(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤.pdf

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1、Western blot 试剂配制1 30 丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29g N，N-亚甲双丙稀酰胺1g 双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4保存于棕色瓶中21.5 M Tris-HCl(MW=121.1)pH 8.8 Tris 碱90.75g 双蒸水400ml 用浓 HCl 调 pH 至 8.8，加双蒸水定容至500ml。4冰箱保存31.0 M Tris pH6.8 Tris 碱12g 双蒸水60ml 用浓 HCl 调 pH 至 6.8，加双蒸水定容至100ml。4冰箱保存410 SDS(w/v）SDS 10g 溶于加水至100ml，室温放置510 过硫酸胺（10%APS）过

2、硫酸胺1g 溶于 10ml 双蒸水中。可在密闭的管子里4保存一周610Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g 甘氨酸144g SDS 10g 定容至 1000ml 室温 放置。临用时稀释成1电泳缓冲液71%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg 60 mg 定容至 10 ml 8TEMED 原液，4冰箱保存92sample buffer(2样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.8 2.5ml SDS 0.8g DTT 0.3085g 甘油3ml 溴酚蓝0.004g 加双蒸水至10ml，分装 20保存10.4SDS 加样缓冲液10ml 1M Tris-

3、HCl(ph:6.8)2.5ml SDS 0.8g 溴酚蓝0.004g 甘油4ml Takara 5x buffer 总 5ml 1M Tris-HCl(ph:6.8)1.25ml SDS 0.5g 溴酚蓝 BPB 25mg 甘油2.5ml 500ul 每管分装，使用前将25ul 的 2-ME 加到没管中11转膜缓冲液Tris 碱5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml 加双蒸水至1000ml，临用前配制，4冷却文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档

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10、编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E912 1TBST Tris 碱3.0285 g 氯化钠8.766g Tween-20 500ul 加双蒸水至1000ml，现配现用。（4最多保存一周）13 n%封闭液(一般 5%)脱脂奶粉n 克溶于 100ml 1TBST，4冰箱保存附表 1 配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）5 10 15 20 25 30 40 50 6%水2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液1 2

11、3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8%水2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%丙烯酰胺溶液1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.3 1.5 mol/L Tris(pH8.8)1

12、.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03 10%水1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺溶液1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.7 文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3

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19、HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E91.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 12%水1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺溶液2 4

20、 6 8 10 12 16 20 1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 15%水1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%丙烯酰胺溶液2.5 5 7.5 10 12.5 15 20 25 1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.

21、3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 附表 2 配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（浓缩胶）所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）1 2 3 4 5 6 8 10 5%水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺

22、溶液0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1 1.3 1.7 1.5 mol/L Tris(pH8.8)0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 0 1.25 10%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文

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29、 0.1 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档

30、编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8

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34、编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8

35、A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9实验步骤：一、电泳1制胶：按附表1 和附表 2 配制电泳凝胶，下层为分离胶，上层为浓缩胶；配置分离胶：1）一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速旋动混合物并进入下一步操作。2）迅速在两玻璃板的间隙中灌注正丁醇或者双蒸水溶液，留出灌浓缩胶所需

36、的空间。（梳齿长+1cm）3）在凝胶上加满0.1%SDS(也可以用dd 水)，将凝胶垂直放于室温下。覆盖水层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。4）分离胶聚合后（约30min），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。尽可能地排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。配置浓缩胶1）一旦加入TEMED，为防止马上开始聚合，故应快速旋动混合物。2）在已经聚合的分离胶上快速直接灌注浓缩胶，直到加满后3）立即在浓缩胶中插入干净的梳子，小心避免混入气泡（如果梳子间有气泡，需要从新插梳子）。4）约 30min 后凝胶凝聚，小心拔出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,准备电泳缓冲

37、液约500ml,将电泳缓冲液加满电泳槽的中间,保持内外不通且使外面的电泳缓冲液没过电泳槽下面的金属导线。2样品处理及加样(1)等质量样品加入等体积2或 4样品缓冲液，99 煮 5min；（注意：煮样品时不要盖锅盖，以免样品溢出或者盖子鼓开）(2)2000 转离心样品10-30 秒；样品冷却后，按照预定顺序，根据梳子厚度加样。（1.5mm 的梳子上样40ul 左右,1mm 的梳子加样15ul 左右）(3)将样品加入浓缩胶的梳孔中，留一合适的梳孔中加入蛋白Marker；3电泳装置正负极正确连接后开始电泳，起始电压100V，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电压至120V，待溴酚兰达到底部边缘，

38、即可停止电泳。二、转膜1膜的准备。甲醇浸泡 PVDF 膜 1015min，转膜缓冲液平衡1530min。文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8

39、S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4

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41、S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4

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44、 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9戴手套，剪一块合适大小的PVDF 膜在甲醇中浸泡1 分钟。（注意：当进行接触滤纸、凝胶和膜的操作时，一定要带手套，否则，手上的油脂会阻断转移）。将 500ml 转膜缓冲液倒入较大的托盘中，把两块海绵、两块与膜等大的滤纸、已经浸泡好的PVDF 膜放入托盘中，

45、充分的浸泡。2 胶的准备。将玻璃板撬开，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。（禁止一个位置用力，防止玻璃破碎）撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板，去除浓缩胶，根据目的蛋白的位置，切胶。胶和PVDF膜、滤纸一样大（注意：撬玻璃板和切胶时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲，最好将撬板蘸水浸湿后再敲胶，可以避免由于胶黏在撬板上而破损）3装入转膜仪器。将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。在上面垫一张纤维垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）。然后，在垫子上垫一层滤纸。小心剥下切好的分离胶盖于滤纸上，调整位置，使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。接着，将

46、膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后尽量不再移动）并除气泡。在膜上盖一层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。（按照：夹子黑面纤维垫1 张滤纸凝胶膜1张滤纸纤维垫夹子白面的顺序排列。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡）。4转膜仪器入电泳槽进行转膜将夹子放入转移槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温，并且使转移槽在冰浴中进行转膜。加入转膜缓冲液至刚能没过夹子，100V，100min，（蛋白质在转移缓冲液中从负极向正极转移，也就是从夹子的黑面向白面。对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，时间也要延长一点。特别是务必注意加强

47、降温措施。）三、封闭：转膜结束后用封闭液室温摇床封闭1-2 小时；四、免疫1一抗孵育：用n%封闭液适当比例稀释一抗（根据说明书，一般先从1：1000 开始摸索浓度，然后根据实验结果调节到合适的浓度），室温孵育半小时后，4冰箱孵育过夜；次日从 4冰箱拿出室温再孵育半小时；21TBST 洗膜：10min3 次；3二抗孵育：用n%封闭液适当比例稀释二抗（根据具体抗体摸索），室温孵育1 小时；文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2

48、G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:C

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50、G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:CM8S7K9G8T3 HE9G8A8V2G4 ZO1J3U4F7E9文档编码:C