枸杞多糖检测方法的研究优秀PPT.ppt

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1、枸杞多糖检测方法探讨姓名：王畅2010-8-5内容提要内容提要 简简 介介选题背景选题背景研究目的和意义研究目的和意义研究动态与趋势研究动态与趋势拟采取的研究方法拟采取的研究方法枸杞多糖简介l来源：茄科植物枸杞的干燥果实来源：茄科植物枸杞的干燥果实l枸杞多糖（枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）l 简称简称LBP，是以阿拉伯糖、，是以阿拉伯糖、鼠李糖、鼠李糖、木糖、木糖、甘露糖、甘露糖、半半l乳糖、乳糖、葡萄糖与半乳糖醛酸组成的酸性杂多糖同多肽或蛋葡萄糖与半乳糖醛酸组成的酸性杂多糖同多肽或蛋白白l质构成的复合多糖为主质构成的复合多糖为主,还含有中性杂多糖和葡

2、聚糖同多肽还含有中性杂多糖和葡聚糖同多肽或或l蛋白质构成的复合多糖，是自然的大分子物质。蛋白质构成的复合多糖，是自然的大分子物质。Click to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add text白色略带棕色白色略带棕色絮状，纤维状絮状，纤维状无味无味吸湿性吸湿性理化性质（一）性状性状理化性质（二）溶解性 1.溶于水，二甲基亚砜，溶解度随中性单糖含量的削减而降低 2.不溶于高浓度乙醇，乙醚，丙酮，氯仿，正丁醇等有机溶剂理化性

3、质（三）常见的化学性质测定 试验 结果 结论硫酸苯酚反应 阳性 含中性糖 硫酸半胱氨酸 阳性 含半乳糖醛酸卡玛斯亮蓝反应 阳性 含有蛋白质斐林试剂反应 阴性 不含还原糖碘碘化钾反应 阴性 不含有淀粉选题背景（一）l生理活性：增加免疫、抗氧化、抗苍老、抗肿瘤、降血糖血脂、保肝，可作为第三代功能性食品的功能因子l随着生活水平的提高，由以治病为主向防病为主的观念转变，为功能食品的开发带来了良好机遇。功效明确的枸杞多糖符合新一代功能食品的要求，枸杞多糖的探讨将推动枸杞产品向更高层次发展保健食品的区分第一代保健食品：以民间的处方，秘方为基础，依据原材料的功能推断保健品的功能，未经严格的科学检测的保健食品

4、其次代保健食品：经过动物试验和人体试验证明产品具有某项生理调整功能，其平安性，功能性都较为牢靠第三代保健食品：经过进一步的严格试验及审核，除具备其次代产品的要求外，还要明确功能能因子及其结构，含量，作用机理，类似于药品的要求选题背景（二）多糖一般的检测方法概括如下多糖一般的检测方法概括如下:1 将无紫外吸取的多糖与显色剂显色，产生紫外吸取，从而将无紫外吸取的多糖与显色剂显色，产生紫外吸取，从而用紫外法定量用紫外法定量,如硫酸如硫酸-苯酚法、硫酸苯酚法、硫酸-蒽酮法，蒽酮法，3、5-二硝基二硝基水杨酸比色法测定总糖。水杨酸比色法测定总糖。2 干脆测糖法，折光法测定多糖，主要是水溶性糖。原理是用干

5、脆测糖法，折光法测定多糖，主要是水溶性糖。原理是用折射计测得的折射指数值折射计测得的折射指数值(糖度糖度)代表着溶液中可溶性物质的含代表着溶液中可溶性物质的含量凹凸，若溶液中的溶质是糖物质或以糖为主的糖物质量凹凸，若溶液中的溶质是糖物质或以糖为主的糖物质,则折射则折射指数值就反映着糖含量的凹凸。指数值就反映着糖含量的凹凸。3 多糖检测的多糖检测的HPLC法也是基于上面的思路，要么衍生化后使法也是基于上面的思路，要么衍生化后使用紫外或荧光检测器，要么运用通用型检测器，这类检测器用紫外或荧光检测器，要么运用通用型检测器，这类检测器主要有示差检测器。主要有示差检测器。蒽酮-硫酸法多糖在浓硫酸作用下先

