15第十五讲蛋白质组学剖析优秀PPT.ppt

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1、第十五讲第十五讲 蛋白质组学（二）蛋白质组学（二）第一节第一节 概概 述述其次节其次节 蛋白质组学探讨技术蛋白质组学探讨技术一、二维凝胶电泳技术一、二维凝胶电泳技术二、质谱技术二、质谱技术三、酵母双杂交体系三、酵母双杂交体系四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术第三节第三节 蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势其次节其次节 蛋白质组学探讨技术蛋白质组学探讨技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术1 1 1 1、概述：、概述：、概述：、概述：质谱技术质谱技术质谱技术质谱技术依据离子的核质比（依据离子的核质比（依据离子的核质比（依据离子的核质比（m/zm/zm/zm/z）

2、对离子进行分别并鉴定的方法。）对离子进行分别并鉴定的方法。）对离子进行分别并鉴定的方法。）对离子进行分别并鉴定的方法。质谱技术诞生于质谱技术诞生于质谱技术诞生于质谱技术诞生于20202020世纪初，始终应用于有机小分子领域世纪初，始终应用于有机小分子领域世纪初，始终应用于有机小分子领域世纪初，始终应用于有机小分子领域直到直到直到直到20202020世纪世纪世纪世纪80808080年头才渐渐进入到生物大分子领域。年头才渐渐进入到生物大分子领域。年头才渐渐进入到生物大分子领域。年头才渐渐进入到生物大分子领域。质谱技术在蛋白质组探讨中的作用质谱技术在蛋白质组探讨中的作用质谱技术在蛋白质组探讨中的作用

3、质谱技术在蛋白质组探讨中的作用在蛋白质组学探讨中，蛋白质鉴定是最关键的一环。在蛋白质组学探讨中，蛋白质鉴定是最关键的一环。在蛋白质组学探讨中，蛋白质鉴定是最关键的一环。在蛋白质组学探讨中，蛋白质鉴定是最关键的一环。质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组探讨的主要支质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组探讨的主要支质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组探讨的主要支质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组探讨的主要支撑技术。撑技术。撑技术。撑技术。对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质

4、或多肽的分对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分子质量。子质量。子质量。子质量。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质探讨。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质探讨。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质探讨。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质探讨。2 2、质谱仪的工作原理、质谱仪的工作原理基本原理基本原理分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分别，依据不同离分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分别，依据不同离子质荷比子质荷比(m/z)(m/z)的差异，对离子进行分别并确定分子质量。的差异，对离子进行分别并确定分子质量。质谱仪组成：质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、进样

5、装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析等离子检测器和数据分析等离子化源和质量分析器是两个核心部件离子化源和质量分析器是两个核心部件质谱仪分类：依据两个中心部件可以分为质谱仪分类：依据两个中心部件可以分为电啧雾电啧雾(ESI)(ESI)快原子轰击质谱快原子轰击质谱(FAB)(FAB)飞机时间质谱飞机时间质谱 四极杆质谱四极杆质谱工作原理工作原理不同离子源和质量分析器相匹配不同离子源和质量分析器相匹配基本确定了质谱仪的工作原理和方基本确定了质谱仪的工作原理和方式。式。如：如：ESIESI离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配如：基质帮助的激光解析离子

6、化源与飞行时间分析器相结合，如：基质帮助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，（MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）。）。质量分析器质量分析器离子化源离子化源2 2、常用生物质谱的类型和特点、常用生物质谱的类型和特点（1 1）电喷雾质谱仪（）电喷雾质谱仪（ESI-MSESI-MS）l电喷雾离子化电喷雾离子化(elcctrosprayelcctrospray ionization ESI)ionization ESI)：一种一种“软电离软电离”方式方式将样品溶解，以将样品溶解，以液相方式液相方式通过毛细管到达通过毛细管到达喷口喷口，在，在喷口高电压喷口高电压作用下形作用下形成成

7、带电荷的微滴带电荷的微滴，微滴溶剂蒸发，微滴，微滴溶剂蒸发，微滴表面的电荷密度表面的电荷密度随随半径减小半径减小而而增增加加，到达某一临界点时，样品将，到达某一临界点时，样品将以离子方式以离子方式从从液滴表面蒸发液滴表面蒸发，进入气相，进入气相，实现实现样品的离子化。样品的离子化。ESI过程图解过程图解（引自理查德（引自理查德J.辛普森辛普森.蛋白质与蛋白质组学试验指南蛋白质与蛋白质组学试验指南,2006）ESI 离子化过程离子化过程l特点：特点：lESI-MS ESI-MS 是一种典型的是一种典型的“软离子软离子”方式方式l没有干脆的外界能量作用于分子，分子结构破坏较少。没有干脆的外界能量作

