DNA的生物合成和损伤修复.ppt

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1、目目 录录DNA的生物合成和损伤修复 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望DNA生物合成生物合成DNA复制复制（DNA指导的指导的DNA合成合成）逆转录逆转录 (逆转录病毒逆转录病毒RNA指导的指导的DNA合成合成)校正复制中可能出现的错误，并修复受到损校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的伤的DNA细胞中酶促修复系统细胞中酶促修复系统自然界自然界DNADNA重组和基因转移的基本方式重组和基因转移的基本方式基因组复制的主要特点基因组复制的主要特点Th

2、e General features of Genome Replication 第一节第一节一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和的总和 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为称为称为称为基因组（基因组（基因组（基因组（genomegenome）。在真核生物体中，基因组。在真核生物体中，基因组。在真核生物体中，基因组。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体是指一套完整单倍体是指一套完整单倍体是指一套完整单倍体DNADNA（染色体（

3、染色体（染色体（染色体DNADNA）和线粒体）和线粒体）和线粒体）和线粒体DNADNA的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。序列。序列。序列。二、基因组二、基因组DNA复制具备一些共同特征复制具备一些共同特征（一）基因组（一）基因组（一）基因组（一）基因组DNADNA都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点（二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程

4、中形成复制泡和复制叉（三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子 （四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 （五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了DNADNA空间结构对空间结构对空间结构对空间结构对DNADNA 新链合新链合新链合新链合 成的制约成的制约成的制约成的制约 （六）复制起点由多个短重复序列组成（六）复制起点由多个短重复序列组

5、成（六）复制起点由多个短重复序列组成（六）复制起点由多个短重复序列组成 （七）（七）（七）（七）DNADNA复制必须有引物复制必须有引物复制必须有引物复制必须有引物 复制起点（复制起点（origin）：指：指DNA复制所必需的一段复制所必需的一段特殊的特殊的DNA序列。序列。（一）基因组（一）基因组DNA都具有固定的复制起始点都具有固定的复制起始点双螺旋双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构复制时，复制区生长点的结构呈呈Y形或叉形，称之为形或叉形，称之为复制叉。复制叉。（二）复制过程中形成复制泡和复制叉（二）复制过程中形成复制泡和复制叉目目 录录从一个从一个DNA复制起点起始的复制起点起始的D

6、NA复制区域，复制区域，它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。复制子（复制子（replicon）（三）复制的基本单位称为复制子（三）复制的基本单位称为复制子 （四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（四）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递（1）全保留式（全保留式（conservative），即恢复原来的，即恢复原来的DNA双螺旋，并产生一个新的子代双螺旋，并产生一个新的子代DNA双双螺旋；螺旋；（2）半保留式（半保留式（semiconservative），即新老搭，即新老搭配，由一条新合成的配，由一条新合成的DNA链和一条复制模链和一条复制模板

7、链配对产生子代双螺旋板链配对产生子代双螺旋DNA；（3）散布式（散布式（dispersive），），即复制模板链被分即复制模板链被分成许多小片段，散布于子代成许多小片段，散布于子代DNA中。中。两条新合成的两条新合成的DNADNA链和两条原来的复制模板链和两条原来的复制模板链之间的结合方式可能性：链之间的结合方式可能性：密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制方式方式含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果前导链（前导链（leading strand

8、）:DNA复制时，一条链复制时，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合成的新链。成的新链。后随链（后随链（lagging strand）:另一条链的合成方向另一条链的合成方向与复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若与复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链中的小片段称为中的小片段称为冈崎片段（冈崎片段（Okazaki fragments)。（五）半不连续复制克服了（五）半不连续复制克服了DNA空间结构空间结构 对对DNA新链合成的制约

9、新链合成的制约前导链连续复制而后随链不连续复制，即前导链连续复制而后随链不连续复制，即DNA半半不连续不连续复制复制。复制起点的一般特征复制起点的一般特征:由多个独特的短重复序列组成。由多个独特的短重复序列组成。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。一般富含一般富含AT，利于双螺旋，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链解旋，以产生单链DNA复制模板。复制模板。（六）复制起点由多个短重复序列组成（六）复制起点由多个短重复序列组成E.coli 复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTAT

