牛病毒性腹泻与粘膜病.ppt

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1、牛病毒性腹泻与黏膜病牛病毒性腹泻与黏膜病 牛牛病病毒毒性性腹腹泻泻，又又称称牛牛病病毒毒性性腹腹泻泻/粘粘膜膜病病，是是由由BVDV引引起起的的，主主要要侵侵害害牛牛、羊羊、鹿鹿、牦牦牛牛等等反反刍刍动动物物及及猪猪的的一一种种重重要要传传染染病病。临临床床主主要要表表现现为为发发热热、粘粘膜膜糜糜烂烂、溃溃疡疡、白白细细胞胞削削减减、持持续续感感染染、咳咳嗽嗽及及怀怀孕孕母母牛牛流流产产或或产产生生畸畸形形胎胎儿儿。同同一一种种病病原原引引起起的的多多种种病状的传染病病状的传染病 我我国国1980年年李李佑佑民民首首从从国国外外进进口口奶奶牛牛分分别别出出BVDV；上上世世纪纪90年年头头郑

2、郑志志刚刚等等在在全全国国范范围围内内调调查查，BVDV平平均均阳阳性性率率为为19.56%，近近年年来本病在国内阳性检出率呈逐年上涨的趋势。本病给养牛业造成明显损失（产乳来本病在国内阳性检出率呈逐年上涨的趋势。本病给养牛业造成明显损失（产乳、重、重、流产等）。、流产等）。牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻1BVDVBVDV的流行病学的流行病学 2BVDVBVDV的病原学的病原学 3BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白4BVDVBVDV的探讨进展的探讨进展 内容摘要内容摘要56BVDVBVDV的防治的防治 BVDVBVDV的主要诊断方法的主要诊断方法 BVDVBVDV的流行病学的流行病学

3、传传 染染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。源：病牛和带毒牛是主要传染源。传传播播途途径径：主主要要通通过过消消化化道道和和呼呼吸吸道道传传播播；干干脆脆或或间间接接接接触触也也可可以以传传播播；吸吸血血昆昆虫虫也也是是重重要要的的传传播播媒介。媒介。易易感感动动物物：主主要要感感染染牛牛（肉肉牛牛、奶奶牛牛），也也可可感感染染猪。猪。本本病病多多发发于于寒寒冷冷季季节节，过过分分拥拥挤挤可可促促进进本本病病发发生。生。BVDVBVDV的病原学的病原学属属黄黄病毒科、病毒科、瘟病毒属瘟病毒属有囊膜，直径有囊膜，直径2525-3030nmnm，正链正链RNARNA胎胎牛牛肾肾、睾睾丸丸、猪猪肾肾、

4、胎胎羊羊睾睾丸丸可可增增殖殖传传代代 BVDVBVDV。BVDV BVDV 可可以以分分成成致致细细胞胞病病变变型（型（CPCP）和非致细胞病变型（）和非致细胞病变型（NCPNCP）。）。BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白 5-Npro 5-Npro（P20P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-C(P14)-Erns(gp48)-E1(gp25)-E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B E2(gp53)-P7-NS2-3(P125)-NS4A(P10)-NS4B(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-

5、3(P30)-NS5A(P58)-NS5B(P75)-3,其中其中C C，E ERNSRNS，E1E1，E2E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。BVDVBVDV的主要基因、蛋白探讨进展的主要基因、蛋白探讨进展BVDV核衣壳组成成核衣壳组成成分，具有免疫分，具有免疫原性原性 BVDV BVDV 基因组基因组具有较高的保具有较高的保守性守性瘟病毒属内高度瘟病毒属内高度保守，在病毒复保守，在病毒复制、病毒制、病毒RNARNA转转译或者病毒多聚译或者病毒多聚蛋白加工过程中蛋白加工过程中具有重要作用具有重要作用5-UTR5-UTRC CNS3NS3E ERNSRNS

