基因敲除小鼠优秀PPT.pptx

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1、小鼠基因敲除小鼠基因敲除相关问题简介CONTENTS基因敲除技术原理简介1基因敲除小鼠的基因型鉴定2基因敲除小鼠的饲养和繁殖3基因敲除技术原理简介基因敲除技术原理简介一、1.基因敲除技术基因敲除技术简介简介基因敲除小鼠技术(knock-out mouse technology)是指 通过基因工程的方法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物 学技术。传统的基因敲除方法有：传统的基因敲除方法有：插入突变法同源重组法RNA干扰(RNA interference,RNAi)法目前在同源重组法的基础上改良的基因敲除技术有：目前在同源重组法的基础上改良的基因敲除技术有：借助Cre-loxp系统的条件型基因敲除法

2、CRISPRCas9 技术（棕褐色（棕褐色AAAA）（白色）（白色）（AaAa）（AaAa）(AA)(AA)(AA)(AA)（AaAa）（AaAa）(aa)(aa)2.基因敲除技术步骤基因敲除技术步骤n2.1 胚胎干胚胎干细细胞的分胞的分别别培育培育n2.1.1 首先将首先将129小鼠胚胎分小鼠胚胎分别别培育，待胚胎四周培育，待胚胎四周渐渐渐渐形成形成ES细细胞集落。胞集落。n2.1.2 然后将然后将ES细细胞集落从培育的胚胎四周分胞集落从培育的胚胎四周分别别。进进行一段行一段时间时间的培育后将的培育后将ES细细胞集落吸出分散成胞集落吸出分散成单单个个的的细细胞，将胞，将这这些些单细单细胞分胞

3、分别别出来出来进进行常行常规规培育。培育。n2.1.3 最最终对终对分分别别培育的培育的ES细细胞胞进进行行鉴鉴定。（它定。（它应应当具有正常的二倍体核型及体内外分化当具有正常的二倍体核型及体内外分化实实力）力）n 鉴定方法把这种胚胎移植到雌性假孕鼠的子宫内，是否形成“嵌合体”胚胎。将ES细胞注入到同种或免疫缺陷性小鼠的皮下、睾丸或肾包囊，视察注入的细胞在宿主动物体内是否形成畸胎瘤。把受试细胞在体外进行随机自发的分化或诱导它们向不同胚层的细胞分化。一般的方法是去除饲养层细胞后，ES细胞聚集并形成类胚体。2.基因敲除技术步骤基因敲除技术步骤2.2 构建基因打靶构建基因打靶载载体体依据需敲除的基因

4、序列的特点依据需敲除的基因序列的特点设计设计的含有的含有2个个标记筛选标记筛选基因和特定基因同源臂序列的靶向基因和特定基因同源臂序列的靶向载载体。以敲除小鼠体。以敲除小鼠Fam172a基因基因为为例：例：靶向载体Fam172a同源序列靶基因2.基因敲除技术步骤基因敲除技术步骤n2.3 同源重同源重组组n2.3.1 将打靶将打靶载载体体导导入入129小鼠小鼠ES细细胞：目前常用的方法有胞：目前常用的方法有显显微注射法和微注射法和电电穿孔法。穿孔法。n2.3.2 同源重同源重组筛选组筛选：由于哺乳：由于哺乳动动物物细细胞中基因随机整合的机率要胞中基因随机整合的机率要远远大于同源重大于同源重组组，因

5、此，因此须须要利用要利用选择选择性性标记标记基因将基因将发发生同源重生同源重 组组的的细细胞胞筛选筛选出来，出来，目前常用的目前常用的筛选筛选方法有正方法有正负负双向双向选择选择法。法。正负双向选择法正负双向选择法neo:正向选择基因。具有新霉素(G418)抗性，其在发生随机组合和同源重组的细胞中都可以表达。HSV-tk：负向选择基因。在发生同源重组时别剪切掉，发生随机组合时被保留。tk基因可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转化为毒性核苷酸而杀死细胞。neoneo基因保留，基因保留，tktk基因被切除基因被切除对对G418G418和和GANCGANC都有抗性都有抗性对对G418G418有抗性，对有