10、TAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 同向重复序列同向重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 酵母复制起点为酵母复制起点为自主复制序列（自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：酵母染色体含有多个复制起点。酵母染色体含有多个复制起点。元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：结合一个特异的蛋白质

11、：结合一个特异的蛋白质复合物复合物复制起点识别复合物复制起点识别复合物(ORC)。3个序列个序列(B1、B2和和B3)可以增加复制起点的效率，其可以增加复制起点的效率，其中中B2的的9个碱基与上述个碱基与上述ARS共有序列相同。共有序列相同。酵母复制起始点酵母复制起始点DNA聚聚合合酶酶不不能能从从游游离离的的核核苷苷酸酸开开始始合合成成DNA链链，必必须须由由引引物物（primer）提提供供自自由由的的3-OH末端末端，通过加入核苷酸使之不断延伸。，通过加入核苷酸使之不断延伸。所所有有细细胞胞和和多多数数病病毒毒的的DNA复复制制，首首先先利利用用模模板板合合成成一一段段RNA引引物物，这这

12、一一过过程程为为引引发发（priming）。RNA引引物物5 端端的的第第一一个个核核苷苷酸酸通通常常是是pppA（个别为（个别为pppG）。）。（七）（七）DNA复制必须有引物复制必须有引物1.1.多数多数DNA复制使用复制使用RNA引物引物174等噬菌体等噬菌体以双链以双链环形环形DNA的一条链上产的一条链上产生切口处的生切口处的3-OH为引物；为引物；腺病毒及某些线性腺病毒及某些线性DNA病毒病毒以结合于病毒以结合于病毒DNA的的5 端磷酸基团的末端蛋白上的端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的的3-OH为引物开始复制。为引物开始复制。2.个别个别DNA复制以复制以DNA或核苷酸为引物或核苷

13、酸为引物三、不同基因组三、不同基因组DNA通过不同的模式通过不同的模式进行复制进行复制（一）真核生物基因组（一）真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录复制过程涉及反转录（二）基因组单链（二）基因组单链DNA通过复制中间体完成复制通过复制中间体完成复制 （三）有的基因组（三）有的基因组DNA通过通过RNA中间体进行复制中间体进行复制 （四）双链环状（四）双链环状DNA也有不同的复制方式也有不同的复制方式 四、不同基因组四、不同基因组RNA通过不同的通过不同的模式进行复制模式进行复制（一）基因组双链一）基因组双链RNA复制过程是双链复制复制过程是双链复制（二）基因组单链正链（二）基因组单链正链RN

14、A以负链为模板进以负链为模板进 行复制行复制（三）基因组单链负链（三）基因组单链负链RNA以正链以正链RNA为模为模板进行复制板进行复制（四）反转录病毒的基因组（四）反转录病毒的基因组RNA通过通过DNA中中间体进行复制间体进行复制 DNA复制过程复制过程 Process of DNA Replication第二节第二节一、原核生物一、原核生物DNA复制体现了复制的基本复制体现了复制的基本过程和特征过程和特征（一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物（一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物 1.E.coli复制起始需要复制起始需要6种蛋白质因子种蛋白质因子 2.解螺旋酶激活引发酶形成引发体解

15、螺旋酶激活引发酶形成引发体 3.解旋还需要促旋酶和解旋还需要促旋酶和SSB DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶，即拓扑异构酶）、）、单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand binding protein,SSB)DNA复制需要复制需要6种蛋白因子：种蛋白因子：E.coli DNA复制起始复制起始 结结合合oriC的的4个个9bp反反向向重重复复序序列列形形成成复复制制起起始复合物始复合物。作作用用于于oriC的的3个个13bp正正向向重重复复序序列列，DNA在在这这3个个位位点点解解链链，形形成成开开放放型型复复合合物物（open

16、 complex）。DnaA蛋白蛋白53 解旋酶作用产生两条复制模板链解旋酶作用产生两条复制模板链激活引发酶激活引发酶DnaG蛋白蛋白DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体蛋白与引发酶结合，形成引发体DnaB蛋白蛋白使一条使一条DNA链围绕着另一条旋转，消除解链围绕着另一条旋转，消除解旋产生的张力。旋产生的张力。促旋酶促旋酶SSBSSB蛋白蛋白HUHU蛋白蛋白稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA构象，有助于解旋。构象，有助于解旋。DNA结合蛋白，对复制起促进作用。结合蛋白，对复制起促进作用。HU蛋白能够使蛋白能够使DNA发生折叠。发生折叠。E.coli 中中DnaB结合引发酶结合引发酶DnaG

