分子生物学研究方法.ppt

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1、分子生物学研究方法分子生物学研究方法 分子生物学研究之所以从分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。程技术的进步。DNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因操作基因操作基因的定点突变基因的定点突变PCR扩增等扩增等核心技术核心技术基因工程基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒是指在体外将核酸分子插入病毒

2、、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。稳定的繁殖和表达。外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程与性状表达的过程.基因工程技术区别于其它技术的基因工程技术区别于其它技术的根本特征根本特征：具有：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。本本章将在回顾重组章

3、将在回顾重组DNADNA技术史上主要事件的基础上，讨技术史上主要事件的基础上，讨论论DNADNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等三个环节。离与鉴定等三个环节。三大三大成就成就：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScell

4、smixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae19521952年年HersheyHershey和和ChaseChase证实噬菌体证实噬菌体D DNANA侵染细菌侵染细菌实验实验2.50年代揭示了年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复保留复制机制制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-

5、raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-Matthew Meselson&Frankl

6、in Stahl 1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathwayfollows the semiconservative pathway3.50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了中心法则中心法则和操纵子学说和操纵子学说,成成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和

7、表达。JacobandMonod但是，如果没有分离和富集单一但是，如果没有分离和富集单一DNADNA分子的技分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。化分析。两大两大技术保证：技术保证：1.DNA的体外切割和连接的体外切割和连接1962年年Arber发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了发现了DNA连接酶连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535Herbert Boyer,S

8、tanley Cohen1972年获得第年获得第一个重组一个重组DNA分子分子HerbertBoyer重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分分子子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子

9、中的碱基序列，根据碱基互补原则合成分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端（进行末端标末端（进行末端标记实验或用来进行记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于

10、切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团 到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。一步研究。1972-Paul Berg,1972-Paul Berg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsites phageDNAEcoRIcutsDNAintofragments

11、StickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外片段在体外不具备自我复制不具备自我复制能力，要想得到足够量能力，要想得到足够量和足够纯度的和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力，必须将它们连接到具备自主复制能力的的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。分子上（载体上），

12、并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆这就是基因克隆，或分子克隆。分子克隆的载体分子克隆的载体-具备自主复制具备自主复制能力的能力的DNA分子分子（vector），），如如病毒、噬菌体和病毒、噬菌体和质粒等小分子量质粒等小分子量复制子都可以作复制子都可以作为基因导入的载为基因导入的载体。体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯

13、化钙处理的大肠杆菌细胞同样等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒能够摄取质粒DNA。1973-Boyer,Cohen&Chang1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwi

14、thkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies表明：表明：（1 1）像）像pSC101pSC101这样的质粒这样的质粒DNADNA分子可以作分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源为基因克隆的载体，从而把外源DNADNA导入导入寄主细胞；寄主细胞；（2 2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；其功能表达；（3 3）质粒）质粒DNA-DNA-大肠杆菌细胞作为一种成大肠杆菌细胞

15、作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组功的基因克隆体系，有可能在重组DNADNA或或基因工程研究中发挥重要作用。基因工程研究中发挥重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。General

16、process of gene engineering1.1.从生物有机体基因组中，分从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的离出带有目的基因的DNADNA片段。片段。2.2.将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNADNA片段连接片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组体分子上，形成重组DNADNA分子。分子。3.3.将重组将重组DNADNA分子转移到适当的受体分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。殖。4.4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组得

17、了重组DNADNA分子的受体细胞，并筛选出分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。已经得到扩增的目的基因。5.5.将目的基因克隆到将目的基因克隆到表达载体表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。5.2.4基因扩增基因扩增 聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快技术，是一种在体外快速扩增特定基因或速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。的体外扩增法。DNA DNA 聚合酶聚合酶聚

18、合酶聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一条具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链为模板催化新链的合成链的合成需要具有需要具有 3-OH 的引物的引物具有具有 5 到到3 方向聚合的能力方向聚合的能力通常具有通常具有 3到到 5 外切酶活性外切酶活性PCR技术的原理并不复杂：技术的原理并不复杂：一一DNA体外扩增技术体外扩增技术1.PCR反应体系反应体系1)基本原理基本原理PCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由由变性变性-退火退火-延伸

19、三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：PCR Cycle-Step 1PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template -Denaturation Template DNA by Heat(95DNA by Heat(95o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作

20、准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCR Cycle-Step 2 PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(TTemperature is lowered(Tm m)and primers anneal to)and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至5

21、5左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；PCR Cycle-Step 3-PCR Cycle-Step 3-At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses primer DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are extension as complementary nucleotides are incorporatedincorporatedTarget SequenceTarget

22、 SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的与模板条新的与模板DNA链。链。End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies

23、 of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一个每完成一个循环需循环需24分钟，分钟，23小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因扩增放大因扩增放大几百万倍。几百万倍。Target AmplificationTarget AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16

