最新微生物学第八章微生物与基因工程PPT课件.ppt

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1、微生物学第八章微生物与基因工程基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。一、微生物与克隆载体克隆载体（cloningvector）：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体将其运送到细胞中并进行复制和扩增。这种以扩增外源基因为目的的载体称为克隆载体。l把把一一个个有有用用的的目目的的DNA片片段段通通过过重重组组DNA技技术术，送送进进受受体体细细胞中去胞中去进进行繁殖和表达的工具叫行繁殖

2、和表达的工具叫载载体（体（vector）。）。作为克隆载体的条件是：载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个复制子；载体必须具有若干个限制酶的单一切割位点，便于外源基因的插入。并且这些酶切位点应位于载体复制的非必要去，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍能进行正常的复制。载体必须具有可供选择的遗传标记。如抗生素的抗性基因等。l基基因因工工程程中中使使用用的的载载体体基基本本上上均均来来自自微生物，主要包括微生物，主要包括6大大类类：l质质粒粒载载体；体；l噬菌体噬菌体载载体；体；l柯斯柯斯质质粒粒载载体；体；lM13噬菌体噬菌体载载体；体；l真核真核细细胞的克隆胞的克隆载载体；

3、体；l人工染色体等。人工染色体等。载体的选择载体的选择 l1）是一个有自我复制能力的复制子（）是一个有自我复制能力的复制子（replicon)l2)能在受体能在受体细细胞内大量增殖，即有胞内大量增殖，即有较较高的复制率。高的复制率。l3）载载体上最好只有一个限制性内切核酸体上最好只有一个限制性内切核酸酶酶的切口，使目的切口，使目的基因能固定地整合到的基因能固定地整合到载载体体DNA的一定位置上。的一定位置上。l4）载载体上必体上必须须有一种有一种选择遗传标记选择遗传标记，以便及以便及时时将将“工程菌工程菌”选择选择出来出来。1 1、质粒克隆载体、质粒克隆载体l（1）、）、质质粒粒载载体体l质粒

4、是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性：具有独立复制起点；具有较小的相对分子质量，一般不超过15kb；具有较高拷贝数，使外源DNA得以大量扩增；易于导入细胞；具有便于选择的标记和具有安全性。2、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体l噬噬菌菌体体克克隆隆载载体体是是基基因因工工程程中中一一类类很很有有价价值值的的克克隆隆载载体体，具具有有很很多多优优点点：其其分分子子遗遗传传学学背背景景十十分分清清楚楚；载载体体容容量量较较大大，一一般般质质粒粒载载体体只只能能容容纳纳10多多个个kb，而而噬噬菌菌体体载载体体却却能能容容纳纳大大约约23kb的的外外源源DNA片片段

5、段；具具有有较较高高的的感感染染效效率率，其其感感染染宿宿主主细细胞胞的的效效率率几几乎乎可可达达100%，而而质质粒粒DNA的的转转化化率率却却只有只有0.1%。l但但野野生生型型噬噬菌菌体体DNA的的分分子子很很大大，基基因因结结构构复复杂杂，限限制制酶酶有有很很多多切切点点，且且这这些些切切点点多多数数位位于于必必需需基基因因之之中中，因因而而不不适适于作于作为为克隆克隆载载体，必需体，必需经经一系列改造才能用作克隆一系列改造才能用作克隆载载体。体。l构建构建噬菌体噬菌体载载体克隆体克隆载载体的基本原体的基本原则则是：是：删删除除基基因因组组中中非非必必需需区区，使使基基因因组组变变小小

6、，有有利利于于克克隆隆较较大的大的DNA片段；片段；除去多余的限制位点。除去多余的限制位点。3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体l 柯柯斯斯质质粒粒载载体体（cosmidvector）即即粘粘粒粒载载体体，是是由由噬噬菌菌体体的的粘粘性性末末端端和和质质粒粒构构建建而而成成。柯柯斯斯质质粒粒载载体体含含有有来来自自质质粒粒的的一一个个复复制制起起点点、抗抗药药性性标标记记、一一个个或或多多个个限限制制酶酶单单一一位位点点，以以及及来来自自噬噬菌菌体体粘粘性性末末端端的的DNA片片段段，即即cos位位点点，其其对对于于将将DNA包装成包装成噬菌体粒子是必需的。噬菌体粒子是必需的。l柯斯柯斯质质粒粒

