NBt 实验方法.ppt

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1、NBt 实验方法 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 第一节第一节 免疫细胞的分类与分离免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏免疫细胞的特征免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子 免疫细胞的起源与分化免疫细胞的起源与分化 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞免疫细胞的分离技术免疫细胞的分离技术1、密度梯

2、度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法密度梯度离心法密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞沉降速度=2r2（QQ0）9 x gQ=颗粒比重 Q0=溶质比重 r=颗粒半径=形状因子=颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数=粘稠度 g=相对离心力 人类血液有形成分的平均密度与直径人类血液有形成分的平均密度与直径 密度 直径（）血小板 1.041.06 淋巴细胞 1.061.08 810粒细胞 1.081.09 13红细胞 1.091.10 7.5黏附分离法黏附分离法尼龙毛法贴壁法亲和板法吸附柱法荧光激活分离法（荧光激活分离法（FAC

3、S）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏转板喷嘴细胞收集管流体护套样品流式细胞仪流式细胞仪磁性分离法磁性分离法磁铁吸引法磁式细胞分类术法MACS(阳性选择法）阳性选择法）NSMACS(阴性选择法）阴性选择法）NS其他分离法其他分离法花环沉降法细胞活化克隆法MHC分子四聚体法抗原肽抗原肽-MHC分子四聚体技术分子四聚体技术T细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法细胞复苏的原理与方法细胞冻存罐细胞冻存罐 第二节第二节 免疫细胞膜分子的检测免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法免疫细胞膜分子检测的原理与类型免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗

4、体识别抗原2、以配体识别受体免疫细胞膜分子的主要检测方法免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验SmIg的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法SmIg的酶免疫检测法的酶免疫检测法补体依赖的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体E-花环花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞EA-花环花环EAC-花环花环 第三节第三节 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验1、淋巴细胞转化试验2、混合淋巴细胞培养转化、增殖试验转化、增殖试验放射性测

5、定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意1、T细胞介导的细胞毒试验2、NK活性测定3、ADCC作用测定细胞毒检测试验细胞毒检测试验放射性测定细细胞胞毒毒试试验验原原理理示示意意靶细胞效应细胞分离上清1、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验抗体形成试验抗体形成试验直接溶血空斑试验直接溶血空斑试验间接溶血空斑试验间接溶血空斑试验SPA-SRBC溶血空斑试验溶血空斑试验1、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验吞噬百分率 =吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数 =吞噬细胞吞噬的总

6、颗粒数计数的吞噬细胞数NBT还原试验还原试验原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）NBT还原试验还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞 7.5-15%第四节第四节 免疫细胞凋亡测定免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡的概念与原理细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点 细胞凋亡细胞凋亡（apoptosisapoptosis）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。细胞凋亡的过

7、程细胞凋亡的过程凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡基因启动编码程序性死亡蛋白细胞结构解体细胞凋亡 细胞凋亡机制细胞凋亡机制 细胞凋亡的特点细胞凋亡的特点1、细胞皱缩2、染色质边集3、凋亡小体出现 细胞凋亡细胞凋亡 细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法1、形态观察法2、生化检测法3、流式细胞仪检测法形态观察法形态观察法普通光镜检测HE染色 甲基绿-派诺宁染色荧光显微镜检测溴化丙锭染色透射电镜检测典型形态改变生化检测法生化检测法凝胶电泳法原位末端标记法二苯胺分光光度法凝胶电泳法凝胶电泳法原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder）方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladde

8、r现象原位末端标记法（原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用 下结合DNA断片的3末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检二苯胺分光光度法二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解细胞 13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定凋亡百分率 =上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值流式细胞仪法流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可 显示凋亡细胞的特征性亚二倍体 峰。并可经计算分析得出凋亡百 分率。方法：制备细胞悬液 PI染色 FACS检测 本章小结本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术2、细胞的冻存与复苏3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法4、免疫细胞功能测定的原理与方法