SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量.ppt

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望【目的】学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运运用用SDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及及染染色色鉴定。鉴定。【原理】在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量

2、的十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDSSDS），使蛋白样品与），使蛋白样品与），使蛋白样品与），使蛋白样品与SDSSDS结合结合结合结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被品在该系统电泳中

3、所作出的标准曲线，推算出被品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。测蛋白样品分子量的近似值。测蛋白样品分子量的近似值。测蛋白样品分子量的近似值。在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫

4、酸钠聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDSSDS），形成蛋白质），形成蛋白质），形成蛋白质），形成蛋白质SDSSDS复合物，这种复合物由于结复合物，这种复合物由于结复合物，这种复合物由于结复合物，这种复合物由于结合了大量的合了大量的合了大量的合了大量的SDSSDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或了仅保持原有分子大小为特征的

5、负离子团块，从而降低或了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的白质分子的白质分子的白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小电泳迁移率主要取决于它的分子量大小电泳迁移率主要取决于它的分子量大小电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其，而其，而其，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略

6、不计。它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃板之夹在两块玻璃板之间的凝胶间的凝胶 电泳缓冲液电泳缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源 当蛋白质的分子量在当蛋白质

7、的分子量在当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在1500015000200000200000之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：lnMlnMr r=bmbmR R+K+K 式式式式中中中中：MMr r为为为为蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子量量量量，mmR R为为为为相相相相对对对对迁迁迁迁移移移移率率率率，b b为为为为斜斜斜斜率率率率，K K为截距。在条件一定时，为截距。在条件一定时

8、，为截距。在条件一定时，为截距。在条件一定时，b b 和和和和K K均为常数。均为常数。均为常数。均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条数作图，可获得一条数作图，可获得一条数作图，可获得一条标准曲线标准曲线标准曲线标准曲线。未知蛋白质在相同条件下。未知蛋白质在相同条件下。未知蛋白质在相同条件下。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分进行电泳

9、，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。子量。子量。子量。标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。相对迁移率相对迁移率【实验器材】直流稳压电泳仪直流稳压电泳仪垂直平板电泳槽垂直平板电泳槽移液器移液器微量注射器微量注射器烧杯、试管、滴管、培养皿、直尺等烧杯、试管、滴管、培养皿、直尺等【实验试剂】凝胶贮备液凝胶贮备液分离胶

10、缓冲液分离胶缓冲液浓浓缩胶缓冲液缩胶缓冲液10%SDS2倍还原缓冲液倍还原缓冲液【实验试剂】电极缓冲液电极缓冲液10%过硫酸铵过硫酸铵染色液染色液脱色液脱色液【实验试剂】低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶B Mr=97,400 B Mr=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白 Mr=66,200 Mr=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白 Mr=43,000 Mr=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 Mr=31,000 Mr=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰

11、蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 Mr=20,100 Mr=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 Mr=14,400 Mr=14,400一、装板一、装板 将将将将垂垂垂垂直直直直板板板板型型型型电电电电泳泳泳泳装装装装置置置置内内内内的的的的板板板板状状状状凝凝凝凝胶胶胶胶模模模模子子子子取取取取出出出出，将将将将玻玻玻玻璃璃璃璃片片片片洗洗洗洗净净净净、凉凉凉凉干干干干、嵌嵌嵌嵌入入入入凹凹凹凹槽槽槽槽中中中中，形形形形成成成成一一一一个个个个“夹夹夹夹心心心心”凝凝凝凝胶胶胶胶腔腔腔腔，把把把把装装装装好好好好的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶腔腔腔腔置置置置于于于

12、于仰仰仰仰放放放放的的的的电电电电极极极极上上上上槽槽槽槽。将将将将电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽、凝凝凝凝胶胶胶胶模模模模子子子子串串串串成成成成一一一一体体体体的的的的垂垂垂垂直直直直板板板板型型型型电电电电泳泳泳泳装装装装置置置置，垂垂垂垂直直直直放放放放置置置置在在在在水水水水平平平平台台台台面面面面上上上上，灌灌灌灌注胶液。注胶液。注胶液。注胶液。【操作方法】二、分离胶的配制（二、分离胶的配制（12%）试剂试剂 体体积积 H2O3.35（ml）凝胶凝胶贮备贮备液液2.5（ml）分离胶分离胶缓缓冲液冲液(pH8.8)2.5（ml）10%SDS 0.1（ml）TEMED 5（ul）10%过过硫

