最新崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝PPT课件.ppt

《最新崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝PPT课件.ppt（21页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、崔福爱实验二葡聚糖凝胶分崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝离蓝葡聚糖和溴酚蓝实验目的实验目的1 1 掌握生化分离技术掌握生化分离技术掌握生化分离技术掌握生化分离技术层析技术的基本原理。层析技术的基本原理。层析技术的基本原理。层析技术的基本原理。2 2掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。3 3学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处理、装柱、平衡、上样、洗

2、脱、收集、检测）。理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶n n多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为商品名为商品名为商品名为Sephadex GSephadex G系列系列系列系列n nGG交联度：交联度：交联度：交联度：G G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，后面的阿拉伯数字表示不

3、同的规格型号，后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有有有有G-10G-10，G-15G-15，G-25G-25，G-50G-50，G-75G-75，G-100G-100，G-150G-150和和和和G-G-200200八种，具体含义为吸水量（八种，具体含义为吸水量（八种，具体含义为吸水量（八种，具体含义为吸水量（g g）/10g/10g干胶。干胶。干胶。干胶。n n交联度与孔径大小成反比：交联度越大（交联度与孔径大小成反比：交联度越大（交联度与孔径大小成反比：交联度越大（交联度与孔径大小成反比：交联度越大（G G小），孔径小），孔径小），孔径小），孔径越小，吸水性小；交联度越小（越小，吸水性小

4、；交联度越小（越小，吸水性小；交联度越小（越小，吸水性小；交联度越小（G G大），大），大），大），孔径越大，孔径越大，孔径越大，孔径越大，吸水性大。因此，吸水性大。因此，吸水性大。因此，吸水性大。因此，“G”“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度反映凝胶的交联程度，膨胀程度反映凝胶的交联程度，膨胀程度反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。及分离范围。及分离范围。及分离范围。凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向

5、下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动垂直向下运动和不定向扩散运动垂直向下运动和不定向扩散运动垂直向下运动和不定向扩散运动小分子小分子小分子小分子可进入凝胶空内部，可进入凝胶空内部，可进入凝胶空内部，可进入凝胶空内部，流程长流程长流程长流程长，速度慢，后流出；，速度慢，后流出；，速度慢，后流出；，速度慢，后流出；大分子大分子大分子大分子不能进入凝胶空内部，颗粒不能进入凝胶空内部，颗粒不能进入凝胶空内部，颗粒不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，间移动，间移动，间移动，流程短流程短流程短流程短，先流出，先流出，先流出，先流出大小分子彼此分开大小分子彼此分开大小分子彼此分开大小分子彼此分开 。数学模

6、型 Vo Vi VtViVi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水）VoVo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水）VgVg凝胶体积凝胶体积总体积总体积VtVt=Vi Vi+VoVo+VgVgKdKd分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数粒的程度，是溶质分子大小的一个函数VeVe洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 VeVe=VoVo+KdKdViVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度洗脱曲线

7、：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸吸光度为纵坐标作图光度为纵坐标作图（1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，VeVe=VoVo，KdKd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe=VoVo+KdKdViVi，00KdKd111影响因素影响因素n n层析柱的选择及装填：层析柱的选择及装填：柱大小柱大小柱大小柱大小分离样品量分离样品量分离样品量分离样品量 凝胶型号凝胶型号凝胶型号凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离有一定范围，有最

8、大极限和最小极限。凝胶分离有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子全排阻分子全排阻分子全排阻分子/完全渗透分子。完全渗透分子。完全渗透分子。完全渗透分子。n n洗脱液：溶解待分离物质，不变性洗脱液：溶解待分离物质，不变性n n加样量：加样量：1%5%n n凝胶的再生凝胶的再生实验原理实验原理 本实验以葡聚糖凝胶本实验以葡聚糖凝胶本实验以葡聚糖凝胶本实验以葡聚糖凝胶G-25G-

9、25作为固定相载体，来分作为固定相载体，来分作为固定相载体，来分作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖离蓝色葡聚糖离蓝色葡聚糖离蓝色葡聚糖-2000-2000和溴酚蓝。和溴酚蓝。和溴酚蓝。和溴酚蓝。蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000-2000分子量接近分子量接近分子量接近分子量接近2102106 6，而溴酚蓝分，而溴酚蓝分，而溴酚蓝分，而溴酚蓝分子量为子量为子量为子量为669669，二者分子量相差较大二者分子量相差较大二者分子量相差较大二者分子量相差较大。两者混合物加到。两者混合物加到。两者混合物加到。两者混合物加到葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，葡聚糖凝胶层析柱，利

10、用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒大分子的蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱胶网孔内，流速缓

11、慢，后流出柱外，二者通过层析柱胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱的时间不同而分开。的时间不同而分开。的时间不同而分开。的时间不同而分开。实验方法实验方法 1.1.凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，把杂质漂洗干净。把杂质漂洗干净。把杂质漂洗干净。把杂质漂洗干净。2.2.装柱：装柱：装柱：装柱：将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水10ml10ml，