8、用于分子，分子结构破坏较少。l可以监测大分子质量的分子可以监测大分子质量的分子l电喷雾质谱可形成多电荷离子，电喷雾质谱可形成多电荷离子，l在较小的在较小的m/zm/z范围内可以监测到大分子质量的分子。范围内可以监测到大分子质量的分子。l测定分子质量范围测定分子质量范围l可测定分子质量可测定分子质量10,0100 Da10,0100 Da以下的蛋白以下的蛋白l最高达最高达15,01OO Da15,01OO Da马心肌红蛋白马心肌红蛋白(分子质量分子质量16951.5 Da)的假想的假想ESI质量图谱质量图谱 （引自理查德（引自理查德J.辛普森辛普森.蛋白质与蛋白质组学试验指南蛋白质与蛋白质组学试

9、验指南,2006）带不同电荷蛋白质的（志向）质谱图。带不同电荷蛋白质的（志向）质谱图。l常见的以电喷雾为离子化方式的质谱仪：常见的以电喷雾为离子化方式的质谱仪：l电喷雾电喷雾-三级四极杆质谱三级四极杆质谱(ESI-Q-MS)(ESI-Q-MS)l电喷雾电喷雾-三级四极杆飞行时间质谱三级四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)(ESI-Q-TOF-MS)l电喷雾电喷雾-傅里叶回旋共振质谱傅里叶回旋共振质谱(ESI-FTUCR-MS)(ESI-FTUCR-MS)l液相色谱液相色谱-电喷雾质谱电喷雾质谱(LC-MS)(LC-MS)l液质联用液质联用(LC-MS)(LC-MS)：l电喷雾质谱接受

10、液相方式进样，可与液相色谱联用。电喷雾质谱接受液相方式进样，可与液相色谱联用。l蛋白质或多肽经蛋白质或多肽经HPLCHPLC分别，干脆进入质谱仪进行分子分别，干脆进入质谱仪进行分子质量测定。质量测定。T11：lycopene LC-ESI-MS测定类胡萝卜素测定类胡萝卜素l四级杆分析器四级杆分析器l结构结构l四级场（见下图）四级场（见下图）l原理：原理：l在确定的在确定的VdcVdc和和VrfVrf下，只有确定质量的离子通过四级场，到达检测器下，只有确定质量的离子通过四级场，到达检测器l在确定在确定VdcVdc和和VrfVrf下，变更下，变更VrfVrf可实现扫描可实现扫描l特点：扫描速度快，

11、灵敏度高特点：扫描速度快，灵敏度高u四根棒状电极，形成四级场四根棒状电极，形成四级场u1、3棒棒+(Vdc+Vrf)u2、4棒棒(Vdc+Vrf)l 时间飞行质谱分析时间飞行质谱分析（Time of Flight Analyze）特点特点仪器结构简洁，不须要磁场、电场等；仪器结构简洁，不须要磁场、电场等；扫描速度快，可在扫描速度快，可在10-5s内视察到整段图谱；内视察到整段图谱；无聚焦狭缝，灵敏度很高；无聚焦狭缝，灵敏度很高；可用于大分子的分析（几十万原子量单位），可用于大分子的分析（几十万原子量单位），在生命科学中用途很广；在生命科学中用途很广；(2)(2)基质帮助激光解吸离子化质谱基质帮

12、助激光解吸离子化质谱lMALDI MALDI（matrix-assisted laser desorption ionizationmatrix-assisted laser desorption ionization）l将样品包埋在固体基质中，基质吸取激光供应的能量而蒸发，将样品包埋在固体基质中，基质吸取激光供应的能量而蒸发，l携带部分样品分子进入气相，携带部分样品分子进入气相，l将一部分能量传递给样品分子使其离子化。将一部分能量传递给样品分子使其离子化。l激光解吸基质的重要性激光解吸基质的重要性l早期早期激光解吸离子化没有基质帮助，激光能量干脆作用于被分析物，激光解吸离子化没有基质帮助，激

13、光能量干脆作用于被分析物，使分子碎裂，产生大量碎片，而不易得到分子离子。使分子碎裂，产生大量碎片，而不易得到分子离子。l1988年，年，Tanaka等接受可吸取激光的基质（如甘油）包埋被分析物，等接受可吸取激光的基质（如甘油）包埋被分析物，避开激光对分子结构的破坏，测定蛋白分子质量为避开激光对分子结构的破坏，测定蛋白分子质量为35kDal进一步接受固体基质使样品分散得更匀整，离子化效果更好。进一步接受固体基质使样品分散得更匀整，离子化效果更好。l通常接受的激光束波长为通常接受的激光束波长为337nm，样品的电离过程是由基质介导的，样品的电离过程是由基质介导的，基质对分析的灵敏度、辨别率和精确度