7、载载体的体的优优点：点：具有噬菌体的高效感染力，而在具有噬菌体的高效感染力，而在进进入宿主入宿主细细胞后不形成子胞后不形成子代噬菌体代噬菌体仅仅以以质质粒形式存在；粒形式存在；具有具有质质粒粒DNA的复制方式，重的复制方式，重组组DNA注入宿主注入宿主细细胞后，两胞后，两个个cos位点位点连连接形成接形成环环状状DNA分子，如同分子，如同质质粒一粒一样进样进行复制；行复制；具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯的能力，柯斯质质粒本身一般只有粒本身一般只有57kb左右，而它可克隆外源左右，而它可克隆外源DNA片段的极度限片段的极度限值值竟高达竟高达45kb，远远远远超超过质过质粒

8、粒载载体及体及噬菌体噬菌体载载体的克隆能力。体的克隆能力。4、M13噬菌体载体噬菌体载体lM13是是大大肠肠杆杆菌菌丝丝状状噬噬菌菌体体，其其基基因因组组为为环环状状ssDNA，大大小小为为6407bp。感感染染雄雄性性（F+或或Hfr）大大肠肠杆杆菌菌并并进进入入细细胞胞后后转转变变成成复复制制型型（RF）dsDNA，然然后后以以滚滚环环方方式式复复制制出出ssDNA。每每当当复复制制出出单单位位长长度度正正链链，即即被被切切出出和和环环化化，并并立立即即组组装装成成子子代代噬噬菌菌体体和和以以出出芽芽方方式式（即即宿宿主主细细胞胞不被裂解）不被裂解）释释放至胞外。放至胞外。l野生型野生型M

9、13不适于直接作不适于直接作为为克隆克隆载载体，因此人体，因此人们对们对其其进进行改造，构建了一系列行改造，构建了一系列M13克隆克隆载载体。体。5 5、噬菌体质粒载体、噬菌体质粒载体l 噬噬菌菌体体质质粒粒（phagemid或或phasmid）是是由由丝丝状状噬噬菌菌体体和和质质粒粒载载体体DNA融融合合而而成成，兼兼有有两两者者优优点点，这这类类载载体体具具有有来来自自M13或或f1噬噬菌菌体体的的基基因因间间隔隔区区（内内含含M13或或f1噬噬菌菌体体复复制制起起点点）和和来来自自质质粒粒的的复复制制起起点点、抗抗药药性性标标记记、一一个个多克隆位点区等。多克隆位点区等。l噬菌体噬菌体质

10、质粒粒载载体在体在应应用上具有用上具有许许多多优优点：点：载载体本身分子小，体本身分子小，约为约为3 0003 000bpbp，便于分离和操作；便于分离和操作；克克隆隆外外源源DNADNA容容量量较较M M1313噬噬菌菌体体载载体体大大，可可克克隆隆1010kbkb外外源源DNADNA片段；片段；可用于制可用于制备单链备单链或双或双链链DNADNA，克隆和表达外源基因。克隆和表达外源基因。6 6、真核生物的克隆载体、真核生物的克隆载体l真核生物载体，主要有以下几大类：l（1）、酵母质粒载体）、酵母质粒载体、附加体质粒（、附加体质粒（epislmal plasmid）、复制质粒（、复制质粒（r

11、eplicating plasmid）、整合质粒（、整合质粒（integrating plasmid）l（2）、真核生物病毒载体）、真核生物病毒载体、哺乳动物病毒载体、哺乳动物病毒载体、昆虫病毒载体、昆虫病毒载体、植物病毒载体、植物病毒载体7 7、人工染色体、人工染色体l酵酵母母人人工工染染色色体体（yeastartificialchromosome,YAC）是一是一类类目前能容目前能容纳纳最大外源最大外源DNA片段人工构建的片段人工构建的载载体。体。l酵母染色体的控制系酵母染色体的控制系统统主要包括三部分：主要包括三部分：着着丝丝粒粒（centromere,CEN），它它的的作作用用是是使使

12、染染色色体体的的附附着着粒粒与与有有丝丝分分裂裂的的纺纺锤锤丝丝相相连连，保保证证染染色色体体在在细细胞胞分裂分裂过过程中正确分配到子代程中正确分配到子代细细胞；胞；端端粒粒（telomere,TEL），位位于于染染色色体体两两个个末末端端，功功能能是是保保护护染染色色体体两两端端，保保证证染染色色体体的的正正常常复复制制，防防止止染染色色体体DNA复制复制过过程中两端序列的程中两端序列的丢丢失；失；酵酵母母自自主主复复制制序序列列（autonomously replicatingsequence,ARS）其功能与酵母其功能与酵母细细胞复制有关。胞复制有关。表达载体的构建表达载体的构建l 基基