24、Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconPCR仪5.2.5 核苷酸序列分析核苷酸序列分析1968年年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略Sanger在它的基础之上发展了快数测定在它的基础之上发展了快数测定DNA的末端终止法的末端终止法K Mullis完善了完善了PCR扩增扩增DNA方法方法5.2.5.1.5.2.5.1.SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)原理原

25、理：双脱氧（：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的新合成的DNA链中，但因链中，但因3端不具端不具OH基，基，DNA链合成至此中断。由于链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase所有4 dNTPs其中一种标记的ddNTPddTTP ddCTP ddGTP dd

26、ATP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA reaction每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处5反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示电泳结构通过显色指示.T C G A3C

27、CTTTAGCT5过程：过程：制备制备ss-DNA与引物退火与引物退火分为分为4个反应系统个反应系统每个系统中每个系统中加入加入dNTP（其中其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸DNA聚合酶定序反应聚合酶定序反应反应产物变性后电泳反应产物变性后电泳凝胶干燥凝胶干燥放放射自显影。射自显影。该法亦适合该法亦适合mRNA的序列分析。的序列分析。GC富集区常出现富集区常出现“隐影隐影”或或“停止停止”现象，如在反应中加入现象，如在反应中加入dITP（脱脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-7-脱氧鸟苷可解决脱氧鸟苷可解决GCGC

28、富集区的测序。富集区的测序。2.DNA定序的一般程序定序的一般程序酶法测序酶法测序(Sanger)化学测序法化学测序法(Maxam-Gilbert)待测待测DNA片段片段待测待测DNA片段片段次克隆次克隆5-末端标记末端标记筛选重组子筛选重组子链分离链分离限制酶切限制酶切模板增殖与纯化模板增殖与纯化纯化标记的纯化标记的ss-DNA与引物退火与引物退火定序反应定序反应定序反应定序反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳真空干燥真空干燥放射自显影放射自显影阅读序列和计算机录入阅读序列和计算机录入核苷酸序列的分析与比较核苷酸序列的分析与比较二二.DNA序列测定的自动化序列测定的自动化1.DNA测序步

29、骤与自动化测序步骤与自动化1）模板制备）模板制备可自动化可自动化2）定序反应）定序反应可自动化可自动化3）凝胶电泳）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化可自动化2.自动测序仪自动测序仪Conney等人于等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色红色引物引物+T反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黄色黄色引物引

30、物+G反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）绿色绿色引物引物+A反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）兰色兰色引物引物+C反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）优点优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点缺点：无法保留原始记录：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条

31、道上四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方序列分析自动化包括两个方面的内容，面的内容，一是指一是指“分析反应分析反应”的自动化，的自动化，另一方面则是指另一方面则是指“读片过程读片过程”的的自动化。自动化。5.2.5.3.5.2.5.3.杂交测序杂交测序自从自从70年代末期年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencing by hybridizati

32、on，SBH）一种。它利用一组已知序一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤杂交测序实质上包括两个主要的步骤首先是将待测定的靶首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算

33、出靶算出靶DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。如果将一种核苷酸顺序为如果将一种核苷酸顺序为5-AGCCTAGCTGAA-3的的12-mer的靶的靶DNA，与一组完全随机的与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种的种的8-mer探针群体中，仅有探针群体中，仅有5种会与靶种会与靶DNA形成完全互补形成完全互补的双链体分子。根据这的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶的靶DNA分分子

34、的核苷酸顺序子的核苷酸顺序。当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。仍然会与之形成不稳定的双链分子。上图是两条长度均为上图是两条长度均为17-mer的靶的靶DNA片段片段I和和II的杂交测序结果，两者仅在第的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基位碱基有不同，分别为有不同，分别为C和和T。靶靶DNA片段片段I可与可与18共共8段彼此相互重叠的段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成寡核苷酸形成完全的

35、双链分子，但不能与第完全的双链分子，但不能与第9段段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段段8-mer寡核苷酸之间各自具有寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶序列。靶DNA片段片段II的杂交结果表明，横跨其第的杂交结果表明，横跨其第8位碱基位碱基T的的6段段8-mer寡核苷酸的双链体，由于寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第和第8两段两段8-mer寡聚体形成寡聚体形成的具有末端的具有

36、末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段段8-mer寡核苷酸能寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第相比，它在第8位发生了由位发生了由C碱基到碱基到T碱碱基的基的变化。变化。（基因芯片测序（基因芯片测序)基因芯片测序流程基因芯片测序流程5.2.6.1.5.2.6.1.凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验 凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验（gel retardation assay），），又叫作又叫作DNA迁移率迁移率变动试验（变动试验（DNA mobility shift assay），），是用于体

37、外研究是用于体外研究DNA与蛋白与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提

38、取片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。5.2.6DNA与蛋白质相互作用研究与蛋白质相互作用研究凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的DNADNA由于与一种细胞蛋白质由于与一种细胞蛋白质B B结合，于是在凝胶电泳中移结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带A AC CB B放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影*凝胶电泳凝胶