6、内有一高度保内有一高度保守结构域，可守结构域，可用于探讨亚单用于探讨亚单位疫苗，也可位疫苗，也可作为基因工程作为基因工程诊断抗原诊断抗原E2与抗与抗BVDV抗体结合、抗体结合、介导免疫中和反应及介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸与宿主细胞识别、吸附的主要部位附的主要部位Npro具有自体蛋白酶活性具有自体蛋白酶活性，有较高的保守，可以对有较高的保守，可以对瘟病毒进行种、群或型瘟病毒进行种、群或型的鉴定的鉴定v5-UTR5-UTR：55末端无甲基化的末端无甲基化的“帽子帽子”结构，结构，5-5-UTRUTR序列在序列在BVDVBVDV的各毒株间有较高的保守性，因此的各毒株间有较高的保守性，因此常

7、依据常依据5-UTR5-UTR的序列设计引物来检测的序列设计引物来检测 BVDV BVDV或对或对 BVDV BVDV 进行分型。进行分型。5-UTR 5-UTR 在病毒转录、翻译过程在病毒转录、翻译过程中起重要的作用。中起重要的作用。v20102010年张兴娟等分别用年张兴娟等分别用5-UTR5-UTR设计一对引物，设计一对引物，预扩增片段预扩增片段125bp125bp；20102010年孟雨等人也利用年孟雨等人也利用5-UTR5-UTR设计一对引物，预扩增片段设计一对引物，预扩增片段218bp218bp，试验证明利用，试验证明利用5-UTR5-UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性。设计引

8、物具有很好的特异性和敏感性。vE2E2：是：是BVDVBVDV的主要爱护性抗原，能诱导机体产生中和的主要爱护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，所以新型疫苗都是针对抗体，所以新型疫苗都是针对E2E2结构蛋白的。也是与结构蛋白的。也是与抗抗 BVDV BVDV 抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位，识别、吸附的主要部位，E2 E2 基因始终是国内外学者探基因始终是国内外学者探讨瘟病毒的重点。讨瘟病毒的重点。vE2 E2 是形成是形成 BVD BVD 基因工程疫苗的最好的选择。基因工程疫苗的最好的选择。vBVDV E2 DNA BVDV E2

9、 DNA 疫苗是近年来疫苗是近年来 BVDV BVDV 免疫探讨的热点。免疫探讨的热点。如如20072007吴明福等构建真核表达质粒吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-E2 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可诱导小鼠产生确定程度的体液和细胞并免疫小鼠，可诱导小鼠产生确定程度的体液和细胞免疫应答。免疫应答。vNS-3NS-3：NS3NS3区域与病毒的毒力，生长特性有关。区域与病毒的毒力，生长特性有关。NS3NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、病毒毒RNARNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作

10、用。重要作用。NS3NS3的表达与宿主细胞的表达与宿主细胞CPECPE的产生有的产生有亲密关系。亲密关系。v20092009年魏伟等用年魏伟等用BVDV NS3 BVDV NS3 蛋白中有免疫反应蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV BVDV 抗体检测的间接抗体检测的间接 ELISA ELISA 方法。方法。血清学诊断血清学诊断免疫学诊断免疫学诊断诊断方法的进展诊断方法的进展分子生物学诊断分子生物学诊断1 12 23 3血清学诊断血清学诊断 常见的方法为主要包括血清中和试验常见的方法为主要包括血清中和试验和琼脂扩散试验两种。和琼脂扩

11、散试验两种。琼脂扩散试验精确性较低，检出的结果琼脂扩散试验精确性较低，检出的结果常常有假阳性。常常有假阳性。血清中和试验重复性高，精确性好，已作血清中和试验重复性高，精确性好，已作为为 BVDV BVDV 诊断的诊断的“金标准金标准”，但血清中和试，但血清中和试验在基层运用时，常遇到费时、费劲，须要验在基层运用时，常遇到费时、费劲，须要细胞培育等试验室技术问题，无法得到推广。细胞培育等试验室技术问题，无法得到推广。免疫学诊断免疫学诊断酶联免疫吸酶联免疫吸附试验附试验（ELISAELISA）免疫荧光技免疫荧光技术（术（IFAIFA）免疫过氧化免疫过氧化物酶技术物酶技术（IPIP）免疫荧光技术免疫

