核酸提取原理及方法优秀PPT.ppt

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1、WWW.YRBIO.COM赢润生物 曾 林核酸提取原理及方法核酸提取原理及方法2011年年7月月前言核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学探讨的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作。:/yrbio 2011年年7月月主要内容主要内容1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 :/yrbio 2011年年7月月核酸简介核酸简介p 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5-磷酸磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖二酯键连

2、接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸核酸(RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸(DNA)两类。两类。p DNA主要储存遗传信息。主要储存遗传信息。p RNA主要传递遗传信息。主要传递遗传信息。:/yrbio 2011年年7月月核酸简介核酸简介 如何分离如何分离RNARNA？如何分离如何分离DNADNA？:/yrbio 2011年年7月月核酸简介核酸简介质粒质粒DNADNA 质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的不等，为双链、闭环的DNA分子，分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。并以超螺旋状态存在于

3、宿主细胞中。质粒主要发觉于细菌、放线菌和真菌等细胞质粒主要发觉于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录实力，能在子代细胞中，它具有自主复制和转录实力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。:/yrbio 2011年年7月月1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取 :/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取方法提取方法基因组基因组DNA提取的几种常用方法：提取的几种常用方法：u CTAB法法u SDS法法u 其他方法其他方法 :/yrbio

4、 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法p CTAB法原理（植物法原理（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）pCTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。合物。p该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分别出酚类等杂质后

5、加入乙醇沉淀即可使核酸分别出来。来。:/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl（pH 8.0）供应一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）供应一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 供应一个高盐环境，使供应一个

6、高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分别；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分别；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避开褐变，使酚简洁去除。巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避开褐变，使酚简洁去除。:/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM0.4 M3%(W/

7、V)5%(W/V)2%（V/V）使）使用前加入用前加入PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，削减一种不溶的络合物质，有效去除多酚，削减DNADNA中酚的中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。:/yrbio 2011年年7月月p CTAB法试验流程法试验流程基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤

8、:/yrbio 2011年年7月月p SDS法原理法原理SDSSDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（55556565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAcKAc或或NHNH4 4Ac)Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNADNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNADNA。基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法

9、注：注：SDS法适用于大部分试验材料基因组法适用于大部分试验材料基因组DNA提取。如动物组织、提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。细胞、全血、细菌、酵母等。:/yrbio 2011年年7月月pSDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法组份组份Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度50 mM 20 mM 0.4 M 2%Tris-HClTris-HCl（pH8.0pH8.0）：供应一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）：供应一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTAEDTA：螯合：螯合Mg2+Mg2+或或Mn

10、2+Mn2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNase活性；活性；NaClNaCl：供应一个高盐环境，使：供应一个高盐环境，使DNPDNP充分溶解，存在于液相中。充分溶解，存在于液相中。:/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法p SDS法试验流程（以动物组织为例）法试验流程（以动物组织为例）动物组织动物组织 抽提抽提酒精沉淀酒精沉淀液氮研磨液氮研磨或匀浆或匀浆上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤 :/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测小鼠小鼠gDN

11、A电泳图电泳图琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作以琼脂糖凝胶作为支持物，利用为支持物，利用DNADNA分子在泳动时的电分子在泳动时的电荷效应和分子筛效荷效应和分子筛效应，达到分别混合应，达到分别混合物的目的。物的目的。:/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题提取常见问题p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应p DNA降解降解p DNA量少量少 :/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应DNA中含有蛋白

12、、多糖、多酚类物质中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀重新沉淀DNA中残留有金属离子中残留有金属离子 重新重新70%乙醇漂洗乙醇漂洗 :/yrbio 2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA降解降解材料不簇新或反复冻融材料不簇新或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于猛烈，提取过程操作过于猛烈，DNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染 :/yrbio 2011年年7月月p

13、 DNA提取量少提取量少p试验材料不佳或量少试验材料不佳或量少p 选取簇新（幼嫩）材料选取簇新（幼嫩）材料p破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分p 充分研磨、破壁酶、延长裂解充分研磨、破壁酶、延长裂解时间时间p沉淀不完全沉淀不完全p 低温、延长沉淀时间低温、延长沉淀时间p洗涤使得丢失洗涤使得丢失DNA基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析 :/yrbio 2011年年7月月1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 :/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取p 质粒质

14、粒DNA提取的方法：提取的方法：碱裂解法碱裂解法煮沸法煮沸法 :/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法原理碱裂解法原理 :/yrbio 2011年年7月月离心柱型质粒离心柱型质粒DNADNA提取试剂盒工作原理提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒离心柱型质粒DNA提取试剂盒接受改进的提取试剂盒接受改进的SDS-碱裂碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最终用低盐、高液将杂质和其它细菌成分去