12、打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约2-3cm2-3cm时关闭出口，以排除底部气泡。时关闭出口，以排除底部气泡。时关闭出口，以排除底部气泡。时关闭出口，以排除底部气泡。将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，灌注高度为灌注高度为灌注高度为灌注高度为10-12cm10-12cm。用螺旋夹控制流速为用螺旋夹控制流速为用螺旋夹控制流速为用

13、螺旋夹控制流速为20-4020-40滴滴滴滴/分钟，用洗脱缓分钟，用洗脱缓分钟，用洗脱缓分钟，用洗脱缓冲液平衡几分钟后，即可使用。冲液平衡几分钟后，即可使用。冲液平衡几分钟后，即可使用。冲液平衡几分钟后，即可使用。3.3.加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺旋夹拧紧。取样品旋夹拧紧。取样品旋夹拧紧。取样品旋夹拧紧。取样品200l 200l 沿层析柱内壁缓缓加入到液沿层析柱内壁缓缓加入到液沿层析柱内壁缓缓加入到液沿层析柱内壁缓缓加入到液面上，打开螺旋夹，用烧

14、杯收集流出的液体。当样面上，打开螺旋夹，用烧杯收集流出的液体。当样面上，打开螺旋夹，用烧杯收集流出的液体。当样面上，打开螺旋夹，用烧杯收集流出的液体。当样品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。4.4.收集：先收集：先收集：先收集：先用量筒收集洗脱液体用量筒收集洗脱液体用量筒收集洗脱液体用量筒收

15、集洗脱液体（约（约（约（约4ml4ml），待柱中蓝），待柱中蓝），待柱中蓝），待柱中蓝葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖-2000-2000开始移出改用开始移出改用开始移出改用开始移出改用EPEP管收集液体，每管收集管收集液体，每管收集管收集液体，每管收集管收集液体，每管收集1ml1ml。完全移出后。完全移出后。完全移出后。完全移出后改用量筒收集洗脱液体（约改用量筒收集洗脱液体（约改用量筒收集洗脱液体（约改用量筒收集洗脱液体（约8-8-10ml10ml），），），），待观察到柱中溴酚蓝开始移出，换用待观察到柱中溴酚蓝开始移出，换用待观察到柱中溴酚蓝开始移出，换用待观察到柱中溴酚蓝开始移出，换用EPEP管

16、管管管收集液体，每管收集收集液体，每管收集收集液体，每管收集收集液体，每管收集1.5ml1.5ml，直至溴酚蓝完全洗脱。，直至溴酚蓝完全洗脱。，直至溴酚蓝完全洗脱。，直至溴酚蓝完全洗脱。5.5.检测：将收集到的所有样品一次在检测：将收集到的所有样品一次在检测：将收集到的所有样品一次在检测：将收集到的所有样品一次在540nm540nm波长处测定吸光波长处测定吸光波长处测定吸光波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标（洗脱管度，以吸光度值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标（洗脱管度，以吸光度值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标（洗脱管度，以吸光度值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标（洗脱管号），绘制

17、洗脱曲线。号），绘制洗脱曲线。号），绘制洗脱曲线。号），绘制洗脱曲线。6.6.凝胶回收：凝胶层析柱可以重复使用。用毕后用凝胶回收：凝胶层析柱可以重复使用。用毕后用凝胶回收：凝胶层析柱可以重复使用。用毕后用凝胶回收：凝胶层析柱可以重复使用。用毕后用3 3倍凝胶柱倍凝胶柱倍凝胶柱倍凝胶柱体积的洗脱液对凝胶柱进行流洗后，将凝胶由柱内倒出至烧体积的洗脱液对凝胶柱进行流洗后，将凝胶由柱内倒出至烧体积的洗脱液对凝胶柱进行流洗后，将凝胶由柱内倒出至烧体积的洗脱液对凝胶柱进行流洗后，将凝胶由柱内倒出至烧杯内，备用。杯内，备用。杯内，备用。杯内，备用。实验注意事项实验注意事项 保证层析柱的连续性，不得有气泡，凝胶面要平整。保证层析柱的连续性，不得有气泡，凝胶面要平整。保证层析柱的连续性，不得有气泡，凝胶面要平整。保证层析柱的连续性，不得有气泡，凝胶面要平整。保持凝胶表面的湿润，防止气泡进入。保持凝胶表面的湿润，防止气泡进入。保持凝胶表面的湿润，防止气泡进入。保持凝胶表面的湿润，防止气泡进入。收集洗脱的液体时注意不断观察样品在柱中的分离及收集洗脱的液体时注意不断观察样品在柱中的分离及收集洗脱的液体时注意不断观察样品在柱中的分离及收集洗脱的液体时注意不断观察样品在柱中的分离及移动情况。移动情况。移动情况。移动情况。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！21