生产菌种的培养与保存资料优秀PPT.ppt

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1、第四章第四章 生产菌种的制备和保藏生产菌种的制备和保藏生产菌种的制备过程生产菌种的制备过程生产菌种的保藏生产菌种的保藏生产菌种的质量限制生产菌种的质量限制1 1 1 第一节第一节 生产菌种的制备过程生产菌种的制备过程菌种菌种 母斜面母斜面 子斜面子斜面 摇瓶菌丝摇瓶菌丝 种子罐种子罐 发酵罐发酵罐 试验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培育箱、摇试验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培育箱、摇床等试验室常见设备，在工厂这些培育过程一般都在床等试验室常见设备，在工厂这些培育过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培育过程称为试验室菌种室完成，因此现象地将这些培育过程称为试验室阶段的种子培育。阶段的种

2、子培育。生产车间阶段：种子培育在种子罐里面进行，一般在生产车间阶段：种子培育在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培育过程工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培育过程为生产车间阶段。为生产车间阶段。种种子子扩扩大大培培育育是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培育育,最最终终获获得得确确定定数数量量和和质质量量的的纯纯种过程。这些纯种培育物称为种子。种过程。这些纯种培育物称为种子。种子扩培的目的种子扩培

3、的目的q 接种量的须要接种量的须要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够快速生长活力强，移种至发酵后，能够快速生长q 无杂菌污染无杂菌污染一、孢子的制备一、孢子的制备放线菌孢子的制备：放线菌孢子的制备：养分要求：养分物质含量要低，特殊是氮源养分要求：养分物质含量要低，特殊是氮源 培育基：琼脂斜面培育基培育基：琼脂斜面培育基 培育温度：培育温度：2837 培育时间：培育时间：514天天 斜面含水量：低斜面含

4、水量：低 棒状链霉菌成熟单菌落生棒状链霉菌成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形，长丰满，紧密，菌落呈草帽形，中间突起，气生菌丝颜色为白中间突起，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子为都不产生可溶性色素，孢子为暗灰绿色，成熟后，孢子易于暗灰绿色，成熟后，孢子易于刮下刮下 棒状链霉菌动身菌株单菌落形态特征棒状链霉菌动身菌株单菌落形态特征 棒状链霉菌斜面一棒状链霉菌斜面一般培育四到五天左右产生般培育四到五天左右产生孢子，六到七天斜面孢子孢子，六到七天斜面孢子生长成熟，气生菌丝颜色生长成熟，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝由浅黄为白色，基内菌丝由浅

5、黄到灰黄，都不产生可溶性到灰黄，都不产生可溶性色素，孢子呈暗灰绿色色素，孢子呈暗灰绿色 棒状链霉菌动身菌株的斜面培育特征棒状链霉菌动身菌株的斜面培育特征 霉菌孢子的制备：霉菌孢子的制备：养分要求：碳、氮含量要低，无机盐适养分要求：碳、氮含量要低，无机盐适量量 培育基：自然农产品培育基：自然农产品 培育温度：培育温度：2528 培育时间：培育时间：414天天 细菌种子的制备：细菌种子的制备：养分要求：养分丰富，氮源含量要高养分要求：养分丰富，氮源含量要高 培育基：牛肉膏、蛋白胨培育基：牛肉膏、蛋白胨 培育温度：培育温度：37 培育时间：培育时间：12天（芽孢天（芽孢58天）天）二、摇瓶种子的制备

6、二、摇瓶种子的制备一级摇瓶一级摇瓶 二级摇瓶二级摇瓶 种子罐种子罐三、种子罐种子的制备三、种子罐种子的制备一级种子罐一级种子罐 二级种子罐二级种子罐 发酵罐（三级发酵）发酵罐（三级发酵）级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积级数的确定：菌种的特性；发酵罐的体积谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子（小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子（小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培育起先计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐起先计算发酵级数。发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受发酵规模

7、、菌体生长特性、接种量的影响级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响q 级数大，难限制、易染菌、易变异，管理困难，一级数大，难限制、易染菌、易变异，管理困难，一q 般般2-4级。级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是特别重要q 的一个方面四、四、种子制备过程举例种子制备过程举例1、谷氨酸生产的种子制备、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培育一级种子培育二级种子培育二级种子培育发酵发酵斜面斜面(AS1.299)培育基：蛋白胨培育基：蛋白胨1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠0.5培育基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培育基特点：有利于菌体的生长，原料比较