17、，催化合成，催化合成RNA引物，其序列始于引物，其序列始于pppAG，模板链序列，模板链序列3-GTC-5，引物长度一般，引物长度一般1112个碱基。个碱基。（二）引发酶合成（二）引发酶合成RNA引物引物负责切除负责切除RNA引物。引物。（三）复制时聚合酶（三）复制时聚合酶催化催化DNA合成而合成而 聚合酶聚合酶切除引物切除引物DNA聚合酶聚合酶可利用损伤尚未修复的可利用损伤尚未修复的DNA链链作为模板合成作为模板合成DNA，但不能修，但不能修复损伤。复损伤。负责合成负责合成DNA。DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶TLS1 Rev 1TLS，体，体细细胞高胞高变变1Pol 相相对对准确的准

18、确的TLS（穿越（穿越环环丁丁烷烷二聚体）二聚体）1Pol TLS1Pol 体体细细胞高胞高变变（somatic hypermutation）1Pol 减数分裂相关的减数分裂相关的DNA损伤损伤修复修复1Pol TLS1Pol DNA交交联损伤联损伤修复修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线线粒体粒体DNA复制和复制和损伤损伤修复修复3Pol 碱基切除修复碱基切除修复1Pol 合成引物合成引物4Pol 功能功能亚亚基数目基数目真核生物真核生物TLS

19、（translesion synthesis）3Pol (UmuC,UmuD)DNA损伤损伤修复，穿越修复，穿越损伤损伤合成（合成（TLS）1Pol (Din B)染色体染色体DNA复制复制9Pol 全全酶酶染色体染色体DNA复制复制3Pol 核心核心酶酶DNA损伤损伤修复修复1Pol 去除去除RNA引物，引物，DNA损伤损伤修复修复1Pol 功能功能亚亚基数目基数目原核生物（原核生物（E.coli）原核、真核细胞原核、真核细胞DNADNA聚合酶的类型和功能聚合酶的类型和功能目目 录录个核心酶个核心酶1个个-复合物（复合物（、6种亚种亚基）基）可滑动的可滑动的DNA夹子夹子（含（含1对对-亚基

20、）亚基）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：亚基亚基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有具有35 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用核心酶由核心酶由、和和 亚基组成：亚基组成：2个个-亚亚基基分分别别和和1个个核核心心酶酶相相互互作作用用，其其柔柔性性连连接接区区可可以以确确保保在在复复制制叉叉1个个全全酶酶分分子子的的2个个核核心心酶酶能能够够相相对对独独立立运运动动，分分别别负负责责合合成成前导链和后随链。前导链和后随链。功功能能：-复复合合物物是是DN

21、A夹夹子子加加载载蛋蛋白白，负负责责将将可可沿沿DNA链链滑滑动动的的一一对对-亚亚基基（DNA夹夹子子）加加载载于于DNA，使使DNA聚聚合合酶酶具具有有持续合成能力。持续合成能力。-复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成：、在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链3 5 3 5 3 5 3 5 前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)解链方向解链方向冈崎片段冈崎片段3 5 53 外切酶：外切酶：去除去除RNA引物引物35 外切酶：外切酶：起校正作用起校正作用DNA聚合酶活性：聚合酶活性：填补两个冈崎片段之间的缺口填补两个

22、冈崎片段之间的缺口DNA聚合酶聚合酶有有3个酶促活性结构域个酶促活性结构域:323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段：大片段：Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Tus蛋蛋白白具具有有反反解解旋旋酶酶（contra-helicase）活活性性，识识别别并并结结合合ter序序列列中中共共有有序序列列，阻阻止止Dna B蛋白的解旋作用，从而蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进抑制复制叉前进。Tus蛋蛋白白除除了了使使复复制制叉叉停停止止运运

