石蜡切片不同厚度不同厚度(5,10,20,30,40, 50m)对流式分对流式分析析DNA的的影响影响,发现较薄的切片造成碎发现较薄的切片造成碎片较多片较多,噪音增加噪音增加,组方图的基线提高组方图的基线提高,影响影响倍体分析的精度倍体分析的精度 在组织脱蜡的过程中在组织脱蜡的过程中,一定将蜡脱一定将蜡脱净净,残留的石蜡可影响酶的消化活性残留的石蜡可影响酶的消化活性,检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯,加入加入10
14、0%乙醇乙醇,如果无絮状物浮起如果无絮状物浮起,表示表示蜡已脱净蜡已脱净 梯度酒精梯度酒精(100% 70% 50%)水化要水化要充分充分, 使组织还原到与新鲜组织相似的使组织还原到与新鲜组织相似的状态。状态。 消化酶液要掌握适当的浓度、消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等值、温度等,不造成酶的活性降低为宜不造成酶的活性降低为宜,消化时间很重要消化时间很重要,时间短细胞消化不下时间短细胞消化不下来来,时间长时间长,消化下来的细胞又被破坏消化下来的细胞又被破坏,在制备石蜡包埋单细胞时在制备石蜡包埋单细胞时,常规使用常规使用0.5%胃蛋白酶胃蛋白酶(PH 1.5) 石蜡包埋组织的单细胞制备方法
15、的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立建立,使流式细胞术在医学研究中得使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用到更广泛的应用,但仍存在一些问题但仍存在一些问题有待进一步解决有待进一步解决,主要存在问题如下主要存在问题如下:样品中的碎片较多样品中的碎片较多,所测得的所测得的DNA组组方图质量不及新鲜组织好方图质量不及新鲜组织好,组方图的组方图的峰位较宽峰位较宽,CV值偏大。值偏大。异倍体率减少异倍体率减少,由于组方图细胞峰由于组方图细胞峰CV值较大值较大,一些近于二倍体的一些近于二倍体的DNA异倍异倍体峰被掩盖体峰被掩盖 石蜡包埋组织的单细胞制备方法的石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立建立,使流式
16、细胞术在医学研究中得使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用到更广泛的应用,但仍存在一些问题但仍存在一些问题有待进一步解决有待进一步解决,主要存在问题如下主要存在问题如下:S期细胞百分比不如新鲜组织的期细胞百分比不如新鲜组织的S期计期计算精确算精确,S期细胞的计算偏高期细胞的计算偏高,这仍然这仍然与与CV值较大有关值较大有关 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 Schutter等发现用新鲜正常组织的等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含含量量(例如例如,鸡红细胞鸡红细胞,鳟,鳟鱼血细胞等鱼血细胞等)作为作为石蜡包埋组织细胞石蜡包埋组织细胞D
17、NA含量的标准不适含量的标准不适用用,石蜡包埋组织比新鲜组织细胞石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低荧光强度低,且样品间的荧光强度不稳且样品间的荧光强度不稳定定 DNA二倍体标准不稳定二倍体标准不稳定 对存档中的石蜡包埋组织材料对存档中的石蜡包埋组织材料,可可以采用正常组织石蜡包埋标本以采用正常组织石蜡包埋标本,作为一作为一个外参的二倍体标准个外参的二倍体标准,但要求采用的外但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品样品(例如鸡血细胞等例如鸡血细胞等)四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 脱落细胞样品的采集要保证足够的脱落细胞样品的采集
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