15、除，最终用低盐、高pH值的值的洗脱缓冲液将纯净质粒洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。从硅基质膜上洗脱。:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取及检测提取及检测试验准备试验准备1.试验器材试验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、marker笔、笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。锥形瓶等。2.试验耗材试验耗材 无菌无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格管、各规格Tip、一次性手套等。、一次性手套等。3.试验试剂试验试剂

16、 质粒小提试剂盒（离心柱型，质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO)、LB培育基、抗生素、培育基、抗生素、琼脂糖、琼脂糖、DNA Loading Buffer、GoldView核酸染料、核酸染料、TAE电泳缓冲液等。电泳缓冲液等。4.试验材料试验材料 对数期菌株（对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法碱裂解法p 碱裂解法试剂配方碱裂解法试剂配方组分组分1组分组分2液液25 mM Tris-HCl（pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0）液液0.2 M NaOH1%SDS 液液3 M KAc（pH 4.2）RNa

17、se A10 g/ml RNase A洗脱液洗脱液 EB10 mM Tris-HCl（pH 8.0）1 mM EDTA（pH 8.0）:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取试验流程试验流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解 上清液上清液 过柱过柱干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤质粒质粒DNADNA溶液溶液离心具体试验步骤请参考说明书！具体试验步骤请参考说明书！:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取电泳检测电泳检测p琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测质粒质粒DNADNA的三种带型

18、：的三种带型：1.1.共价闭合环状共价闭合环状DNADNA分子：质粒分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度动速度最快最快；2.2.半开环半开环质粒质粒DNADNA分子：质粒的分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度泳动速度最慢最慢；3.3.线性线性DNADNA分子：质粒的两条链分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度均断裂；泳动速度居中居中。:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题p RNA残留残留p 质粒断裂质粒断裂p 量少量少 :/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取常见

19、问题分析提取常见问题分析p RNA残留残留p 遗忘加遗忘加RNase A？p I液中液中RNase A失效？失效？p 酶量不够？酶量不够？:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 质粒断裂质粒断裂p II 液裂解时间过长？液裂解时间过长？p 裂解时动作过于猛烈？裂解时动作过于猛烈？:/yrbio 2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 量少量少凝胶是否有问题？凝胶是否有问题？菌体量少菌体量少菌体重悬不彻底菌体重悬不彻底裂解不完全裂解不完全菌株老化菌株老化严谨型质粒严谨型质粒 :/yrbio 2011年年7月月质粒

20、类型质粒类型严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格限制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛限制之下进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，假如用确定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。:/yrbio 2011年年7月月1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 :/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取

21、通用方法通用方法p 异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法（苯酚法（TRIzol法）法）p 原理：原理：p 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消逝，水溶性下降。因此，下，磷酸基的负电荷消逝，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，向疏水性的酚层移动，而而RNA由于有由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层的存在有亲水性，因此向水层移动。移动。:/yrbio 2011年年7月月 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，

22、其中试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与与蛋白质分别，并将蛋白质分别，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中与仍留在有机相中的蛋白质和的蛋白质和DNA便分别开。水相层主要为便分别开。水相层主要为RNA，有机层主，有机层主要为要为DNA和蛋白质。和蛋白质。:/yrbio 2011年年7月月

23、总总RNARNA提取及检测提取及检测试验准备试验准备1.试验器材试验器材 台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、marker笔、酒精喷笔、酒精喷壶、壶、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.试验耗材试验耗材 1.5 mL EP管（管（RNase free）、各规格）、各规格Tip（RNase free）、一次性手套、一次性口罩等。一次性手套、一次性口罩等。3.试验试剂试验试剂 TRIzol 总总RNA

24、提取试剂（提取试剂（YRBIO)、氯仿、异丙醇、氯仿、异丙醇、75%乙乙醇醇（RNase free）、）、DEPC H2O（RNase free）等。等。4.试验材料试验材料 簇新簇新293细胞细胞 :/yrbio 2011年年7月月p RNase是导致是导致RNA降解的最主要物质！降解的最主要物质！pRNase的来源的来源p样品样品p试剂试剂p多次运用的器具多次运用的器具p袒露的手袒露的手p说话产生的唾沫说话产生的唾沫p空气空气RNase特别稳定，它特别稳定，它在一些极端的条件可在一些极端的条件可以短暂失活，但限制以短暂失活，但限制因素去除后有快速复因素去除后有快速复性。用常规的高温高性。用