23、动动以以外外，还还可可能造成能造成复制体解体复制体解体。(四四)Tus蛋白识别复制终点使复制终止蛋白识别复制终点使复制终止在在复复制制叉叉汇汇合合点点两两侧侧约约100kb处处各各有有一一个个终止区（终止区（ter D/A和和ter C/B）。）。当当oriC处处于于半半甲甲基基化化状状态态时时，SeqA蛋蛋白白迅迅速速结结合合半半甲甲基基化化的的GATC，阻阻止止Dam甲甲基基化化酶酶与与之之结结合合，使使复复制制起起点点不不能能被被完完全全甲甲基基化化，同同时时阻阻止止DnaA蛋蛋白结合白结合oriC。oriC的的GATC被被完完全全甲甲基基化化，DnaA蛋蛋白白就就能能与与之之结合结合，

24、开始新的一轮复制，开始新的一轮复制。(五五)DNA甲基化保证复制起点在每个复制周甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用期中仅起一次作用E.coli复复制制起起点点oriC含含有有11个个拷拷贝贝GATC，这这一一回回文序列中的文序列中的A是是Dam甲基化酶的靶位点甲基化酶的靶位点。在复制过程中，在复制过程中，DNA每复制每复制10bp，复制叉前方的，复制叉前方的模板模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正正超螺旋超螺旋。拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合合DNA分子上的磷酸基团，分子上的磷酸基团，切

25、断磷酸二酯键切断磷酸二酯键。(六六)DNA复制需要两类复制需要两类DNA拓扑异构酶拓扑异构酶消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。维持维持E.coli、噬菌体和质粒、噬菌体和质粒DNA复制起始模板复制起始模板DNA负超螺旋状态。负超螺旋状态。环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环。解连环。DNA拓扑异构酶功能：拓扑异构酶功能：E.coIi的的Topo只只作作用用于于负负超超螺螺旋旋DNA，消除负超螺旋。消除负超螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能：的功能：E.coli的的Topo将将前方产生的正超前方产生的正超

26、螺旋转变为负超螺旋转变为负超螺旋。螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能的功能E.coli 的的Topo功能功能是将复制产生的两个是将复制产生的两个子染色体从连环体中子染色体从连环体中分离出来，催化连环分离出来，催化连环和去连环过程和去连环过程。真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚聚合酶合酶/转换；转换；切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。二、真核生物二、真核生物DNA复制和原核生物相复制和原核生物相似但更为复

27、杂似但更为复杂真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异：(一一)常见的真核细胞常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种A家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol同源，包括同源，包括Pol 和和Pol B家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源，包括同源，包括Pol 、和和C家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源，仅在真菌中发现同源，仅在真菌中发现X家家族族与与大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶并并无无同同源源性性，却却与与末末端转移酶同源，成员包括端转移酶同源，成员包括Pol 、Y家家族族（UmuC/DinB超超家家族族），近近年年发发现现一一个个特特殊殊的的真真核核及及

28、原原核核DNA聚聚合合酶酶家家族族，成成员员包包括括Pol 、和和Rev1Pol 负责合成引物负责合成引物Pol 负责负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复修复Pol 的功能与的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）相似（其确切功能尚待定）Pol 可能和碱基切除修复有关可能和碱基切除修复有关Pol 负责线粒体负责线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复常见的真核常见的真核DNA聚合酶有聚合酶有5种：种：拓扑异构拓扑异构酶酶，去除，去除负负超螺旋（使解旋超螺旋（使解旋酶酶容易解旋），去除复制叉前方容易解旋），去除复制叉前方产产生的正生的正超螺旋超螺旋Tol和和

29、TolDNA双螺旋解双螺旋解链链，参与，参与组组装引装引发发体体DNA解旋解旋酶酶连连接接冈冈崎片段崎片段DNA连连接接酶酶核酸核酸酶酶，切除，切除RNA引物引物RNAse H核酸核酸酶酶，切除，切除RNA引物引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol /合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引引发发酶酶有依有依赖赖DNA的的ATPase活性，活性，结结合于引物合于引物-模板模板链链，激活，激活DNA聚合聚合酶酶，促使促使PCNA结结合于引物合于引物-模板模板链链RFC激活激活DNA聚合聚合酶酶和和RFC的的ATPase活性活性PCNA单链单