6、水解成单糖多糖在浓硫酸作用下先水解成单糖,并快速脱水生成糠醛并快速脱水生成糠醛或羟甲基糠醛或羟甲基糠醛,而生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩而生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合合,形成糠醛的衍生物形成糠醛的衍生物,反应后溶液呈蓝绿色反应后溶液呈蓝绿色 在在620nm处处有最大吸取，有最大吸取，在在 10100ug范围内其颜色的深浅与可溶性范围内其颜色的深浅与可溶性糖质量浓度成正比糖质量浓度成正比 其主要反应式为其主要反应式为选题背景（三）l质量不易限制质量不易限制 枸杞多糖是一个水溶性的大分子物枸杞多糖是一个水溶性的大分子物质质,不能如小分子物质那样不能如小分子物质那样,通过熔点测定、通过熔

7、点测定、元元素分析素分析,四大光谱等鉴定后四大光谱等鉴定后,制定质量标准。制定质量标准。l 分子量测定分子量测定 确定了枸杞多糖的生物活性，分子量确定了枸杞多糖的生物活性，分子量过大不易透过细胞膜，影响活性，分子量小一般过大不易透过细胞膜，影响活性，分子量小一般是没有活性的，因此分子量数据可以作为枸杞多是没有活性的，因此分子量数据可以作为枸杞多糖质量标准的重要指标。糖质量标准的重要指标。l多糖的单糖组成分析多糖的单糖组成分析 是进行多糖质量限制和获得是进行多糖质量限制和获得多糖基本信息的重要环节。单糖组分及其摩尔比多糖基本信息的重要环节。单糖组分及其摩尔比可以作为质量标准的重要指标。可以作为质

8、量标准的重要指标。l分子量测定 高分子物质的分子量测定有渗透压法、蒸气压法,凝胶色谱法、超速离心法等，但已有的报导大多集中在有机溶剂体系的高分子聚合物如各种塑料产品、人工橡胶等，水体系大分子物质如蛋白质、多糖的分子量测定很少报导l单糖组成测定 方法主要有TLC、GC、HPLC、CE等,但是关于枸杞多糖柱前衍生化高效液相色谱法测单糖组成还未见报道。探讨目的建立一个枸杞多糖的质量标准定量鉴别方法：(1)通过HPLC法测定枸杞多糖的分子量(2)通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比在多糖的分子量测定方法、尤其是枸杞多糖的测定方法尚未确立标准，无据可依的状况下，继承传统保健理论的

9、同时结合现代科学检测技术，找出枸杞多糖的最优检测方法，制订枸杞多糖的检测标准，为以后的枸杞多糖检测提炼供应依据。探讨意义探讨意义探讨动态常见的常见的检测方法检测方法化学方法化学方法物理方法物理方法苯酚苯酚-硫酸法，高碘酸氧化，硫酸法，高碘酸氧化，Smith降解，甲基化分析降解，甲基化分析比旋光仪、紫外分光光度计、比旋光仪、紫外分光光度计、红外光谱仪、液相色谱仪、红外光谱仪、液相色谱仪、气相色谱仪、质谱、核磁共振气相色谱仪、质谱、核磁共振从所得到的数据来看，国内对枸杞多糖的分别纯化，含量测定分别提取、从所得到的数据来看，国内对枸杞多糖的分别纯化，含量测定分别提取、分级纯化组分鉴定及其分子量、结构

10、、基本性质等方面有大量成果报道分级纯化组分鉴定及其分子量、结构、基本性质等方面有大量成果报道,但但探讨者所得出的枸杞多糖分子量、组成、结构、等探讨结果各不相同探讨者所得出的枸杞多糖分子量、组成、结构、等探讨结果各不相同枸杞多糖相对分子量的检测方法蒸汽压法凝胶过滤法HPLC渗透压法光散射法粘度法afebcd分子量的测定方法凝胶过滤法1.将已知分子量的葡聚糖标准品进行凝胶层系，洗脱收集，用硫酸-蒽酮法检测多糖，分别求得相应的洗脱体积Ve 2.用蓝色葡聚糖上柱求得外水体积Vo.以Ve/Vo为纵坐标，lgMr为横坐标，得到分子量的标准曲线。3.取枸杞多糖进行一样的操作求得Ve/Vo查标准曲线可求得多糖