8、精细培育条件：培育条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长良好，所运用斜面连续传代不超生长斜面要求：生长良好，所运用斜面连续传代不超过过3次次一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培育条件：于培育条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培养养12小时小时培育基：葡萄糖培育基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培育基特点：有利于菌体的生长，所运用的原料已经基培育基特点：有利于菌体的生长，所运用的原料已经基 本接近于发酵培育基本接近于发酵培育基二级种子二级种子(种子罐种子罐)培育条件：在种子罐中培育（容积为发酵

9、罐的培育条件：在种子罐中培育（容积为发酵罐的1%），），32培育培育7-10个小时个小时培育基：和一级种子相像，其中葡萄糖用水解糖代替，培育基：和一级种子相像，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培育基的特点：长菌体，更接近于发酵培育基培育基的特点：长菌体，更接近于发酵培育基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小匀整，呈单个或八字排列大小匀整，呈单个或八字排列活力旺盛活力旺盛2、青霉素生产的种子制备、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵斜面孢子斜面孢子培育基：甘油、培育基

10、：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培育基特点：有利于长孢子，用量少而精细培育基特点：有利于长孢子，用量少而精细培育条件：培育条件：25、7天天,留意湿度留意湿度50%左右左右大米孢子大米孢子培育基：大米及氮源（玉米浆）培育基：大米及氮源（玉米浆）培育基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表培育基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，养分适当（要求大米面积和氧的传质，养分适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培育条件：培育条件：25、7天，限制湿度天，限制湿度大米孢子的要求：大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子一级种子

11、一级种子培育基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培育基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体目的：长菌体培育条件：培育条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨二级种子二级种子培育基：同上培育基：同上培育条件：培育条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期，4-6期合成青霉素的实力最强期合成青霉素的实力最强其次节其次节 生产菌种的质量限制生产菌种的

12、质量限制一、影响孢子质量的因素一、影响孢子质量的因素1.培育基培育基养分成分养分成分灭菌的质量灭菌的质量斜面培育基的含水量斜面培育基的含水量2.培育温度和湿度的影响培育温度和湿度的影响 菌体生长温度范围宽些菌体生长温度范围宽些2837 ，孢子，孢子形成温度窄形成温度窄27、283.培育时间培育时间 过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡过短：孢子不成熟；低温保藏时、易死亡 过长：菌体代谢活力降低，产量低过长：菌体代谢活力降低，产量低4.保藏时间保藏时间 一般不超过一星期一般不超过一星期5.接种量接种量 在母斜面上形成单菌落，在子斜面上在母斜面上形成单菌落，在子斜面上形成一层菌落形成一层菌落二、影

13、响种子质量的因素及限制措施二、影响种子质量的因素及限制措施1.影响因素：影响因素：培育基培育基培育条件培育条件培育时间培育时间 最适种龄：对数生长期后期最适种龄：对数生长期后期 种龄是指种子罐中培育的菌体起先移入种龄是指种子罐中培育的菌体起先移入下一级种子罐或发酵罐时的培育时间。下一级种子罐或发酵罐时的培育时间。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由试验结果定。相对较大，但是最终由试验结果定。菌龄过小：延迟期长，菌体生长缓慢，生物菌龄过小：延迟期长，菌体生长缓慢，生物合成期缩短，产量降低合成期缩短，产量降低种龄长：易老化种龄长：易老

14、化接种量接种量 接入种子液的体积接入种子液的体积 接入后培育液体积接入后培育液体积 接种量范围：接种量范围：125%，但是一般认为大一点好，但是一般认为大一点好 过大：菌体过度生长，养分物质及溶氧不能满足过大：菌体过度生长，养分物质及溶氧不能满足 菌体须要，使菌体苍老、自溶菌体须要，使菌体苍老、自溶 过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低过小：生产期延长，以产生菌丝结团，产量降低接种量接种量=100%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。2.种子质量的限制指

15、标种子质量的限制指标菌体的形态菌体的形态碳、氮、磷的代谢状况碳、氮、磷的代谢状况菌株的生产实力菌株的生产实力特殊酶活力特殊酶活力3.种子异样分析种子异样分析菌丝生长过慢：培育基质量不好；灭菌质量菌丝生长过慢：培育基质量不好；灭菌质量 不好；通入空气的温度过低不好；通入空气的温度过低菌丝结团：接种量小；培育基粘度不当；搅菌丝结团：接种量小；培育基粘度不当；搅 拌不好拌不好菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多菌丝粘壁：搅拌不好；装料系数少；泡沫多第三节第三节 生产菌种的保藏生产菌种的保藏一、微生物菌种的保藏要求一、微生物菌种的保藏要求要求：要求：是是广广泛泛收收集集各各种种探探讨讨、教教学学和和