30、链DNA结结合蛋白，激活合蛋白，激活DNA聚合聚合酶酶，使解旋，使解旋酶酶容易容易结结合合DNARPA功功 能能蛋白蛋白质质真核真核DNA复制叉主要蛋白质的功能复制叉主要蛋白质的功能(二二)真核真核DNADNA复制叉主要蛋白质的类型和功能复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似与原核基本相似DNA聚合酶聚合酶（Pol ）分子含有）分子含有4个亚基：个亚基：1.DNA聚合酶聚合酶/引发酶复合物合成引发酶复合物合成RNA-DNA引物引物p180：催化亚基：催化亚基p48：具有引发酶活性：具有引发酶活性p58：p48的稳定性和活性所必需的的稳定性和活性所必需的p70：与组装引发体有关：与组装引发体

31、有关功能：功能：合成合成RNA引物引物反应过程反应过程：调节：调节：磷酸化的调节作用磷酸化的调节作用Pol /引发酶复合物引发酶复合物首先，合成首先，合成RNA引物；引物；其次，利用其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成）短序列，形成RNA-DNA引物；引物；最后，最后，Pol /引发酶脱离模板链引发酶脱离模板链DNA，发生，发生DNA聚合聚合酶转换（酶转换（switch）。）。结构：结构：p70、p34和和p11组成异源三聚体组成异源三聚体功能：功能：2.RPA的功能与的功能与E.coli的的SS

32、B相似相似复制蛋白复制蛋白A（replication protein A，RPA）结合单链结合单链DNA促使双螺旋促使双螺旋DNA解旋解旋激活激活Pol /引发酶活性引发酶活性为为Pol 依赖复制因子依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成）合成DNA所必需所必需RPA三聚体与三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需抗原结合，组装引发体复合物所必需RPA参与参与DNA重组和修复重组和修复p140 结合结合PCNAp40、p37和和p36组成稳定的核心复合物，具有组成稳定的核心复合物，具有依赖依赖DNA的的ATPase活性活性p38可能在可能在p14

33、0和核心复合物之间起连接作用和核心复合物之间起连接作用3.RFC与与E.coli DNA聚合酶聚合酶的的-复合物功能相似复合物功能相似复制因子复制因子C（replication factor C，RFC）结构：结构：有有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基个亚基促使可滑动的促使可滑动的DNA夹子夹子PCNA结合于引物结合于引物-模板链，是模板链，是Pol 在模板在模板DNA链上组装并形成具链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。有持续合成能力全酶所必需的。RFC的功能：的功能：PCNA是是Pol 的进行性因子，使的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。获得持续合成能力。PC

34、NA是协调是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。调控的核心因子。PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。水平是检测细胞增殖的重要指标。PCNA能激活能激活Pol 。4.PCNA是可滑动的是可滑动的DNA夹子夹子增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）结构：结构：功能：功能：同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNADNA夹子。夹子。p125：催化亚基，具有：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35 核酸核酸外切酶活性，其外切酶活性

35、，其N端区与端区与PCNA相互作用相互作用p50：辅助：辅助PCNA激活激活p1255.DNA聚合酶聚合酶 合成前导链和后随链合成前导链和后随链结构：结构：Pol 分子是异源二聚体（分子是异源二聚体（p125和和p50）功能：功能：Pol 合成前导链和后随链合成前导链和后随链DNA聚合酶聚合酶 FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶和）具有核酸内切酶和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。FEN1参与去除冈崎片段参与去除冈崎片段5 端的端的RNA引物。引物。6.FEN1和和RNAse H切除切除RNA引物引物RNAse H是是核核酸酸内内切切酶酶，参参与与冈冈崎崎片片

36、段段成成熟熟时时切切除除5 端端RNA引引物物，底底物物RNA连连接接在在DNA链链的的5 端端，切切割割后后在在DNA链链的的5 端端残残留留一一个个核核糖核苷酸，这个核苷酸再被糖核苷酸，这个核苷酸再被FEN1切除。切除。DNA复制需要复制需要DNA解旋酶打开解旋酶打开DNA双螺双螺旋，使复制模板链得以暴露旋，使复制模板链得以暴露。7.DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板8.真核复制叉有真核复制叉有1个个Pol 和和2个个Pol 复合物复合物真核真核DNA复制叉模型复制叉模型Pol /引发酶引发酶合成合成RNA-DNA引物引物Pol 合成前导链和后随链合成前导链