12、荧光技术（IFAIFA）免疫荧光技术（IFA）又称荧光抗体技术，可用于检测细胞培育物以及病变组织的冰冻切片中 BVDV 感染状况。免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它须要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。ELISA ELISA 常被用于检测组织器官培育物中常被用于检测组织器官培育物中 BVDV，监测牛群中，监测牛群中 BVD 抗体水平，抗体水平，评估潜藏感染状况。其中最常用的是双抗夹心评估潜藏感染状况。其中最常用的是双抗夹心 ELISA 和间接和间接 ELISA，也有运用，也有运用 BVDV 单克隆抗体与单克隆抗体与 ELISA 联合诊断联合诊断 BVD。探讨较多的探讨较多的IBRV诊

13、断蛋白有诊断蛋白有NS3，E2蛋白蛋白酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISAELISAELISA）免疫过氧化物酶技术（免疫过氧化物酶技术（IP）诊断）诊断 BVDV 精确、牢靠，可用于了解精确、牢靠，可用于了解 BVD 的的总体分布状况。链酶亲和素总体分布状况。链酶亲和素-生物素过氧生物素过氧化物酶检测方法，可以用来检测福尔马化物酶检测方法，可以用来检测福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的林固定、石蜡包埋组织切片中的BVDV。近年来，为了避近年来，为了避开非特异性染色反开非特异性染色反应，则可以运用单应，则可以运用单克隆抗体克隆抗体+生物素化

14、生物素化抗鼠抗体抗鼠抗体-链酶亲和链酶亲和素过氧化物酶检测素过氧化物酶检测方法。方法。免疫过氧化物酶技术免疫过氧化物酶技术（IPIP）分子生物学诊断分子生物学诊断RT-PCR核酸探针检测核酸探针检测1 12 2RT-PCR RTPCR RTPCR 是目前广泛应用的分子是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测生物学技术，对于检测 BVDV BVDV 的的 RNA RNA 是一个合适的方法。依据是一个合适的方法。依据 BVDV BVDV 基因基因组序列合成一对或几对特异性引物，组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测出器官、可以高度特异、敏感的检测出器官、组织、细胞培育物中的组织、

15、细胞培育物中的 BVDV BVDV，并可，并可区分区分 CSFV CSFV、BDVBDV，还可对，还可对 BVDV BVDV 的基的基因型和生物型作进一步的鉴定因型和生物型作进一步的鉴定 PCRPCR引物多数选在引物多数选在BVDVBVDV保守区保守区5-UTR5-UTR和和NS3NS3基因内，尤其基因内，尤其5UTR5UTR是是BVDVBVDV进行鉴定、进行鉴定、基因分型的首选区域。基因分型的首选区域。20072007年年王伟利建立了王伟利建立了 BVDV BVDV 荧光荧光 RT-RT-PCR PCR 检测方法并进行了初步应用，检测方法并进行了初步应用，20072007年年国家质量监督检验

16、检疫局制定了牛病毒性国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性腹泻腹泻/黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程核酸探针检测（核酸探针检测（NAH）与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而且应用很广泛，NAH 可干脆检测脏器组织和血细胞中的 BVDV。NAH 技术应用最广泛的是核酸标记法，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射性同位素（如 32P，35S）标记的 DNA 探针，另一类是用如地高辛、生物素标记的 DNA 探针。核酸探针技术标记简洁，特异性好，可长期保存，并且可以回收利用，制成试剂盒，是一种平安、快速、经济的诊断方法。预防和限制预防和限制免疫预防和药物治疗免疫预防和药物治疗健全完善健全完善 BVD BVD 检测体系，加强检测牛群及检测体系，加强检测牛群及牛源生物制品的牛源生物制品的 BVDV BVDV 污染状况污染状况解除掉持续性感染牛等隐性感染动物解除掉持续性感染牛等隐性感染动物加强环境监控，在饲养环节加强管理，建加强环境监控，在饲养环节加强管理，建立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养实施免疫预防、过度到捕杀根除程序实施免疫预防、过度到捕杀根除程序