九免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架优秀PPT.ppt

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1、免疫荧光染色视察肿免疫荧光染色视察肿瘤细胞骨架瘤细胞骨架试验九试验九试验目的与要求试验目的与要求1.驾驭免疫荧光技术的基本原理驾驭免疫荧光技术的基本原理;2.了解免疫荧光技术在生命科学中的了解免疫荧光技术在生命科学中的广泛应用广泛应用.一、试验的基本原理一、试验的基本原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用确定波长的激发光对样品进行激基本原理是利用确定波长的激发光对样品进行激发，使之产生确定波长的荧光，从而用于对样品发，使之产生确定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量视察检测。结构或其组分进行定性、定位、定量

2、视察检测。抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是很多免这种结合在体外也能发生，这种特性就是很多免疫检测方法的基础。疫检测方法的基础。荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量视察检测。其组分进行定性、定位、定量视察检测。三、试剂与器材三、试剂与器材人肿瘤细胞涂片人肿瘤细胞涂片甲醇、甲醇、H2O2、滤纸、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、正常羊血清封闭液、一抗、FITC标记的标记的IgG、甘油、甘油/PBS封片剂、盖玻片封片剂、盖玻片荧光显微镜

3、荧光显微镜玻片细胞置于甲醇中玻片细胞置于甲醇中-10固定固定5min，室温凉干（或冷丙酮，室温凉干（或冷丙酮固定固定5min，室温凉干）；，室温凉干）；PBS漂洗漂洗2min3次；次；3%H2O2室温孵育室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶（以去除细胞内源性过氧化物酶活性）；活性）；PBS漂洗漂洗5min3次；次；10%正常羊血清封闭液（正常羊血清封闭液（0.1M PBS配制）室温封闭配制）室温封闭20min；弃封闭液（此步骤不必弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）；洗涤）；四、试验步骤四、试验步骤 用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:20

4、0）37孵育孵育1h（或（或4孵育过夜）；孵育过夜）；PBS漂洗漂洗5min3次；次；用适当比例稀释的二抗（用适当比例稀释的二抗（FITC标记的标记的IgG）（一般）（一般稀释比为稀释比为1:100-1:200，用加有，用加有BSA的的TBST配制）配制）室温孵育室温孵育30min（避光黑暗条件下进行）；（避光黑暗条件下进行）；PBS漂洗漂洗5min3次；次；甘油甘油/PBS封片剂（封片剂（PBS:甘油甘油=1：9，v/v，pH8.0-8.5）封片；）封片；荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜视察拍照。荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜视察拍照。五、留意事项五、留意事项1.留意各级抗体浓度的运留意各级抗体浓度的运用范围用范围;2.荧光抗体孵育时要留意荧光抗体孵育时要留意避光避光;3.留意各步骤的漂洗要充留意各步骤的漂洗要充分分.六、作业与思索题六、作业与思索题试述免疫荧光技术的基本原理试述免疫荧光技术的基本原理,并描述试验中所视察的试验现并描述试验中所视察的试验现象象.思索题思索题:试比较免疫荧光技术与免疫细试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学技术的异同胞化学技术的异同.