11、的分子量相对相对分子量分子量LBP-，LBP-，LBP-，LBP相对分子量均大于200001LBPA3,LBPB1,LBPC2，LBPC4分子量分别分子量分别为为66000，18000，12000，100002Duan 分离得到了分离得到了4 个均一枸杞多糖个均一枸杞多糖,其其分子量在分子量在82115 kDa 之间之间3黄等分离得到三类黄等分离得到三类LbGP，其分子量分别为，其分子量分别为925000，2148000，2370004王建华通过王建华通过SDS-不连续体系凝胶电泳法不连续体系凝胶电泳法测得测得LBP2a分子量为分子量为774825多糖中单糖的组成及其摩尔比的测定方法多糖中单糖

12、的组成及其摩尔比的测定方法对微量物质的检出对微量物质的检出体现了高分辨率的体现了高分辨率的特点，但是所测样特点，但是所测样品具有一定的挥发品具有一定的挥发性，衍生化操作烦性，衍生化操作烦杂、费时杂、费时GC分离速度快，分离分离速度快，分离效果好，重现性好，效果好，重现性好，不破坏样品，前处不破坏样品，前处理简单理简单HPLC操作方便，灵活但操作方便，灵活但是灵敏度不高，对是灵敏度不高，对含量微小的物质不含量微小的物质不易检出，且无法确易检出，且无法确定单糖摩尔比定单糖摩尔比TLC组成成分l单糖：阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖l半乳糖醛酸-硫酸-半胱氨酸反应定性l蛋白质-斐林-酚

13、法枸杞多糖中单糖的组成及其摩尔比名称单糖组成摩尔比LBP-6Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc4.83:0.17：0.23：019:1:1LBP-Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc1:3.15:0.48:0.84:5.17:4.13LBP-Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc1:3.57:0.02:0.22:1.53:1.03LBP-Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.43:4.22:0.95:0.38:0.38:1LBP-Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.53:3.57:1.33:0.29:1:0.86蛋白多蛋白多糖糖GAra：

14、Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.8:0.2:0.08:0.2:2.6:1.0LBP-VAra：Gal：Glc2.5:1.0:10LBNPAra：Xyl：Man：Gal：Glc1.0：10.0：1.0:6.7:4.0LBPC2Xyl：Rha：Man8.8：2.3：1LBPC4Glc红外光谱法红外光谱法方法：方法：KBr压片法压片法 波长范围：波长范围：4000650cm-1目的：主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官目的：主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团。能团。枸杞多糖常见官能团红外光谱解析紫外检测在在200nm处有多糖处有多糖的特征吸取峰的特征吸取峰 在在260nm

15、处没有吸取峰，处没有吸取峰，说明不含核酸说明不含核酸在在280nm处吸取峰不明显，处吸取峰不明显，说明蛋白质含量低说明蛋白质含量低发展趋势1)枸杞多糖结构与活性、功能的关系方面得到明确，市场上将有更多以枸杞多糖为主要成分的新药，并且都是接受现代生物技术，从分子、细胞、器官等分子生物水平上探讨活性因子的结构、含量及其作用机理，精确评价其功效。2）因为有统一的质量标准，明确的结构证明其新颖 性，创新性，好用性，中国除了主要围绕枸杞多糖的提取方法、纯化工艺、分别技术、制备治疗脂肪肝胃溃疡药物应用等专利以外，还将得到更多关于枸杞多糖的组分结构、作用机制、药理功效等方面的专利。拟实行的探讨方法及可行性分

16、析(1)通过通过HPLC法测定枸杞多糖的分子量法测定枸杞多糖的分子量 可行性分析：严邦干曾接受此法测定香菇可行性分析：严邦干曾接受此法测定香菇多糖的分子量，该方法较其他多糖测定法多糖的分子量，该方法较其他多糖测定法具有快速，简便，精确的特点，是目前较具有快速，简便，精确的特点，是目前较为行之有效的测定方法为行之有效的测定方法.(2)通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞通过柱前衍生化高效液相色谱法测定枸杞多糖的单糖组成及其摩尔比多糖的单糖组成及其摩尔比 可行性分析：接受可行性分析：接受 3-甲基甲基-1-苯基苯基-2-吡唑啉吡唑啉酮酮(PMP)在碱性条件下与单糖定量缩合生成在碱性条件下与单糖定量

17、缩合生成单糖单糖PMP 衍生物衍生物,用常规的紫外检测器和用常规的紫外检测器和 C18烷基键合柱烷基键合柱,建立适于多糖单糖组成测建立适于多糖单糖组成测定的定的 HPLC新方法新方法,达到灵敏、快速、精确、达到灵敏、快速、精确、便利和可在线大批量分析的目标。便利和可在线大批量分析的目标。HPLC法测分子量色谱柱：色谱柱：protein kw-804检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器温度：室温温度：室温流淌相：醋酸钠缓冲溶液流淌相：醋酸钠缓冲溶液以不同分子质量的标准右旋糖酐分子的分别保留以不同分子质量的标准右旋糖酐分子的分别保留时间与相应的分子质量建立分子质量对数值绘制时间与相应的分子