14、有很大影响。基质对分析的灵敏度、辨别率和精确度有很大影响。l常用的基质有（对于蛋白质和多肽样品）常用的基质有（对于蛋白质和多肽样品）l芥子酸芥子酸(SA)、d-氰基氰基-4羟肉桂酸（羟肉桂酸（CHCA）、）、l2,5-二羟基苯甲酸（二羟基苯甲酸（DHB）等。）等。lMALDIMALDI主要特点主要特点l离子电荷数通常为离子电荷数通常为1 12 2，l不形成困难的多电荷图，对图谱解析比较清晰、简洁。不形成困难的多电荷图，对图谱解析比较清晰、简洁。l如：乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图。如：乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图。l固相进样方式，不受溶液性质的影响，对杂质的忍耐性较固相进样方式，不受溶液性质的影

15、响，对杂质的忍耐性较好。好。l生物样品制备时生物样品制备时l在样品中引入去垢剂在样品中引入去垢剂l效果更好。效果更好。l(如尿素和如尿素和SDS)SDS)等等乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图l常见质谱仪：常见质谱仪：l基质帮助激光解吸离子化基质帮助激光解吸离子化-飞行时间质谱飞行时间质谱lMALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSlMALDI-TOF/TOFMSMALDI-TOF/TOFMSl基质帮助激光解吸离子化三级四极基质帮助激光解吸离子化三级四极飞行时飞行时间质谱间质谱lMALDI-Q-TOF-MSMALDI-Q-TOF-MS3 3、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴

16、定技术、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴定技术肽质量指纹图谱肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting(peptide mass fingerprinting，PMF)PMF)蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。图谱。每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不相同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不相同，肽混合物质量数亦具其特征性，肽混合物质量数亦具其特征性，经质谱分析得到是图谱称为指纹图谱，经质谱分析得到是图谱称为指纹图

17、谱，应用：应用：蛋白质鉴定蛋白质鉴定在蛋白质数据库中，找寻具有相像肽指纹图谱的蛋白质。在蛋白质数据库中，找寻具有相像肽指纹图谱的蛋白质。酶切蛋白质，质谱分析得到酶切蛋白质，质谱分析得到PMFPMF，检索数据库进行鉴定。，检索数据库进行鉴定。PMFPMF鉴定蛋白质基本路途鉴定蛋白质基本路途l蛋白质的肽谱的特点蛋白质的肽谱的特点l肽谱测定仪器：最有效的质谱仪：肽谱测定仪器：最有效的质谱仪：MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSl灵敏度高，谱峰简洁，每个谱峰代表一种肽段。灵敏度高，谱峰简洁，每个谱峰代表一种肽段。l肽谱鉴定特点：肽谱鉴定特点：l若蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸被修

18、饰若蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸被修饰（如半胱氨酸烷基化、甲硫氨酸氧化），（如半胱氨酸烷基化、甲硫氨酸氧化），l蛋白质蛋白质PMFPMF就会有一些质量数与理论值不符，就会有一些质量数与理论值不符，lPMFPMF鉴定的不须要将全部肽质量数都与理论值相符。鉴定的不须要将全部肽质量数都与理论值相符。lPMFPMF方法可同时处理很多样品，是大规模鉴定的首选方法。方法可同时处理很多样品，是大规模鉴定的首选方法。l举例：举例：lPMFPMF鉴定双向电泳分别蛋白质的实例，如下图（鉴定双向电泳分别蛋白质的实例，如下图（NextNext）：）：l来源于人白血病细胞的蛋白质，胰蛋白酶酶切，得到来源于人

19、白血病细胞的蛋白质，胰蛋白酶酶切，得到PMFPMF，经数据库检索鉴定为人丙酮酸激酶。，经数据库检索鉴定为人丙酮酸激酶。l图中标有图中标有“*”“*”峰：能与数据库中肽质量数理论值相符的。峰：能与数据库中肽质量数理论值相符的。蛋白质的蛋白质的PMFPMF2D2D凝胶上蛋白点的凝胶上蛋白点的PMFPMF丙酮酸激酶丙酮酸激酶“*”“*”与与数据库数据库相符相符人白血病细胞人白血病细胞 4 4、串联质谱技术、串联质谱技术l概念：指用质谱作质量分别的质谱分析方法。也称质谱概念：指用质谱作质量分别的质谱分析方法。也称质谱-质谱法，多级质谱法，质谱法，多级质谱法，二维质谱法和序贯质谱法。如：磁分析器二维质谱