13、酸硫酸铵铵 50（ul）总总体体积积10（ml）三、分离胶的灌注和聚合三、分离胶的灌注和聚合 用用移移液液管管将将所所配配制制的的分分离离胶胶缓缓冲冲液液沿沿着着凝凝胶胶腔腔的的长长玻玻璃璃板板的的内内面面缓缓缓缓注注入入，留留出出梳梳齿齿的的齿齿高高加加1cm的的空空间间以以便便灌灌注注浓浓缩缩胶胶，然然后后加加满满蒸蒸馏馏水水。待待分分离离胶胶凝凝固固后后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。倒出蒸馏水，用滤纸吸干。四、浓缩胶的配制（四、浓缩胶的配制（5%）试剂试剂 体体积积 H2O2.92（ml）凝胶凝胶贮备贮备液液0.8（ml）分离胶分离胶缓缓冲液冲液(pH6.8)1.25（ml）10%SDS 0

14、.05（ml）TEMED 5（ul）10%过过硫酸硫酸铵铵 25（ul）总总体体积积5.05（ml）五、浓缩胶的灌注和聚合五、浓缩胶的灌注和聚合 用用移移液液管管将将所所配配制制的的浓浓缩缩胶胶缓缓冲冲液液沿沿着着凝凝胶胶腔腔的的长长玻玻璃璃板板的的内内面面缓缓缓缓注注入入，将将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。六、样品的准备六、样品的准备 在在低低分分子子量量标标准准蛋蛋白白质质和和待待测测样样品品中中分分别别加加入入适适量量还还原原缓缓冲冲液液，放放入入沸沸水水浴浴中中加热加热35min，取出冷至室温。，取出冷至室温。七、加样七、加样 加加加加入入

15、入入电电电电极极极极缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，小小小小心心心心拔拔拔拔出出出出梳梳梳梳齿齿齿齿，用用用用微微微微量量量量注注注注射射射射器器器器向向向向凝凝凝凝胶胶胶胶梳梳梳梳孔孔孔孔 内内内内 加加加加 样样样样。同同同同 时时时时 加加加加 入入入入MarkerMarker。加样加样样品迁样品迁移方向移方向八、电泳八、电泳 上上槽槽接接负负极极，下下槽槽接接正正极极，打打开开直直流流电电源源，刚刚开开始始时时，电电压压控控制制在在不不高高于于100V，样样品品进进入入分分离离胶胶后后，电电压压控控制制在在不不高高于于140V。待待指指示示剂剂染染料料靠靠迁迁移移至至下下沿沿11.5cm处停

16、止电泳。处停止电泳。九、染色和脱色九、染色和脱色小心将胶取出，放入一大培养皿中。小心将胶取出，放入一大培养皿中。染色：染色：加入染色液，置于摇床上染色加入染色液，置于摇床上染色2h。脱脱色色：染染色色完完毕毕，倒倒出出染染色色液液，加加入入脱脱色色液液，置置于于摇摇床床上上脱脱色色，数数小小时时更更换换一一次次脱脱色色液液，直至背景清晰，拍照。直至背景清晰，拍照。十、相对分子质量的计算十、相对分子质量的计算 量量出出分分离离胶胶顶顶端端距距溴溴酚酚蓝蓝间间的的距距离离(cm)以以及及各各蛋蛋白白质质样样品品区区带带中中心心与与分分离离胶胶顶顶端端的的距离距离(cm)，按下式计算相对迁移率，按下

17、式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。蛋白质样品距分离胶顶端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距分离胶顶端距离(cm)思考题思考题在在不不连连续续体体系系SDS-PAGE中中，当当分分离离胶胶加加完完后，需在其上加一层水，为什么后，需在其上加一层水，为什么?电极缓冲液中甘氨酸的作用电极缓冲液中甘氨酸的作用?在在不不连连续续体体系系SDS-PAGE中中，分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶中均含有胶中均含有TEMED和和AP，试述其作用，试述其作用?样样品品液液为为何何在在加加样样前前需需在在沸沸水水中中加加热热几几分分钟钟?