微生物学-实验7-土壤中细菌的分离纯化及计数资料优秀PPT.ppt

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1、试验七土壤中细菌的分别纯化及计数一、试验目的一、试验目的1 1、驾驭微生物分别纯化的方法及步骤。、驾驭微生物分别纯化的方法及步骤。2 2、驾驭平板菌落计数的原则和方法。、驾驭平板菌落计数的原则和方法。二、试验原理二、试验原理 平板菌落计数法依据微生物在固体培育基上所形成的平板菌落计数法依据微生物在固体培育基上所形成的菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释，落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取确定量的稀使其中的微生物充分分散成单个

2、细胞，再吸取确定量的稀释菌液接种到培育皿中，使其匀整分布于平皿中的培育基释菌液接种到培育皿中，使其匀整分布于平皿中的培育基内，经培育单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计内，经培育单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计换算出样品的含菌数。换算出样品的含菌数。环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起，为了环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起，为了获得纯种微生物，一般依据该微生物养分或培育特点，制获得纯种微生物，一般依据该微生物养分或培育特点，制作或设置一些选择性培育基，或选择性培育条件，再用稀作或设置一些选择性培育基，或选择性培育条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分别，纯化

3、该微释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分别，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。生物，直至得到该纯种菌株。1、牛肉膏蛋白、牛肉膏蛋白胨胨培育基、土壤培育基、土壤样样品、无菌品、无菌水水2、培育皿、玻璃、培育皿、玻璃试试管、胶管、胶头头滴管、涂布棒滴管、涂布棒三、三、试验试验材料材料四、试验步骤四、试验步骤1、细菌的分别纯化、细菌的分别纯化稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1）试管和培育皿编号在试管壁上依次标上）试管和培育皿编号在试管壁上依次标上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。在培育皿养皿的底部依次标上。在培育皿养皿的底部依次标上10-4-1、10-4-2、10-5-1 10-5-

4、2、10-6-1、10-6-2。（2）倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培育基溶化（微波炉加热）倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培育基溶化（微波炉加热3min-5min），待培育基冷却至不烫手时（约），待培育基冷却至不烫手时（约50），无菌倒入已编号的），无菌倒入已编号的培育皿中，室温凝固，备用。培育皿中，室温凝固，备用。（3）土壤稀释液制备。称取）土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶无菌水的三角瓶中，震荡中，震荡15-20min，静置约，静置约2030秒，即成秒，即成10-1的土壤悬液。用胶的土壤悬液。用胶头滴管移取头滴管移取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-2的离心管中，

5、震荡混匀，制成的离心管中，震荡混匀，制成10-2的菌悬液；从的菌悬液；从10-2管中取管中取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-3的离心管中，震荡的离心管中，震荡混匀，制成混匀，制成10-3的菌悬液；同法依次制备的菌悬液；同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。的菌悬液。（5）涂布平板无菌操作，用胶头滴管分别移取）涂布平板无菌操作，用胶头滴管分别移取10-4、10-5、10-6稀释菌液各稀释菌液各200 uL于相应编号的培育皿中，于相应编号的培育皿中，用无菌涂布棒在培育基表面轻轻涂布匀整。（留意：用无菌涂布棒在培育基表面轻轻涂布匀整。（留意：涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布，否则温度太

6、高导致涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布，否则温度太高导致菌体死亡）菌体死亡）（6）培育及计数。将涂布好的平皿放入）培育及计数。将涂布好的平皿放入37培育箱中培育箱中倒置培育。倒置培育。2、菌落计数、菌落计数 培育培育48 h后取出培育皿，算出同一稀释度的三个平后取出培育皿，算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。正置培育过程中，培育基中水分蒸发后，会在培育皿盖正置培育过程中，培育基中水分蒸发后，会在培育皿盖上冷凝形成水滴，一方面，水滴滴落至菌落表面，会将上冷凝形成水滴，一方面，水滴滴落至菌落表面，会将菌落打散，不易获得

7、单菌落；菌落打散，不易获得单菌落；另一方面，皿盖上形成水蒸气不利于结果的视察且简洁另一方面，皿盖上形成水蒸气不利于结果的视察且简洁造成培育基内水分蒸发。所以要进行倒置培育。造成培育基内水分蒸发。所以要进行倒置培育。平均菌落数平均菌落数某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数；某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数；CFUCFU菌落形成单位（菌落形成单位（colony-forming unitscolony-forming units，CFUCFU）；）；0.2mL0.2mL每个平皿加入的菌悬液体积；每个平皿加入的菌悬液体积；100mL10100mL10-1-1菌悬液的体积；菌悬液的体积；10g10g称取