20、法和序贯质谱法。如：磁分析器-静电分析器静电分析器-磁分析器的串联磁分析器的串联 l特点：自动化程度、敏感性，高通量分析特点：自动化程度、敏感性，高通量分析l如：二维色谱如：二维色谱串联质谱串联质谱(2D-HPLC/MS)l优点：可大规模分别鉴定蛋白质，在鉴定膜蛋白、低丰度的蛋白质及大分子优点：可大规模分别鉴定蛋白质，在鉴定膜蛋白、低丰度的蛋白质及大分子蛋白质等方面显示出独特的优势，蛋白质等方面显示出独特的优势，l缺点：串联质谱技术得到的肽序列图谱相对困难，从图谱进行完整的序列分缺点：串联质谱技术得到的肽序列图谱相对困难，从图谱进行完整的序列分析难度较大。析难度较大。l如：肽序列标签技术如：肽

21、序列标签技术(peptide sequence tag，PST)l肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的已知序列的多肽标签。肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的已知序列的多肽标签。l已知氨基酸序列亲和标签已知氨基酸序列亲和标签+离子质量（离子质量（2H）+蛋白质结合部位三者构成蛋白质结合部位三者构成PSTlPST和蛋白质结合，酶切，亲和分别，质谱分析，数据库检索鉴定蛋白质的和蛋白质结合，酶切，亲和分别，质谱分析，数据库检索鉴定蛋白质的方法。方法。l解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术三、酵母

22、双杂交技术1、概念：、概念：依据生物体转录激活过程，在酵母细胞内建立的探讨蛋白质依据生物体转录激活过程，在酵母细胞内建立的探讨蛋白质与蛋白质之间相互作用的有效体系和方法。与蛋白质之间相互作用的有效体系和方法。1989年，年，Fields等正式建立了酵母双杂交等正式建立了酵母双杂交(veast two-hybrid)体系，又称为体系，又称为“相互作用陷阱相互作用陷阱”。2、酵母双杂交的原理：依据生物体转录激活过程建立的，、酵母双杂交的原理：依据生物体转录激活过程建立的，先理解先理解转录激活因子的激活过程转录激活因子的激活过程转录激活因子的结构特点转录激活因子的结构特点真核生物的位点特异性转录激活

23、因子具有两个独立的结构域真核生物的位点特异性转录激活因子具有两个独立的结构域两个独立的结构域，各具功能，互不影响两个独立的结构域，各具功能，互不影响DNA结合结构域结合结构域(DNA bindingdomain，BD)转录激活结构域转录激活结构域(transcriptional activation domain，AD)激活因子必需同时含有这两个结构域，否则无激活功能激活因子必需同时含有这两个结构域，否则无激活功能激活因子对基因表达的激活激活因子对基因表达的激活不同来源激活因子的不同来源激活因子的BD区和区和AD区结合后区结合后AD和和BD两种结构域的上游活化序列相互接近两种结构域的上游活化序

24、列相互接近特异性地激活特异性地激活BD结合的基因，激活转录过程，基因表达结合的基因，激活转录过程，基因表达依据这一原理，建立了酵母双杂交体系依据这一原理，建立了酵母双杂交体系转录激活因子的结构和转录的激活转录激活因子的结构和转录的激活2、酵母双杂交的原理：、酵母双杂交的原理：探讨探讨“X蛋白蛋白”和和“Y蛋白蛋白”是否发生相互作用？是否发生相互作用？将蛋白质将蛋白质X的基因与特异的的基因与特异的BD基因融合，成为基因融合，成为“诱饵诱饵”蛋白蛋白蛋白质蛋白质Y基因与特异的基因与特异的AD基因融合为基因融合为“猎物猎物”蛋白蛋白编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时编码两种结构域的基因在细胞核

25、内同时表达时若蛋白质若蛋白质X和和Y之间存在相互作用，报道基因表达。之间存在相互作用，报道基因表达。若蛋白质若蛋白质X和和Y之间不存在相互作用，报道基因不表达。之间不存在相互作用，报道基因不表达。酵母双杂交系统原理示意图酵母双杂交系统原理示意图3、酵母双杂交系统的组成和特点酵母双杂交系统的组成和特点（1）三个部分组成）三个部分组成BD融合融合的蛋白表达载体的蛋白表达载体，表达的蛋白称，表达的蛋白称诱饵蛋白诱饵蛋白AD融合融合的蛋白表达载体的蛋白表达载体，表达的蛋白称，表达的蛋白称靶蛋白靶蛋白有一个或多个报告基因的宿主菌株有一个或多个报告基因的宿主菌株常见报道基因常见报道基因E.coli Lac