37、和后随链RFC 识别引物识别引物iDNA的的3 端并驱除端并驱除Pol /引发酶引发酶PCNA 结合结合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段切除冈崎片段5 端的端的RNA引物引物真核生物复制过程中酶及功能真核生物复制过程中酶及功能Pol （或（或Pol ）填补冈崎片段之间的空隙填补冈崎片段之间的空隙DNA连接酶连接酶 封口封口RPA 稳定解旋后的单链稳定解旋后的单链DNA解旋酶解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力释放复制叉前进时产生的扭曲应力(三三)引发和延伸发生引发和延伸发生DNA聚合

38、酶聚合酶/转换转换识别染色体识别染色体DNA复制起点和复制起点和DNA局部解旋后，局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做叫做引发体组装引发体组装。引发体组装引发体组装包括包括DNA解旋酶解旋酶与与Pol /引发酶引发酶相相互作用。互作用。1.解旋酶与解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体引发酶相互作用组装引发体前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生发生DNA聚合酶聚合酶/转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续合成能力持续合成能力DNA聚合酶聚合酶/

39、转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC2.DNA聚合酶聚合酶/转换转换真核真核DNA聚聚合酶转换和合酶转换和后随链合成后随链合成首首先先RNAse H利利用用核核酸酸内内切切酶酶活活性性切切割割连连接接在在冈冈崎崎片片段段5 端端的的RNA片片段段，在在RNA-DNA引引物物连连接接点点旁旁留留下下1个核糖核苷酸；个核糖核苷酸；然然后后FEN1利利用用53 核核酸酸外外切切酶酶活活性性切切除除这这最最后后一个核糖核苷酸。一个核糖核苷酸。(四四)切除切除RNA引物有两种机制引物有两种机制解解旋旋酶酶Dna2具具有有依依赖赖DNA的的ATPase和和35 解解旋旋酶酶活活性性，其其解解旋旋作作用用

40、可可以以使使前前一一个个冈冈崎崎片片段段的的5 端端引引物物形成形成“盖子盖子”结构，再由结构，再由FEN1的内切酶活性切除引物。的内切酶活性切除引物。依赖依赖RNAse H/FEN1切除方式：切除方式：依赖依赖Dna2/FEN1切除方式：切除方式：切除切除RNA引物的两种机制引物的两种机制RNAse H/FEN1Dna2/FEN1真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只能复制一次。(五五)真核染色体在每个细胞周期中只能复制真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次一次1.前复制复合物在前复制复合物在G1期形成而在期形成而

41、在S期被激活期被激活真核细胞真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制的起始分两步进行，即复复制基因的选择制基因的选择和和复制起点的激活。复制起点的激活。复制基因（复制基因（replicator）是指是指DNA复制起始复制起始所所必需的必需的全部全部DNA序列序列。复制基因的选择复制基因的选择出现于出现于G1期期，基因组的每个复，基因组的每个复制基因位点均组装制基因位点均组装前复制复合物（前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。复制起点的激活复制起点的激活出现于细胞进入出现于细胞进入S期期以后，这一以后，这一阶段将阶段将激活激活pre-RC，募集若干复制基

42、因结合蛋，募集若干复制基因结合蛋白和白和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。在原核细胞中，复制基因的识别与在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解解旋、募集旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。每个细胞周期中仅复制一次。ORC至少募集两种解旋酶加载至少募集两种解旋酶加载蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。复制起点识别复合物（复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。识别并结合复制基因。三种蛋白

43、质一起募集真核细胞三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶解旋酶Mcm2-7。前复制复合物（前复制复合物（pre-RC）的形成）的形成pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子并起始复制，复制因子包括并起始复制，复制因子包括3种种DNA聚合酶。聚合酶。DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和和Pol 结合，然后是结合，然后是Pol /引发酶。引发酶。在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷酸化，从而被激活。酸化，从而被激活。pre-RC的激活的激活和组装真核和组装真核DNA复制叉复