8、的土壤重量。称取的土壤重量。计算公式：计算公式：菌落计数原则（六条）菌落计数原则（六条）1 1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应接受，而应平板有较大片状菌苔生长时，则不应接受，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很匀整时，则可将此一半的余的一半菌落分布又很匀整时，则可将此一半的菌落数乘菌落数乘2 2以代表全平板的菌落数，然后再计算该以代表全平板的菌落数，然后再计

9、算该稀释度的平均菌落数。稀释度的平均菌落数。2 2、首先选择平均菌落数在、首先选择平均菌落数在3030300300之间的，当只有之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见下表，例下表，例1 1）。）。3 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在、若有两个稀释度的平均菌落数均在3030300300之间，之间，则按两者菌落总数之比值来确定。若其比值小于则按两者菌落总数之比值来确定。若其比值小于2 2，应实行两者的平均数；若大于，应实行两者的平均数；若大于2

10、2，则取其中稀释，则取其中稀释度度(倍数倍数)较小的计算菌落总数（见下表，例较小的计算菌落总数（见下表，例2 2及例及例3 3）。）。4 4、若全部稀释度的平均菌落数均大于、若全部稀释度的平均菌落数均大于300300，则应按，则应按稀释度稀释度(倍数倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例下表，例4 4）。）。5 5、若全部稀释度的平均菌落数均小于、若全部稀释度的平均菌落数均小于3030，则应按，则应按稀释度稀释度(倍数倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例下表，例5 5）。）。6 6、若全部稀释度的平均菌落数均不在

11、、若全部稀释度的平均菌落数均不在3030300300之间，之间，则以最近则以最近300300或或3030的平均菌落数乘以稀释倍数（见的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例下表，例6 6）。）。计算计算菌落菌落总数总数方法举例（加样量为方法举例（加样量为1mL）例次例次不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释两个稀释度菌落数度菌落数之比之比菌落总数菌落总数（个（个mL）备注备注10-110-210-31365164201.64104采用采用科学计数科学计数法；取两位小法；取两位小数数2760295461.63.78 1042890271602.22.71 104无法计数无法计数1650

12、5135.13 105271152.70 102无法计数无法计数305123.05 104“无法计数无法计数”指因稀释倍数驾驭不好或其它缘由造成不能计数，指因稀释倍数驾驭不好或其它缘由造成不能计数，“0”指平板上无微生物菌落生长。指平板上无微生物菌落生长。五、作业五、作业细菌稀释度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu数/平板每g土壤的CFU数1、将每一个稀将每一个稀释释度的三个平板上的菌落数填入下表，并度的三个平板上的菌落数填入下表，并计计算算结结果果2、培育时为什么要将培育皿倒置培育？、培育时为什么要将培育皿倒置培育？其它微生物的分别纯化方法其它微生物的分别纯化方法（

13、一）、稀（一）、稀释释混合平板法混合平板法按无菌操作要求，用胶头滴管依次吸取10-6、10-5、10-4稀释液各200 uL，分别加入编号为10-6、10-5、10-4的培育皿中。分别向上述平皿中倒入15ml已溶化并且冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培育基，加盖后轻轻摇动培育皿，使培育基匀整分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板。将平板置于37烘箱中倒置培育。（二）、平板划（二）、平板划线线分分别别法法交叉划交叉划线线法法 连续连续划划线线法法划划线线分离分离图图1、接种环灼烧灭菌。、接种环灼烧灭菌。2、划线涂布。用接种环蘸取一环菌悬液，依据交叉划线法或连、划线涂布。用接种环蘸取一环菌悬液，依据

14、交叉划线法或连续划线法进行单菌落的分别。续划线法进行单菌落的分别。（1）交叉划线法）交叉划线法 先在平板培育基的一边作第一次平行划线先在平板培育基的一边作第一次平行划线34条，条，再转动培育皿约再转动培育皿约70角，并将接种环上的残菌烧掉，待冷却后通过角，并将接种环上的残菌烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作其次次平行划线，再用同法通过其次次平行划线第一次划线部分作其次次平行划线，再用同法通过其次次平行划线部分作第三次平行划线，共划部分作第三次平行划线，共划4-5次。划线完毕后，盖上皿盖，倒次。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温箱培育。置于温箱培育。（2）连续划线法）连续划线法 用接种环挑取样品在平板培育基上作连续划线，用接种环挑取样品在平板培育基上作连续划线，划线完毕后，盖上皿盖，倒置温箱培育。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温箱培育。