26、Z基因，蓝白菌落筛选基因，蓝白菌落筛选养分缺陷型筛选养分缺陷型筛选发光蛋白的基因（发光蛋白的基因（GFP）操作程序：操作程序：克隆诱饵蛋白基因克隆诱饵蛋白基因克隆靶蛋白基因克隆靶蛋白基因构建构建BDBD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白构建构建ADAD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞细胞培育，视察报告基因的表达状况细胞培育，视察报告基因的表达状况判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用状况判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用状况（2）为何构建

27、酵母双杂交系统）为何构建酵母双杂交系统酵母细胞便于转化，结果易于筛选；酵母细胞便于转化，结果易于筛选；选择性好。选择性好。内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞靶蛋白结合，内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞靶蛋白结合，避开了对文库编码蛋白质的干扰。避开了对文库编码蛋白质的干扰。（3）酵母双杂交系统的发展）酵母双杂交系统的发展反向双杂交体系：反向双杂交体系：用于鉴定影响蛋白质间相互作用的化合物，用于鉴定影响蛋白质间相互作用的化合物，在药物探讨开发方面具有特殊重要的应用价值。在药物探讨开发方面具有特殊重要的应用价值。三杂交体系：三杂交体系：对双杂交体系的一个有益补充，对双杂交体系的一个有益补充，用于探讨多种蛋

28、白质之间的相互作用。用于探讨多种蛋白质之间的相互作用。（4）双杂交系统的优势？）双杂交系统的优势？融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行。融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行。蛋白质能保持自然的折叠状态，类似人体的生理状态。蛋白质能保持自然的折叠状态，类似人体的生理状态。证明蛋白质间的相互作用更接近于体内的真实水平。证明蛋白质间的相互作用更接近于体内的真实水平。正是其他体外生化检验方法所缺乏的。正是其他体外生化检验方法所缺乏的。筛选筛选cDNA文库中编码的，与已知蛋白质特异作用的，成分。文库中编码的，与已知蛋白质特异作用的，成分。揭示很多已知蛋白质之间的未知作用。揭示很多已知

29、蛋白质之间的未知作用。有助于发觉（很多）新基因。有助于发觉（很多）新基因。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生，不须要纯化蛋白。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生，不须要纯化蛋白。能检测到短暂的相互作用，广泛应用于信号通路的探讨。能检测到短暂的相互作用，广泛应用于信号通路的探讨。（5）酵母双杂交系统的局限性）酵母双杂交系统的局限性只探讨在核内表达的蛋白质的相互作用只探讨在核内表达的蛋白质的相互作用融合蛋白的构建可能影响蛋白质本身的活性或折叠状态；融合蛋白的构建可能影响蛋白质本身的活性或折叠状态；假如特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生，则不能检测到假如特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生，则不能

30、检测到修饰后蛋白质的相互作用；修饰后蛋白质的相互作用；很多蛋白质与很多蛋白质与BD融合，具有自激活效应，导致假阳性结果。融合，具有自激活效应，导致假阳性结果。四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术1、概念、概念蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）：又叫蛋白质微阵列（）：又叫蛋白质微阵列（protein microarray）是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片。是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片。将大量纯化的蛋白质有规则的固定到某种介质载体上，将大量纯化的蛋白质有规则的固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互

31、作用利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。检测分析蛋白质的一种芯片。蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术依据蛋白质之间的相互作用的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的依据蛋白质之间的相互作用的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的特定蛋白质分子进行高通量分析检测的方法。特定蛋白质分子进行高通量分析检测的方法。是在蛋白质水平上，了解和探讨，各种生命现象本质的重要方法。是在蛋白质水平上，了解和探讨，各种生命现象本质的重要方法。蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图2、基本原理、基本原理将各种将各种蛋白质（探针）蛋白质

32、（探针）有序地有序地固定固定于载体上，于载体上，制备蛋白芯片制备蛋白芯片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。利用蛋白与分子之间利用蛋白与分子之间相互作用相互作用的原理，用标记了特定荧光抗体的的原理，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分（蛋白质或其他成分（报告分子报告分子）与芯片作用，经漂洗将未能与芯）与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去。片上的蛋白质互补结合的成分洗去。利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作通过荧光强度分

33、析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质功能。用的关系，测定各种蛋白质功能。4、分类：依据用途的不同，可分为、分类：依据用途的不同，可分为蛋白功能芯片：（用于探讨）蛋白功能芯片：（用于探讨）将自然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片将自然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片用于自然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析用于自然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析可用来进行蛋白可用来进行蛋白-蛋白、蛋白蛋白、蛋白-多肽、蛋白多肽、蛋白-小分子、蛋白小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白结合以及蛋白-酶反应等探讨。酶反应等探讨。蛋白检测芯片：（用于检验）蛋白检测芯片：（用于检验）将具有高度亲和性