25、常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使白抑制剂都不能使RNase完全失活。完全失活。:/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取去除去除RNaseRNase污染污染p玻璃器皿处理：玻璃器皿处理：p 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200烘烤烘烤2小时以上。小时以上。p塑料器皿处理：塑料器皿处理：p 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。p试剂处理：试剂处理：p 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。专用。0.1%DEPC水配制水配制75%的酒精。的酒精。p专用的专用的

26、RNA操作室、专用器械。操作室、专用器械。p操作时戴口罩、手套、帽子、穿试验服。操作时戴口罩、手套、帽子、穿试验服。:/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取样本准备样本准备p植物植物/动物组织样本：动物组织样本：p簇新取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或簇新取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80。p为避开反复冻融，需小份分装（为避开反复冻融，需小份分装（50100 mg/份）。份）。p细胞样本：细胞样本：p簇新收集待用或加入簇新收集待用或加入TRIzol后后-80冻存细胞沉淀。冻存细胞沉淀。p血液样本：血液样本：p簇新血液分别出淋巴细胞，待用或加入簇新血液分别出淋巴细胞，

27、待用或加入TRIzol后后-80p冻存细胞沉淀。冻存细胞沉淀。:/yrbio 2011年年7月月真核细胞总真核细胞总RNARNA提取提取试验步骤试验步骤p 293细胞样品为例细胞样品为例收集细胞收集细胞上层溶液上层溶液 离心洗涤离心洗涤裂解变性裂解变性异丙醇沉淀异丙醇沉淀 抽抽 提提RNARNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解具体试验步骤请参考说明书！具体试验步骤请参考说明书！:/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取完整性检测完整性检测293细胞总RNA28S18S5S 由于动物细胞中由于动物细胞中70-80%70-80%的的RNARNA为为rRNArRNA，后者又由后者又由28S2

28、8S（约（约4800 nt4800 nt），），18S18S（约（约1900 1900 ntnt）和）和5.8S5.8S（约（约120 nt120 nt）三种组成，所以电）三种组成，所以电泳后应当在泳后应当在UVUV下望见三条清晰的下望见三条清晰的rRNArRNA带。带。由于核酸长度与结合由于核酸长度与结合EBEB的数量成正比，的数量成正比，所以所以28S rRNA28S rRNA条带的荧光强度一般比条带的荧光强度一般比18S 18S rRNArRNA条带的荧光强度强条带的荧光强度强1.5-2.31.5-2.3倍。假如这倍。假如这两条两条rRNArRNA带不清晰或比例小于此范围则表示带不清晰或

29、比例小于此范围则表示RNARNA有降解（因为大的有降解（因为大的RNARNA被酶降解的可能更被酶降解的可能更大）。大）。p电泳检测电泳检测 :/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取产量产率与纯度检测产量产率与纯度检测v1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照仪器说明。照仪器说明。v2.取少量待测取少量待测RNA样品，用样品，用TE Buffer稀释稀释50倍倍（或（或100倍）。倍）。v3.用用TE Buffer做空白，在做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调整紫外分光光度计的读数至零。处调整紫外分光光度计的读数至零。

30、v4.加入待测加入待测RNA样品在三个波特长读取样品在三个波特长读取OD值。值。:/yrbio 2011年年7月月总总RNARNA提取提取产量产率与纯度检测产量产率与纯度检测5.依据依据OD值计算值计算RNA的浓度：的浓度：SSRNA=40(OD260OD310)稀释倍数稀释倍数6.RNA产量产率计算：产量产率计算：RNA 的产量的产量=RNA浓度浓度溶解体积溶解体积 RNA的产率的产率=RNA产量产量/细胞用量细胞用量7.依据依据OD值计算值计算RNA的纯度的纯度 纯纯RNA样品的样品的OD260/OD280 大约在大约在1.8-2.0之间。之间。:/yrbio 2011年年7月月RNARN

31、A提取常见问题提取常见问题v RNA降解降解v DNA残留残留v OD260/OD280 比值偏低比值偏低v 电泳带型异样电泳带型异样 :/yrbio 2011年年7月月RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p RNA降解降解外源外源RNase的污染的污染裂解液质量裂解液质量裂解液用量不足裂解液用量不足样品本身富含样品本身富含RNase环境温度过高环境温度过高28S18S5S :/yrbio 2011年年7月月RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA残留残留p样本量过多样本量过多p吸取到中间层及下层试剂吸取到中间层及下层试剂p解决方法：解决方法：p DNA酶（酶（RNase

