最新实时荧光定量PCR技术,原理,应用及实践,第二代染料PPT课件.ppt

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1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术,原理原理,应用及实践应用及实践,第二代第二代染料染料2北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司v康为的目标：成为中国的康为的目标：成为中国的Invitrogenv完善的产品线完善的产品线v一站式的服务平台一站式的服务平台您的问题解决专家！您的问题解决专家！PCR：理想与现实l反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能l终点检测，与看家基因对照，所谓半定量：不可接受。确定模板初始数量real-time使qPCR成为可能q模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小q模板Log浓度与Ct值呈线性关系Real-time

2、PCR应用定量基因表达水平检测定量基因拷贝数检测多色标记SNP检测高精度溶解曲线分析（HRM）-SNP高精度溶解曲线分析（HRM）-DNA甲基化分析Real-timePCR:发光原理非特异染料（SYBRGreen，SuperGreen）水解探针（TaqMan探针）非水解探针（Molecular beacon，Scorpion primer）染料法qPCR基因表达水平检测内参基因内参基因(housekeepinggene)选择选择样本处理与样本处理与RNA提取提取cDNAqPCR墨菲定律：Anythingcangowrongthatwillgowrong!以各自样本中内参（housekeepin

3、g）基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度-Ct法法成立条件：内参基因成立条件：内参基因(houskeepinggene)在相互比较的在相互比较的样本之间表达丰度相同样本之间表达丰度相同满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负正负10%染料法qPCR相对定量HousekeepinggeneselectionHousekeepinggene的概念与定义不同环境，不同生长与病理状态，不同器官、组织、细胞类型之间表达水平恒定-ActinandGAPDHhousekeepinggeneexpressioninasthmaticairwaysisva

4、riableandnotsuitablefornormalisingmRNAlevels.Thorax2002;57:765-770HousekeepinggeneselectionEvidenceBasedSelectionofHousekeepingGenesPLoSONE.2007;2(9):e898Housekeepinggeneselection文献检索，挑选恰当housekeepinggene恰当：有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeepinggene没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作Housekeepinggene（特别是-Actin和GAPDH）Ho

5、usekeepinggene在给定研究条件下的表达丰度最好与目标基因相似通过实验选择Housekeepinggene实测多个备选Housekeepinggene以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性参考资料geNorm网站-http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/Vandesompeleetal.,GenomeBiology,2002,Accuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcont

6、rolgenesHousekeepinggeneselectionHousekeepinggene康为产品高丰度高丰度ACTB，GAPDH中等丰度中等丰度beta2M低丰度低丰度HPRT1染料法qPCR基因表达水平检测内参基因选择内参基因选择 样本处理与样本处理与 RNARNA提取提取 cDNAcDNA qPCRqPCR样本处理与RNA提取外界刺激10分钟可检测的表达改变严格平行操作。样品离开定义环境2分钟内裂解、固定细胞Trizon裂解液（氰酸胍，异硫氰酸呱，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592染料法qPCR基因表达水平检

7、测内参基因选择内参基因选择样本处理与样本处理与RNA提取提取cDNAqPCR逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？检测何种剪接体？是否会有二级结构干扰？检测灵敏度是否足够？AbundantRNA的干扰：mRNAortotalRNA？一步法一步法or两步法？两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段推荐：工作的初期阶段 RealSYBR RealSYBR 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSYBR RealSYBR 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRP

8、CR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSuper RealSuper 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX一步法：一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败难以查找原因。推荐：工作的成熟阶段推荐：工作的成熟阶段 RealSuper RealSuper 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX染料法qPCR基因表达水平检测内参基因选择内参基因选择样本处理与样本处理与RNA提取提取cDNAqPCR反应条件优化Housekeepinggene单一特异性产物反应效率大于90%反应

9、条件优化目的基因目的基因单一特异性产物反应效率接近housekeepinggene反应效率尽量高Real-timePCR总原则与普通PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构尽量小些（70-300bp)目标区段位置：考虑目标剪接体推荐做跨intron设计EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA引物设计引物设计反应条件优化Mastermix的选择DNA聚合酶PrimersDyeBufferanddNTPsTemplateCWBIOReal-timePCR系列产品MasterMix的选择名副其实FastRealSuperMixture（WithROX）

10、Fast：快速复活热启动DNA聚合酶Real：应用于Real-timeSuper：使用新型染料，超亮！Mixture：包括除引物和模板的一切，还有更多！ROX：含有ROX染料，适用于需ROX校正的仪器CW0766背景知识PCR热启动反应准备阶段环境温度下引物与模板可发生非特异结合DNA聚合酶低温下亦有一定活性产生少量非特异产物少量非特异产物在后续循环中成为特异模板，产生大量非特异产物对策热启动DNA聚合酶用某种方法抑制DNA聚合酶在低温下的活性反应第一步升温时恢复DNA聚合酶活性Mastermix的优化DNA聚合酶Hotstar化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟FastHotstar

11、抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒几十秒CW0696CW0704Mastermix的优化荧光染料新型荧光染料新型荧光染料(SuperGreen)激发、发射波长与SYBRgreen近似对PCR反应抑制更轻微可使用较高浓度(1uM,SYBRgreen0.3uM)更亮，灵敏度更高较短的链延长时间对小片段DNA和ssDNA结合更弱减少背景，有效信号更强与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析化学性质更稳定致突变性与毒性更弱SYBRGREEN染料新型荧光染料荧光染料 反应条件优化Mastermix的选择Buffer添加剂的使用反应增强剂减少模板二级结构影响控制Mg2+浓度稳定剂.其它原理

12、.使用添加剂未使用添加剂MasterMix的优化对仪器的适应性康为MasterMix在多种不同品牌，不同档次，性能各异的Real-timePCR仪上进行优化MasterMix的优化对仪器的适应性某其它品牌某其它品牌康为康为采用cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。模板浓度进行10倍稀释，稀释5个梯度，每管做2个平行，同时做阴性对照MasterMix的优化校正染料ROXPassiveReference不参与、不干扰PCR反应恒定发射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。有不同系统，需参照仪器要求选择。抗污染污染警报：阴性对照出现阳性结果污染源：先前PC

13、R产物对策：尿嘧啶糖苷酶（UNG）尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）方法：反应中用dUTP取代dTTP反应中加入UNG反应升温前在37oC孵育数分钟，使UNG降解含UTP的DNA（先前PCR产物）Troubleshooting 常常常常见问题见问题见问题见问题 可能原因可能原因可能原因可能原因 解决方法解决方法解决方法解决方法Housekeeping geneHousekeeping gene 无信号无信号RNARNA降解降解用新用新鲜组织鲜组织提取提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目而目标标基因无信号基因无信号1.1.目的基因表

14、达低。目的基因表达低。逆逆转录转录效率不高效率不高2.PCR2.PCR引物不良引物不良1.1.富集富集mRNA mRNA 2.2.在逆在逆转录转录中中尝试尝试不同引物，如特异引物。不同引物，如特异引物。3.3.尝试尝试不同不同PCRPCR引物。减小引物。减小产产物大小，改物大小，改换换目目标标 区段，考区段，考虑虑不同剪接体。不同剪接体。4.4.尝试尝试不同不同热热循程序，降低复性温度。循程序，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反反应应效率正常效率正常,但但目目标标因放大效率不高因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新重新设计设计引物，减小

15、引物，减小产产物大小，改物大小，改换换目目标标区段，区段，考考虑虑不同剪接体不同剪接体目目标标基因表达丰度在基因表达丰度在样样本之本之间间异常一致异常一致RNARNA被基因被基因组组DNADNA污污染染1.1.使用跨使用跨intronintron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处处理理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性阴性对对照表照表现现阴性阴性溶解曲溶解曲线线出出现杂现杂峰峰1.1.出出现现非特异非特异PCRPCR产产物物2.2.出出现现引物二聚体引物二聚体1.1.尝试尝试不同不同PCRPCR引物引物2.2.尝试尝试不同不同热热循程序，升高复性温度循程序，升高复性温度3.

16、3.修改修改仪仪器器设设置，将置，将检测检测温度温度设设定在在引物二聚定在在引物二聚体解体解链链温度与温度与PCRPCR特异特异产产物解物解链链温度之温度之间间。阴性阴性对对照在照在3030个循个循环环以内出以内出现现信号信号试剂试剂被被污污染染1.1.注意区分信号是来自引物二聚体注意区分信号是来自引物二聚体还还是是PCRPCR产产物物2.2.查查找，替找，替换污换污染染试剂试剂3.3.使用使用UNGUNG系系统统。qPCR反应优化反应优化非关键技术非关键技术外包服务外包服务Housekeepinggene引物序列？反应条件？目标基因引物序列？反应条件？选择试剂，摸索条件，优化参数两个月？Co

17、Win解决方案一：Primerassay客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix客户下游工作：Real-timePCR数据获取CoWin解决方案二：全套qPCR服务客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因客户提供：生物样本客户得到：数据报告，剩余样品。客户下游工作：写论文;得诺贝尔奖谢谢！谢谢！北京康为世纪生物技术有限公司北京康为世纪生物技术有限公司总机010-588519194006-222-360(免费电话）订购010-58851919-618O技术支持010-58851919-615/616S市场部010-58851919628M结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！42