34、的蛋白质或多肽（如单抗，小片段抗体，受将具有高度亲和性的蛋白质或多肽（如单抗，小片段抗体，受体等）固定在载体上，制备检测芯片。体等）固定在载体上，制备检测芯片。用以识别困难生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。用以识别困难生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。5、操作关键环节、操作关键环节l蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备l报告分子（探针）的标记报告分子（探针）的标记l信号的检测及数据处理信号的检测及数据处理仪器和软件仪器和软件l蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备固相载体固相载体的选择和处理（膜载体和玻璃载体）；的选择和处理（膜载体和玻璃载体）；蛋白质靶标蛋白质靶标的处理；的处理；将蛋白质靶标点在固

35、相载体上，并将其将蛋白质靶标点在固相载体上，并将其固定固定；蛋白质芯片的蛋白质芯片的封闭封闭。l报告分子（探针）的标记报告分子（探针）的标记荧光染料荧光染料酶酶融合表达融合表达红色荧光蛋白（红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（）和绿色荧光蛋白（GFP）与检测蛋白形成融合蛋白共表达与检测蛋白形成融合蛋白共表达l信号的检测及数据处理信号的检测及数据处理荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件（荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件（CCD）检测）检测酶标芯片：显色后用高精度的酶标芯片：显色后用高精度的CCD检测检测应用计算机软件对检测结果进行数据分析，得出结论。应用计算机软件对检测结果进行数据

36、分析，得出结论。6、蛋白质芯片的特点、蛋白质芯片的特点高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好大量蛋白质的快速、定性、定量（？）分析大量蛋白质的快速、定性、定量（？）分析运用简洁，结果正确率较高运用简洁，结果正确率较高只需少量标本只需少量标本接受光敏染料标记，灵敏度高，精确性好接受光敏染料标记，灵敏度高，精确性好所需试剂少，可干脆应用血清样本，便于诊断，好用性所需试剂少，可干脆应用血清样本，便于诊断，好用性强强其不足在于：稳定性，操作困难其不足在于：稳定性，操作困难7、蛋白质芯片的应用、蛋白质芯片的应用基础探讨基础探讨蛋白质蛋白质DNA相互作用探讨相互作用探

37、讨蛋白质蛋白质mRNA相互作用探讨相互作用探讨临床：疾病诊断与疗效判定临床：疾病诊断与疗效判定须要的时间短、样品量少，须要的时间短、样品量少，给出大量的诊断和预后信息。给出大量的诊断和预后信息。新药筛选与研制新药筛选与研制找寻药物的靶标，检查药物的毒副作用，找寻药物的靶标，检查药物的毒副作用，高通量筛选，缩短药物筛选时间高通量筛选，缩短药物筛选时间环境监测及食品检测环境监测及食品检测诊断举例：诊断举例：国内临床上应用较多的蛋白质芯国内临床上应用较多的蛋白质芯片片（C-12）多种肿瘤标记物蛋白质）多种肿瘤标记物蛋白质芯片检测系统芯片检测系统主要是检测患者血清中的肿瘤标主要是检测患者血清中的肿瘤标

38、记物含量及变更状况，记物含量及变更状况，作为推断常见肿瘤的发生、发展、作为推断常见肿瘤的发生、发展、治疗效果及其预后的监测指标。治疗效果及其预后的监测指标。C-12多种肿瘤标记物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤多种肿瘤标记物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤原理原理操作操作分析分析靶分子靶分子识别分子识别分子报告分子报告分子第三节第三节 蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势l概述概述l已应用到生命科学各个领域已应用到生命科学各个领域l如：细胞生物学、神经生物学、临床蛋白质组学、药理蛋白质组学、如：细胞生物学、神经生物学、临床蛋白质组学、药理蛋白质组学、毒理蛋白质组学等。毒理蛋白质

39、组学等。l探讨对象探讨对象l覆盖生物范围：原核微生物、真核微生物、植物和动物等覆盖生物范围：原核微生物、真核微生物、植物和动物等l涉及各种重要的生物学现象：如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。涉及各种重要的生物学现象：如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。l在临床上在临床上l心脑血管病、肿瘤的发生（机制）与发展。心脑血管病、肿瘤的发生（机制）与发展。l毒理学、细胞分化与胚胎发育等基因调控机制。毒理学、细胞分化与胚胎发育等基因调控机制。l重大疾病的发生与治疗、个体化诊断、肝脏疾病、早老性痴呆药学探重大疾病的发生与治疗、个体化诊断、肝脏疾病、早老性痴呆药学探讨。讨。l环境与健康关系方面的探讨等。全面