16、生生产产性性菌菌种种，满足各方面需求；满足各方面需求；高高质质量量保保藏藏，即即要要求求保保藏藏的的菌菌种种不不死死亡亡、活活性不苍老、特性不变异、分类不紊乱；性不苍老、特性不变异、分类不紊乱；随随时时可可供供应应保保持持有有原原始始特特性性的的菌菌种种用用于于交交换换和运用。和运用。二、菌种保藏原理二、菌种保藏原理原理：原理：将将微微生生物物菌菌种种保保存存在在不不利利于于微微生生物物活活跃跃生生长长和和代代谢谢的的不不良良环环境境中中，如如干干燥燥、低低温温、缺缺氧氧、黑黑暗暗、养养分分饥饥饿饿等等等等，使使微微生生物物代代谢谢速速率率极极为为缓缓慢慢或或处处于于休休眠眠状状态。态。而而一

17、一旦旦复复原原所所保保存存菌菌种种生生长长的的正正常常环环境境和和养养分分条条件件，即即可可获获得得具具有有高高生生理理活活性性和和保保持持原原种种优优良良性性状状的的菌种培育物。菌种培育物。三、微生物菌种保藏的常用方法三、微生物菌种保藏的常用方法菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：1 1、斜面低温保藏法、斜面低温保藏法 2 2、液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法 3 3、沙土管保藏法沙土管保藏法 4 4、甘油低温保存法、甘油低温保存法 5 5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 6 6、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法1 1、斜面低温保藏法

18、、斜面低温保藏法 4 4保存，保存，13月月2 2、液体石蜡封藏法液体石蜡封藏法石蜡石蜡灭菌灭菌冷却冷却加入试管中加入试管中 3 3、沙土管保藏法沙土管保藏法 1mol/L酸洗酸洗 1mol/L碱洗碱洗 蒸馏水洗蒸馏水洗 烘干烘干 过筛过筛 混合（混合（3：2或或1：1）分装沙土管分装沙土管 干接法：接孢子后，低温抽真空干接法：接孢子后，低温抽真空 湿接法：湿接法：接孢子悬液后，低温抽真空接孢子悬液后，低温抽真空取沙取沙取土取土（沙（沙:2040目）目）（土（土:4060目）目）4 4、甘油低温保藏法甘油低温保藏法 等体积混合等体积混合 -20以下保存以下保存孢子悬液或菌体孢子悬液或菌体304

19、0%甘油甘油 假如待保藏菌种生长在斜面上，则可用含假如待保藏菌种生长在斜面上，则可用含1010甘甘油的新配制液体培育基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻油的新配制液体培育基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般限制在速度一般限制在1-21-2minmin。若干细菌和真菌菌种可。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏通过此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培育物干燥。此法是微生物菌种水分升华，使培育物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必需运用冷

20、冻爱护剂，目冷冻干燥过程中必需运用冷冻爱护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丢失活力。而且经冻干后的菌株年之久而不丢失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。无需进行冷冻保藏，便于运输。5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 等体积混合等体积混合 分装冻干管分装冻干管 冷冻至冷冻至15 以下以下 抽真空抽真空 封口封口 低温保存低温保存脱脂牛奶脱脂牛奶孢子悬液（洗净）孢子悬液（洗净）冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生

21、1保藏：冷冻干燥后的培育物在低于保藏：冷冻干燥后的培育物在低于5下保藏。较低的保藏温度下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培育物的长期稳定更好。对于培育物的长期稳定更好。2复苏：复苏：(1)在超净工作台中用在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.51ml养分液体培育基，渐渐旋转安瓿。然养分液体培育基，渐渐旋转安瓿。然后将此转接到一含有再生培育基的无菌试管中，或干脆接种琼脂斜后将此转接到一

22、含有再生培育基的无菌试管中，或干脆接种琼脂斜面或涂布平板。面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此干脆振落入盛有在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此干脆振落入盛有l2ml液体培育基的试管中，轻轻振荡液体培育基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液，然后用此悬液接种适宜的再生培育基。接种适宜的再生培育基。6 6、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法 10%甘油悬液甘油悬液 降温至降温至0 缓慢降温至缓慢降温至-35 放入液氮缸中放入液氮缸中 液相：液相：-196 （气相：气相：-150 ）孢子悬液、孢子悬液、(一一)冷冻爱护剂冷冻爱护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻

23、爱在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻爱护剂是二甲亚砜和甘油，最终运用浓度一护剂是二甲亚砜和甘油，最终运用浓度一般为甘油般为甘油10、二甲亚砜、二甲亚砜5。所运用的。所运用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。好为过滤灭菌。(二二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1待冷冻保藏菌种悬液的制备待冷冻保藏菌种悬液的制备(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含含10甘油的养分液体培育；吹吸斜甘油的养分液体培育；吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；面制成孢子及菌体细胞悬液；0.51ml分分装玻璃安瓿