6、抗性，对GANCGANC敏感敏感neoneo、tktk基因均被保留基因均被保留靶向载体靶向载体筛选出中靶筛选出中靶ESES2.基因敲除技术步骤基因敲除技术步骤n2.4 基因敲除小鼠的基因敲除小鼠的产产生生n2.4.1 将中靶的将中靶的ES细细胞注入到胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接种到新的培育皿中小鼠囊胚，接种到新的培育皿中进进行培育。行培育。n2.4.2 将正常将正常发发育含育含ES细细胞的囊胚移植入受体小鼠子胞的囊胚移植入受体小鼠子宫宫内内n2.4.3 嵌合体小鼠的嵌合体小鼠的鉴别鉴别：通：通过视过视察小鼠被毛的察小鼠被毛的颜颜色就可确定嵌合体小鼠。色就可确定嵌合体小鼠。n2.4.4 基因

7、敲除小鼠的制基因敲除小鼠的制备备：因：因为为在同源重在同源重组过组过程中，程中，ES细细胞的胞的2条染色体中一般只有条染色体中一般只有1条条进进行重行重组组，得到嵌，得到嵌合合 体小鼠后，体小鼠后，还还要要经过经过至少至少2代的繁育代的繁育过过程才能得到基因敲除小鼠。程才能得到基因敲除小鼠。基因敲除小鼠的基因型鉴定基因敲除小鼠的基因型鉴定二、1.利用利用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定和琼脂糖凝胶电泳鉴定n1.1 提取小鼠尾部DNA组织n1.2 PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型n 1.2.1 针对不同的Fam172a+/-，Fam172a-/-，WT设计不同的引物n 1.2.2 接受PCR仪进行

8、扩增：变性退火延长n 1.2.3 取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳n 1.2.4 依据凝胶成像仪中的条带鉴别基因型n可能的结果分析n Fam172a+/-出现两条带，Fam172a-/-只出现一条带，WT出现一条带，但Fam172a-/-和WT出现的位置不 同。2.利用WB测定组织中FAM172a蛋白水平n2.1 提取小鼠尾部组织蛋白n2.2 BCA法检测蛋白浓度n2.3 WB分析可能出现的结果：WT小鼠的条带灰度最高；Fam172a+/-条带的灰度值其次；Fam172a-/-无条带出现。基因敲除小鼠的饲养与繁殖基因敲除小鼠的饲养与繁殖三、1.饲养饲养n基因鼠属SPF级别动物（指机体内无特定

9、的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。一般指无传染病的健康动物，是目前国外运用最广泛的试验动物）它的来源，既可来自无菌动物繁育的后裔，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施的环境中，由SPF亲代动物抚育。n小鼠的房舍：最好选择能耐药液冲冼、隔音性强、无害虫栖息的地方，面积不宜过大。n垫料：应选择吸湿性好的（如锯木屑）n屏障温度：2025 n湿度：4070n照明时间：每天明暗循环12小时。n小鼠鼠笼、饲料、垫料和饮水均经高温高压消毒灭菌处理来预防微生物感染，小鼠自由摄食饮水，垫料每周定期更换3次。n幼鼠由母鼠母乳喂养，产后18-22天离乳，雌雄分笼。2.繁殖繁殖n留种：一般选

10、择同胎产仔10只以上、发育良好、匀整、无死亡，适当延长哺乳期至 18一22天,体重在18克 以上者留种。选出的同胎仔鼠将公母分开,放入消毒好的鼠笼内,每笼 3一 5只,切记做好标记,待第一次换窝时再进行复选,按1:1的 比例进行选留,辨别雌雄,淘汰多余仔鼠。如此重复两三次,效果更佳,一方面提高种鼠质量,另方面可防公母混杂,造成早配,影响繁殖率。n配种n严格限制动物房的灯光：早6到晚6保持照明，晚6到早6保持黑暗，这种光照对对小鼠的配种率极为重要。n尽量不要用嵌合体自交，应选用杂合体进行交配繁殖。n由于小鼠夜间活动力强,正常的交配发生于夜晚,故可选 3月龄以上、1年以内的母鼠于傍晚前放入公鼠笼内合笼。n育种n适当增加饲料养分成分，如葵花籽、麦芽等。一个月龄以上的育种公鼠不宜再添加软料和葵花籽，防止过肥，影响配种。n疾病预防：定期更换垫料，对鼠笼，饲料和饮水均需定期高温灭菌消毒。如育种过程中在同笼中发觉患有传染病鼠即全笼淘汰,甚至发觉有健康不良者或逃出笼外,其它鼠也最好淘汰,这种动物不宜用于繁殖。THANK421039122qq -