40、分析地方病发病机理环境与健康关系方面的探讨等。全面分析地方病发病机理了解了解了解了解 一、蛋白质组学与微生物一、蛋白质组学与微生物l总体概述：总体概述：l为适应基因组学和蛋白质组学的发展，微生物蛋白质组学应运而生。为适应基因组学和蛋白质组学的发展，微生物蛋白质组学应运而生。l微生物蛋白质组学探讨集中在两个方面：微生物蛋白质组学探讨集中在两个方面：l各类模式微生物，特殊是典型的模式微生物（大肠杆菌和酵母菌）蛋各类模式微生物，特殊是典型的模式微生物（大肠杆菌和酵母菌）蛋白质组学的探讨，几乎涉及了蛋白质组学现有领域的方方面面。白质组学的探讨，几乎涉及了蛋白质组学现有领域的方方面面。l 尤其是物质代谢

41、、能量代谢和信号途径分析等尤其是物质代谢、能量代谢和信号途径分析等l病原微生物方面：蛋白质组学探讨，对于了解其毒性因子、抗原及疫病原微生物方面：蛋白质组学探讨，对于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制备特殊重要。主要集中在以下几个层面：苗的制备特殊重要。主要集中在以下几个层面：l病原微生物，特殊是模式微生物在不同生长条件下的蛋白表达谱的探病原微生物，特殊是模式微生物在不同生长条件下的蛋白表达谱的探讨；讨；l同一种病原微生物的不同菌株之间的蛋白质组的比较；同一种病原微生物的不同菌株之间的蛋白质组的比较；l同一种病原微生物的不同生理状态的蛋白质组学探讨；同一种病原微生物的不同生理状态的蛋白质组学探讨；l

42、病原微生物的病原微生物的“亚蛋白质组亚蛋白质组”分析；分析；l宿主和微生物的相互关系，找寻新型疫苗的靶分子等。宿主和微生物的相互关系，找寻新型疫苗的靶分子等。二、蛋白质组学与医学二、蛋白质组学与医学u疾病与蛋白质的关系疾病与蛋白质的关系u疾病的发生、发展及预后和正常生理过程，都与蛋白质疾病的发生、发展及预后和正常生理过程，都与蛋白质的变更有关。的变更有关。u对机体蛋白质的性质和数量变更的精确把握，对机体蛋白质的性质和数量变更的精确把握，u是揭示机体生理变更，疾病的病因、发病机制的重要手是揭示机体生理变更，疾病的病因、发病机制的重要手段。段。u蛋白质组学技术在疾病蛋白质组学技术在疾病 诊断和治疗

43、诊断和治疗 中的应用中的应用u对于疾病生物标记物的检测具有不行替代的优势对于疾病生物标记物的检测具有不行替代的优势.（高通（高通量）量）u找寻特异性蛋白质，用于疾病早期诊断。在出现临床症找寻特异性蛋白质，用于疾病早期诊断。在出现临床症状之前就实行相应的干预治疗手段。（早期诊断、早期状之前就实行相应的干预治疗手段。（早期诊断、早期治疗）治疗）在肿瘤上的应用在肿瘤上的应用从正常组织演化到早期、中晚期癌的不同的病程阶段蛋白质组的变更，从正常组织演化到早期、中晚期癌的不同的病程阶段蛋白质组的变更，探讨肿瘤发朝气制、标记物筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗效果的评价，探讨肿瘤发朝气制、标记物筛选和鉴定、肿瘤分类

44、、治疗效果的评价，使肿瘤的诊断、分类和疗效评价，由单一肿瘤标记物发展成为蛋白质谱使肿瘤的诊断、分类和疗效评价，由单一肿瘤标记物发展成为蛋白质谱或基因谱的变更来进行综合推断。（更客观精确）或基因谱的变更来进行综合推断。（更客观精确）结肠癌标记物发觉和应用结肠癌标记物发觉和应用正常结肠和结肠癌组织的比较蛋白质组学探讨正常结肠和结肠癌组织的比较蛋白质组学探讨发觉三种特异性结肠癌标记物：发觉三种特异性结肠癌标记物：(S100 A8)、(S100 A9)和和(S100 All)用于结肠癌的早期筛查用于结肠癌的早期筛查乳腺癌标记物发觉和应用乳腺癌标记物发觉和应用组学探讨发觉：核基质蛋白组学探讨发觉：核基质

45、蛋白66(NMP66)，28.3 kDa，用于大规模的乳腺癌早期诊断临床试验。用于大规模的乳腺癌早期诊断临床试验。与现有血清学标记物与现有血清学标记物CA15-3和和CA27-29的特异性和敏感性相比，更高。的特异性和敏感性相比，更高。u在心血管疾病的应用在心血管疾病的应用u扩张性心肌病的治疗是医学工作者面临的巨大挑战，扩张性心肌病的治疗是医学工作者面临的巨大挑战，u病理机制病理机制不清晰不清晰u通过蛋白质组分析有可能从蛋白质水平阐述其病理机制。通过蛋白质组分析有可能从蛋白质水平阐述其病理机制。u探讨结果发觉探讨结果发觉u扩张性心肌病约扩张性心肌病约100种蛋白质表达水平下调种蛋白质表达水平下