18、质量建立分子质量对数值绘制标准坐标曲线，待测得枸杞多糖经分别后得到不标准坐标曲线，待测得枸杞多糖经分别后得到不同分子质量峰的保留时间值，通过标准曲线即可同分子质量峰的保留时间值，通过标准曲线即可计算枸杞多糖的分子质量分布（由分子质量计算计算枸杞多糖的分子质量分布（由分子质量计算协助软件自行运行）协助软件自行运行）HPLC检测单糖组分和含量干脆进样检测：柱子：carbohydrate 柱 氨基键合相柱（Spherisorb NH2，Hypersil NH2）检测器：示差检测器缺点：柱子成本高，氨基键合柱易与还原糖生成希夫碱，缩短柱子的寿命示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱柱前衍生化HPLC测枸

19、杞多糖中的单糖组成前处理：1.样品水解：a.硫酸适合于中性糖的水解b.三氟醋酸适用于植物细胞壁多糖，糖蛋白，糖胺聚糖的水解（1）多糖的水解常用硫酸，其用量不易限制，过多会导致多糖样品的炭化，而产生杂质峰，过少又会水解不完全。本法接受三氟醋酸可较好的实现多糖的水解。（2）试验中要尽量削减样品的水分含量，以免影响衍生化的结果，在衍生化时，适当加大无水醋酸酐的用量也可减小水分的影响。柱前衍生化1.糖类衍生的试剂：2-氨基苯甲酸、对甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、对硝基苯甲酰氯 和3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)2.步骤：a.比照品各种单糖标准品Ara，Rha，Xyl，Man，Gal

20、，Glc，Fuc按等量混合衍生化b.枸杞多糖水解液衍生化柱前衍生化反应PMP的优点：PMP与糖类物质衍生时反应条件温顺,产物无立体异构。两分子PMP 与一分子单糖缩合，生成的衍生物与各单糖的定量关系明确，线性关系良好。检测灵敏度较高,可同时检测醛糖、酮糖及糖醛酸PMP衍生物在 250 nm处有猛烈的紫外吸取，克服了单糖本身没有紫外吸取的特点，同时运用紫外检测器克服了示差检测器灵敏度低，不适用于梯度洗脱的缺点。HPLC色谱条件色谱柱：C18色谱柱检测器：紫外检测器 检测波长：250nm柱温：室温 进样量：20ul流淌相(流速：1.2ml/min)溶剂A：15%乙腈+20mm/L乙酸铵水溶液溶剂B

21、:40%乙腈+20mm/L乙酸铵水溶液梯度模式：时间梯度：0min25min50min浓度梯度：0%50%100%溶剂B多糖组成分析及计算方法计算校正因子fx=（mx/Ax）/(mfuc/Afuc)计算样品中各种单糖的比例：m1:m2:m3.mn=A1f1:A2f2:A3f3.AnfnAx,Afuc分别为比照品单糖x衍生物，内标衍生物的峰面积;mx,mfuc分别为比照品单糖x衍生物，内标衍生物的浓度（mmol/L）方法学的考察线性范围：取5种不同浓度的标准样品混合液衍生化，进样记录色谱图，看浓度和峰面积的线性关系精密度试验：取标准单糖混合液衍生化连续进样5次，测各单糖面积之比的进样精密度稳定性试验：取枸杞多糖水解液衍生化后的溶液隔两小时进样一次，记录峰面积，测相对误差重复性试验：取枸杞多糖，依前述衍生化和色谱条件，重复测定几次，看相对误差指纹图谱的相像度评价将不同产地的枸杞多糖依据相同方法制备供试品溶液，分别进样记录色谱图。比较各产地的枸杞中提取的枸杞多糖，确定了共有的指纹峰，并通过比照品的色谱图，确定了主要的指纹峰接受由国家药典委员会制定的中药色谱相像度评价系统计算软件分析，将全谱导入后，经谱图处理，以软件自动生成的比照图谱为参照图谱，多点校正将谱峰进行比较，得到的相像度结果，查看各样品的相关性和区分。谢谢！谢谢！Q Q:954570564 TEL:13604512801