44、制叉（1）激活）激活pre-RC，以起始，以起始DNA复制；复制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。2.Cdk控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真真核核细细胞胞通通过过依依赖赖细细胞胞周周期期蛋蛋白白的的蛋蛋白白激激酶酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严严格格控控制制pre-RC的形成和激活。的形成和激活。Cdk功能：功能：在在每每个个细细胞胞周周期期过过程程中中，仅仅有有一一次次机机会会形形成成pre-RC，也仅有一次机会激活，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在在被被激激活活后后即即解解体体，所所暴暴露露的的复复制制基基因因可可形

45、形成成新新的的pre-RC并并迅迅速速结结合合ORC。但但在在S、G2和和M期期，高高活活性性的的Cdk抑抑制制pre-RC的的其其他他组组分分结结合合ORC。只只有有当当染染色色体体分分离离和和细细胞胞分分裂裂完完成成时时，Cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。(六六)端粒酶确保染色体末端复制完整端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链前导链产生产生完整完整的子染色单体。的子染色单体。后随链后随链3 3 端留下端留下缩短的缩短的未复制的未复制的ssDNA区区。端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重复序列组成。的重复序列组成。人的端粒重复序列为人的端粒

46、重复序列为5-TTAGGG-3。这些重复序列多为双链，但每个染色体的这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比端比5 端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。决染色体末端复制问题。端粒酶（端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（是一种核糖核蛋白（RNP），），由由RNA和蛋白质组成。和蛋白质组成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以染色体的3 端端ssDNA（后随链模板）（后随链模板）为引物，将端粒序列添加为引物，将端粒序列添加于染色体的于染色体的3 端。这些新合成的端。这些新合成的DNA为单

47、链为单链。DNA聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成DNADNA解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解开解开DNA双螺旋，暴露双螺旋，暴露复制模板链复制模板链引发酶引发酶：引发，即合成引发，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物3-OH开始延伸开始延伸DNA连接酶：连接酶：连结冈崎片段连结冈崎片段其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子小结：小结：DNA复制需要多种酶参与复制需要多种酶参与如：起稳定作用的单链如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白结合蛋白（SSB）和改变）和改变DNA超螺旋状态的超螺旋状态的DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase）等）等DNA聚合酶的聚合酶的合成前误差控制

48、合成前误差控制(presynthetic error control)和和校正控制校正控制(proofreading control)功能。功能。细胞修复系统细胞修复系统是是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制高度忠实性的重要因素。复制起始利用引物复制起始利用引物也是确保也是确保DNA复制忠实性的重要复制忠实性的重要机制之一。机制之一。DNA复制具有高度忠实性复制具有高度忠实性 DNA复制是双向复制复制是双向复制 一个起点，两个复制叉，双向复制。一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。一个起点，一个复制叉，

49、单向复制。DNA链的合成链的合成3种方式：种方式：线粒体线粒体DNA的的D环（环（D-loop）复制）复制噬菌体的滚环（噬菌体的滚环（rolling circle）复制）复制 三、线粒体和噬菌体三、线粒体和噬菌体DNA复制具有特殊方式复制具有特殊方式（一）（一）线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制环形、双螺旋环形、双螺旋DNA分子分子两条链一条为重链（两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（链），另一条为轻链（L链）链）dNTPDNA-pol 线粒体线粒体DNA分子特点：分子特点：l有特异的复制起点；有特异的复制起点；l环环形形线线粒粒体体DNA两两条条链链（H和和L）的的复复制制不不

50、同同步步D环环或或取取代代环环（displacement loop）：线线粒粒体体DNA复复制制开开始始以以H链链作作为为模模板板合合成成新新的的L链链，取取代代原原来来的的L链链并并和和H链链互互补补，而而原原来来的的L链链则则保保持持单链状态，形成类似英文字母单链状态，形成类似英文字母D的区域；的区域；l两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；l线粒体线粒体DNA复制也需要复制也需要RNA引物引物。线粒体线粒体DNA复制特点：复制特点：（二）噬菌体（二）噬菌体DNA按滚环方式复制按滚环方式复制环形双螺旋环形双螺旋DNA分子分子一条为模板链，另一条