46、调u这些蛋白质变更可能在发病机制中起着关键作用这些蛋白质变更可能在发病机制中起着关键作用 u有待于深化有待于深化u在感染性疾病上的应用在感染性疾病上的应用u很多致病微生物（如支原体、结核分枝杆菌）全基因组测很多致病微生物（如支原体、结核分枝杆菌）全基因组测序工作已经完成。序工作已经完成。u蛋白质组分析有助于鉴定该微生物产生的全部蛋白质蛋白质组分析有助于鉴定该微生物产生的全部蛋白质u找寻新的诊断标记、药物作用靶点和制备疫苗的抗原确定找寻新的诊断标记、药物作用靶点和制备疫苗的抗原确定族等族等u有望解决临床上令人麻烦的致病微生物耐药性问题有望解决临床上令人麻烦的致病微生物耐药性问题u研制出针对性的疫

47、苗研制出针对性的疫苗u可进一步提高感染性疾病的预防治疗效果可进一步提高感染性疾病的预防治疗效果u如：结核分枝杆菌的蛋白质组探讨如：结核分枝杆菌的蛋白质组探讨uRosenkrandsRosenkrands等等u筛选出一种新的蛋白质，用作诊断标记物，取得了满筛选出一种新的蛋白质，用作诊断标记物，取得了满足的效果。足的效果。三、蛋白质组学与药学三、蛋白质组学与药学l疾病的发生和药物治疗靶点与很多蛋白有关疾病的发生和药物治疗靶点与很多蛋白有关l蛋白质组学在找寻有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。蛋白质组学在找寻有效的药物靶点及新药开发方面有广泛的应用。l比较正常状态和疾病状态及药物治疗后细胞内蛋

48、白质表达的差异比较正常状态和疾病状态及药物治疗后细胞内蛋白质表达的差异l高通量药物筛选，有可能找到有效的药物靶点的药物。高通量药物筛选，有可能找到有效的药物靶点的药物。l蛋白质组学在药物作用方面的应用蛋白质组学在药物作用方面的应用l加速了药物开发、鉴定及改进过程加速了药物开发、鉴定及改进过程l例如，分析降血脂药物（洛伐他汀）的蛋白质表达差异例如，分析降血脂药物（洛伐他汀）的蛋白质表达差异分析药理作用机分析药理作用机制制l表明洛伐他汀影响了与胆固醇代谢相关的一些蛋白质的表达。表明洛伐他汀影响了与胆固醇代谢相关的一些蛋白质的表达。l在药物毒理学探讨中的作用在药物毒理学探讨中的作用l如：环孢素如：环

49、孢素A，对小鼠肾脏的毒性作用机制，的探讨，对小鼠肾脏的毒性作用机制，的探讨lSteiner等通过二维凝胶电泳等通过二维凝胶电泳l比较环孢素比较环孢素A，处理肾脏细胞（前，处理肾脏细胞（前后），蛋白质表达丰度变更，后），蛋白质表达丰度变更，l结果发觉：一个结果发觉：一个28kDa的特异蛋白的特异蛋白(calbindin D)表达削减，表达削减，l现已证明环孢素现已证明环孢素A的毒性与这种参与钙离子结合及转运的蛋白质削减有关。的毒性与这种参与钙离子结合及转运的蛋白质削减有关。靶点靶点靶点靶点新药新药新药新药 四、蛋白质组学探讨中存在的问题及前景展望四、蛋白质组学探讨中存在的问题及前景展望1、蛋白质

50、组学探讨中存在的问题、蛋白质组学探讨中存在的问题在方法学上在方法学上二维凝胶电泳和质谱分析是主流技术，但其辨别率、特异性、灵敏度及二维凝胶电泳和质谱分析是主流技术，但其辨别率、特异性、灵敏度及重复性有待进一步提高。（如：重复性有待进一步提高。（如：E.Coli，1100个蛋白点，微量蛋白？）个蛋白点，微量蛋白？）如：细胞内执行重要功能的蛋白质和细胞因子表达丰度往往很低，用目如：细胞内执行重要功能的蛋白质和细胞因子表达丰度往往很低，用目前的显色方法难以辨别。前的显色方法难以辨别。如：对一些高分子量、极酸或极碱性的蛋白质和膜蛋白分别难度较大。如：对一些高分子量、极酸或极碱性的蛋白质和膜蛋白分别难度