32、 free）消）消化，化，p再抽提纯化处理。再抽提纯化处理。:/yrbio 2011年年7月月RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p OD260/OD280 比值偏低比值偏低p蛋白污染蛋白污染/苯酚残留苯酚残留p 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力离心力 和时间要足够。和时间要足够。p 不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。些上清。p 削减起始样品量，确保裂解完全、彻削减起始样品量，确保裂解完全、彻底。底。p 解决方法解决方法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。重新抽提一次，再沉淀、溶解。:/yrbio 2011年

33、年7月月RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 电泳带型异样电泳带型异样p上样量超过上样量超过 3g p电压超过电压超过 8V/cm p电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧p 均可能导致均可能导致 28S 和和 18S 条带分不开条带分不开 :/yrbio 2011年年7月月1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 :/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1.原理：原理：DNA分子在高于其等电点的分子在高于其等电点的pH溶液中溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

34、而琼脂糖带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形态的核酸，其移动速度有差异。因此，利用态的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种这种“电荷电荷”和和“分子筛分子筛”的双重效应，达到的双重效应，达到分别核酸的目的。分别核酸的目的。:/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳2.琼脂糖凝胶分别琼脂糖凝胶分别DNA的范围的范围 :/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3.DNA染料染料 A:EB 溴化乙锭溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB）可

35、以嵌入核）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。红色荧光。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可检出；可以干脆加到样品中即可检出；可以干脆加到样品中或胶中；价格低廉。或胶中；价格低廉。EB是诱变剂，运用时确定要戴手套。是诱变剂，运用时确定要戴手套。EB废液要废液要经过处理才能丢弃。经过处理才能丢弃。:/yrbio 2011年年7月月B B：新型：新型低毒染料低毒染料：如如Gold ViewG

36、old View、SYBRGreenSYBRGreen、SYBRGoldSYBRGold等。等。毒性较低，但价格较昂贵。毒性较低，但价格较昂贵。灵敏度较好，但不如灵敏度较好，但不如EBEB。:/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳4.琼脂糖胶液制备（琼脂糖胶液制备（1%，50 ml）4.1 称取称取0.5 g琼脂糖，置于琼脂糖，置于250 ml锥形瓶中，加入锥形瓶中，加入60 ml 1TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸糖溶解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要时

37、常摇动，使附于瓶壁上的琼解。加热过程中要时常摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以削脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以削减水分蒸发；减水分蒸发；4.2 待胶液冷却至待胶液冷却至60左右时，加入左右时，加入5%的的Gold View染料，混匀，既成琼脂糖胶液。染料，混匀，既成琼脂糖胶液。:/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳5.凝胶板的制备凝胶板的制备 5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入胶槽中，使凝胶厚度约为倒入胶槽中，使凝胶厚度约为0.3-0.5 cm，赶，赶走气泡后快速插上

38、梳子，让胶凝固。走气泡后快速插上梳子，让胶凝固。5.2 待凝胶完全凝固后（约待凝胶完全凝固后（约2030 min），当心），当心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面入电泳缓冲液，让液面高出胶面1 mm左右。左右。:/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳6.加样加样 取待检测样本适量，依据取待检测样本适量，依据5份上样液搭配份上样液搭配1份份 6DNA Loading Buffer的比例混匀（留意不要产的比例混匀（留意不要产生气泡），用微量移液器当心加入样品槽中。每生气泡），用微量移液器

39、当心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。留加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。留意上样时要当心操作，避开损坏凝胶或将样品槽意上样时要当心操作，避开损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。底部凝胶刺穿。:/yrbio 2011年年7月月DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳7.电泳电泳 加完样后马上接通电源。限制电压小于加完样后马上接通电源。限制电压小于8 V/cm，电流在，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动到凝以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶胶2/3时，停止电泳。时，停止电泳。8.成像成像 在紫外透射仪或凝胶成像系统上视察电泳结果。在紫外透射仪或凝胶成像系统上视察电泳结果。保存图像。保存图像。:/yrbio 2011年年7月月内容回顾内容回顾1.基因组基因组DNA提取提取pCTAB法法pSDS法法2.质粒质粒DNA提取提取p碱裂解法（离心柱型）碱裂解法（离心柱型）3.总总RNA提取提取p异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法（苯酚法（TRIzol法）法）4.DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 :/yrbio 2011年年7月月下午试验课（下午试验课（14:30-18:00）质粒质粒DNA提取及琼脂糖电泳分析提取及琼脂糖电泳分析 :/yrbio 2011年年7月月The End！Thank You！Any Questions？:/yrbio