基因工程试题及复习资料全集.docx

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1、作业一：一、名词解释：1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因及其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系

2、而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加

3、上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I, 等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。

4、条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(5,vv)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)； (3)低离子强度(100U/mg）、高浓度的甘油（5%）、低离子强度（pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的star activity现象.抑制star activity的措施 减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶济或乙醇

5、提高离子强度到100150mM 降低反应pH至pH7.0 使用Mg2+作为二价阳离子 DNA连接酶 需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。体外连接DNA片段的方式 黏性末端 同种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端的连接。 平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连杆（ linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接，DNA接头(adapter)连接法。平末端DNA片段的连接 （1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端

6、核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。载体应具备的条件 1. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性2. 具有及特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 具有多种单一的酶切位点4. 具有合适的选择性标记 自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力质粒DNA的复制类型 严谨型质粒 松弛型质粒天然质粒的缺陷 （1）分子量大，拷贝数低 （2）筛选标志不理想构建质粒克隆载体的基本策略 1能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。2含多克隆位点3

7、含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr， Tcr基因等4 DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。5根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。质粒克隆载体的构建 1选择合适的出发质粒2正确获得构建质粒克隆载体的元件3组装合适的选择标记基因4选用合适的启动子5构建过程力求简单DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。蓝白斑筛选 Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝Ti质粒介导转化的过程 根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对

8、植物信号物质的感受根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化 vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中TA克隆的优点 不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 TA克隆注意事项 1. 要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2. PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3. 在PCR产物回收、纯

9、化过程中防止外来DNA污染。 真核生物的启动子：真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。1.RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。2.RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂；3.RNA聚合酶III转录tRNA和5S rRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称为下游启动子。目的基因的获得:直接分离法;PCR扩增;构建基因组文库法;构建cDNA文库法;化学合成法直接分离法: 限制酶酶切法(DNA分子已测序/目的基因已定位)基因组文库的构建(DNA未测序或未定位)：采用限制酶切割构建基因组文库筛选目的基因克隆基因文库构建的一般步骤：（1）染色体DNA大片

10、段的制备酶切法物理切割法（2）载体及基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接人工接头法（3）转导受体（4）筛选重组子cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别及克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。cDNA文库及基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。cDNA文库的特点优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建缺点：只及编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及及核糖体识别的序列构建cDNA文库的一般步骤：（1）总RNA（tota

11、l RNA）提取 （2）mRNA的分离纯化 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA的分离纯化 Column（柱） （3）cDNA的合成 cDNA第一链合成 降解mRNA模板 cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物衔接头合成法。）（4）cDNA及载体连接： （5） 噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成目的基因的分离：目的序列已知：一般采用PCR技

12、术或分子杂交技术分离克隆目的基因 目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法基因克隆的方法：一、目的基因的功能克隆二、 序列克隆法三、差别杂交法四、减法杂交技术五、mRNA差别显示技术功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆目的基因的功能

13、克隆：在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因1、根据特异蛋白分离目的基因分离、纯化目的蛋白测定特异的氨基酸顺序推测编码该蛋白的核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸探针从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因分离、纯化目的蛋白目的蛋白免疫动物，制备抗体从cDNA表达文库中筛选目的基因根据特异蛋白分离目的基因局限性：特异蛋白已鉴定并分离纯化某些基因产物，难以分离纯化非所有基因有蛋白质产物遗传密码的简并性2、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段及宿主细胞染色体DNA具有功能互补。筛选营养缺陷型互补基因序列克隆法：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因；采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离差别杂交法：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因；受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。基本过程：制备两种细胞群体的的mRNA提取物；以两种总mRNA或cDNA为