24、或液氮冷藏专用塑料瓶，装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，(2)从浸没培育物制备菌悬液：在浸没培育液从浸没培育物制备菌悬液：在浸没培育液中加入等体积中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混无菌甘油；轻轻振荡混匀培育液，假如菌体絮凝较紧，则需先用玻匀培育液，假如菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将全部封好的安瓿置于将全部封好的安瓿置于5冰箱中冰箱中3min，以使细胞和悬浮培育基之间达到平衡。以使细胞和悬浮培育基之间达到平衡。2控速冷冻控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置

25、于铝盒或布袋中，然后置于一较大将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点温度之上几度的细胞冻结点(通常为通常为-30)；(4)补加确定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可补加确定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达，直到温度达-50；(6)将安瓿快速移入液氮

26、罐中于液相将安瓿快速移入液氮罐中于液相(-196)或或 气相气相(-156)中保存。假如无控速冷冻机，则一般可将安瓿中保存。假如无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于或液氮瓶置于-70冰箱中冷冻冰箱中冷冻4h，然后快速移入液氮，然后快速移入液氮罐中保存。罐中保存。(三三)复苏复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，马上置于冰浴从液氮罐中取出所需的安瓿，马上置于冰浴中；中；2快速将安瓿置于快速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇水浴中，并轻轻摇动以加速解冻；动以加速解冻；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培育物移接入含有用巴氏吸管将安瓿中贮存培育物移接入含有2ml无菌液体培育基的试管中，用同一支吸管无菌液体培

27、育基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约约4、8滴滴)转接入琼脂斜面上。转接入琼脂斜面上。常用菌种保藏方法的比较常用菌种保藏方法的比较方法方法原理原理适宜菌种适宜菌种保藏时间保藏时间特点特点冰箱低温冰箱低温（4 4）低温低温各大类微生物各大类微生物3-63-6个月个月简便简便石蜡油封藏石蜡油封藏低温、缺氧低温、缺氧各大类微生物各大类微生物1-21-2年年简便简便砂土保藏砂土保藏干燥、无营干燥、无营养养产芽孢细菌、产芽孢细菌、产孢子的放线产孢子的放线菌、霉菌菌、霉菌1-101-10年年简便有效简便有效冷冻干燥保藏冷冻干燥保藏 干燥、低温、干燥、低温

28、、无氧无氧各大类微生物各大类微生物5-155-15年以上年以上繁而高效繁而高效基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏 由载体质粒等携带的外源由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。为宿主细胞生长非必需。一般状况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加一般状况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。快。当培育基中加入抗生素时，抗生素供应了一有利于当培育基中加入抗生素时，抗生素供应了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运携带质粒的细胞群体的极有用的生长选

29、择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培育基建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培育基中。中。四、菌种保藏的留意事项四、菌种保藏的留意事项1、菌种在保藏前的生理状态、菌种在保藏前的生理状态 孢子不成熟：经不起冷冻过程、死亡率高孢子不成熟：经不起冷冻过程、死亡率高 孢子过分成熟：活力降低、产量下降孢子过分成熟：活力降低、产量下降2、保藏菌种所用的介质、保藏菌种所用的介质 斜面养分成分要低；斜面养分成分要低；冻干管中的牛奶要脱脂；冻干管

30、中的牛奶要脱脂；沙土管中的有机物要少沙土管中的有机物要少3、保藏过程中的操作方法、保藏过程中的操作方法 甘油保存时要速冻；甘油保存时要速冻；液氮保存时慢冻速溶液氮保存时慢冻速溶 4、经过一次解冻的菌株培育物不宜再用、经过一次解冻的菌株培育物不宜再用来保藏。来保藏。五、保藏菌种的活化五、保藏菌种的活化 保藏菌种的活化是运用保藏菌种的第一步。保藏菌种的活化是运用保藏菌种的第一步。活活化化的的要要求求是是使使保保藏藏菌菌种种复复原原旺旺盛盛的的生生命命活活动和显示其原有的代谢和生产性能。动和显示其原有的代谢和生产性能。运运用用保保藏藏菌菌种种时时运运用用的的相相同同培培育育基基和和培培育育条条件件，或或以以保保藏藏菌菌种种生生长长和和代代谢谢最最佳佳的的培培育育基基和和培培育育条条件件，以以使使保保藏藏菌菌种种能能快快速速复复原原其其原原有有的的代代谢谢速率和生理特性。速率和生理特性。菌种复壮的方法：菌种复壮的方法：自然选育自然选育 淘汰衰退个体淘汰衰退个体 选择合适培育条件选择合适培育条件