39、电泳凝胶电泳凝胶电泳放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质与DNADNA结合结合结合结合*B BDNA-DNA-蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合物电泳迁移缓慢物电泳迁移缓慢物电泳迁移缓慢物电泳迁移缓慢滞后带表明滞后带表明滞后带表明滞后带表明DNADNA与蛋白与蛋白与蛋白与蛋白质结合质结合质结合质结合5.2.6.2.DNaseI足迹试验足迹试验 在在DNaseI足迹试验（足迹试验（DNA foot-printing assay）过程中，过程中，首先将待检测的双链

40、首先将待检测的双链DNA分子用分子用32P作末端标记，并用限制性内切作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的量的DNaseI（它可沿着靶它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化作随机单链切割）消化DNA分子，分子，并控制酶的用量使之达到平均每条并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断链只发生一次磷酸二酯键断裂。如果蛋白质提取物中不存在与裂。如果蛋白质提取物中不存在与

41、DNA结合的特异蛋白质，经结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、个、2个、个、3个核苷个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度片段梯度群体。群体。如果有一种蛋白质已经结合到如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的那么，它就将保护这一区段的DNA免受免受DNaseI的消化作用，因而的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝

42、胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹足迹”。3232p p15101510*1481014810*加入蛋白质加入蛋白质X X加入加入DNaseIDNaseI凝胶电泳放凝胶电泳放射自显影射自显影1 15 51010ABAB足迹足迹足迹足迹(a)a)(c)c)(b)b)DNaseI DNaseI DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验足迹实验足迹实验5.3 基因克隆的主要载体系统基因克隆的主要载体系统1.至少有一个复制起点，因而至

43、少至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。可在一种生物体中自主复制。2.至少应有一个克隆位点，以供外至少应有一个克隆位点，以供外源源DNA插入。插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组指示载体或重组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞4.安全性安全性大肠杆菌载体大肠杆菌载体pBR322结构图结构图载体特点载体特点基因工程载体是一类可供外源基因工程载体是一类可供外源DNADNA插入并携带重组插入并携带重组DNADNA分子进入适当分子进入适当宿主细胞自主复制的宿主细胞自主复制的DNADNA分子。分子。5.3.1 质粒质粒DNA及其分离

44、纯化及其分离纯化 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNADNA组成的复制子，组成的复制子，也有线性质粒也有线性质粒 的报道。的报道。质粒质粒DNADNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。应用质粒作为

45、基因克隆的载体分子，最重要的前提是要获得大量应用质粒作为基因克隆的载体分子，最重要的前提是要获得大量纯化的质粒纯化的质粒DNADNA分子。分子。E Ecolicoli的质粒种类的质粒种类 1)colE11)colE1因子（大肠杆菌素因子）因子（大肠杆菌素因子）多数不多数不能进行接合转移能进行接合转移DNADNA，属高拷贝松弛型。，属高拷贝松弛型。2)R2)R因子（抗药性因子）因子（抗药性因子）可接合转移可接合转移DNADNA，属低拷贝，属低拷贝 严紧型，严紧型，质粒较大，操作不便质粒较大，操作不便 3)F3)F因子（性因子）因子（性因子）关键步骤关键步骤：寄主细胞的裂解作用是分离质粒：寄主细胞

46、的裂解作用是分离质粒DNADNA实验操作。实验操作。通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促使大肠来促使大肠杆菌细胞裂解。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低杆菌细胞裂解。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒质粒DNADNA的回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时实验的回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，那么绝大部分的染色体操作又十分谨慎仔细，那么绝大部分的染色体DNADNA分子都将分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得

47、到高纯度的质粒细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒DNADNA。质粒载体质粒载体DNA的分离的分离关键关键：如何使质粒：如何使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA分开分开 原理原理：质粒：质粒DNA比染色体比染色体DNA小得多，在小得多，在DNA抽提过程中，抽提过程中，染色体染色体DNA断裂成小片段断裂成小片段(线状线状)，质粒，质粒DNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型变性法：变性法：变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ss环状病毒环状病毒DNARF型的分离型的分离,质粒质粒DNA的的氯霉素氯霉素扩增扩增使用并不广泛（菌

48、株和载体）使用并不广泛（菌株和载体）5.3.1.1.氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法实验表明，在细胞裂解及实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子分离的过程中，大分子量的细菌染色体量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒保持完整的状态。这种差别对质粒DNA的纯化是十分有的纯化是十分有用的。用的。上清液上清液加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液室温下超室温下超速离心速离心(45,000rpm）16小时小时穿

49、孔取出穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透缓冲液透析除去残余析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥5.3.1.2.5.3.1.2.碱变性法碱变性法 通过氯化铯通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒量的质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人

50、员的身心健康。造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。实验观察发现，在实验观察发现，在pH值介于值介于12.012.5的条件下加热的条件下加热DNA溶液，溶液，使染色体使染色体DNA变为单链，而质粒变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。随机断裂产生的线性染色体随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