13、因因工工程程的的主主要要目目的的是是使使外外源源基基因因能能在在细细菌菌、酵酵母母或或动动、植植物物细细胞胞中中得得到到高高效效表表达达，以以便便获获得得大大量量有有益益的的基基因因表达表达产产物或改物或改变变微生物或微生物或动动、植物的、植物的遗传遗传性状。性状。l所所谓谓表表达达载载体体（expressionvector）是是指指宿宿主主细细胞胞基基因因表表达达所所需需调调节节控控制制序序列列，能能使使克克隆隆的的基基因因在在宿宿主主细细胞胞内内转转录录和和翻翻译译的的载载体体。也也即即克克隆隆载载体体只只是是携携带带外外源源基基因因，使使其其在在宿宿主主细细胞胞内内扩扩增增；表表达达载载

14、体体不不仅仅可可使使外外源源基基因因扩扩增增，还还可可使使其其表表达达。原原核核生生物物和和真真核核生生物物的的表表达达载载体体有有一一些些共共同同的的要要求求，但但两两者者的的基基因因表表达达调调控控机机制制有有很很大大不不同同，故故需需要要分分别别采采用用原原核生物和真核生物的核生物和真核生物的调调控原件来构建。控原件来构建。1 1、表达系统的要求与主要调控元件、表达系统的要求与主要调控元件l表达系表达系统统的要求与主要的要求与主要调调控元件包括：控元件包括：启启动动子、子、核糖体的核糖体的结结合位点、合位点、转录终转录终止信号止信号 密密码码子偏子偏爱爱性性 等。等。2 2、表达载体中调

15、节开关的作用、表达载体中调节开关的作用l通通常常表表达达载载体体不不应应使使外外源源基基因因始始终终处处于于转转录录和和翻翻译译之之中中。这这是是由由于于某某些些有有价价值值的的外外源源蛋蛋白白可可能能对对宿宿主主细细胞胞是是有有毒毒的的，外外源源蛋蛋白白的的过过量量表表达达必必将将影影响响细细胞胞生生长长；此此外外某某些些载载体体的的启启动动子子是是强强启启动动子子，如如T7启启动动子子，强强启启动动子子的的表表达达非非常常强强以以致致使使正正常常宿宿主主基基因因不不能表达。能表达。l基基于于以以上上事事实实，宿宿主主细细胞胞的的生生长长和和外外源源基基因因的的表表达达应应该该分分成成两两个

16、个阶阶段段进进行行。第第一一阶阶段段使使含含有有外外源源基基因因的的宿宿主主细细胞胞迅迅速速生生长长直直至至获获得得足足够够量量的的细细胞胞。第第二二阶阶段段是是启启动动开开关关，使使所所有有细细胞胞外外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。l在在原原核核基基因因表表达达调调控控中中，阻阻遏遏蛋蛋白白操操纵纵基基因因系系统统起起着着重重要要调调节节开开关关的的作作用用。当当阻阻遏遏蛋蛋白白与与操操纵纵基基因因相相结结合合时时，能能够够阻阻止止基基因因的的转转录录。加加入入诱诱导导物物，使使其其与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合，解解除除阻阻遏遏，

17、从从而而启启动基因转录。动基因转录。二、微生物与基因工程工具酶基因工程所用的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化获得的。l对DNA片段进行操作，必须要有能“切短”DNA的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的DNA片段进行切割拼接组装。l在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需要DNA连接酶催化，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶l 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶（restrictionendonuclease）或或简简称称为为限限制制性性酶酶（restrictionenzyme）

18、是是指指能能识识别别双双链链DNA分分子子的的特特定定序序列列，并并在在识识别别位位点点或或其其附附近近切切割割DNA的一的一类类内切内切酶酶.其作用是在分离目的基因或切割载体时对DNA进行准确切割。如：大肠杆菌的EcoR，流感嗜血杆菌的Hind，肺炎克雷伯氏杆菌的Kpn等等。EcoR中E是大肠杆菌属名的第一个字母，co是种名的头两个字母，R是株名，表示该菌第一个被分离出来的酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶EcoEcoRIRI的作用的作用同裂酶：有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别和切割序列各不相同，但却能产生相同的粘性末端，

19、这类限制酶称为同尾酶。l将将不不同同的的DNA片片段段连连接接在在一一起起的的酶酶叫叫DNA连连接接酶酶。lDNA连连接接酶酶主主要要来来自自T4噬噬菌菌体体和和大大肠肠杆杆菌。菌。lDNA连连接接酶酶催催化化两两个个双双链链DNA片片段段相相邻邻的的5端端磷磷酸酸与与3端端羟羟基基之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键。它它既既能能催催化化双双链链DNA中中单单链链切切口口的的封封闭闭，也也能能催催化化两两个个双双链链DNA片片段段进进行行连连接。接。2、DNA连接酶连接酶DNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种：一一种种是是T4DNA连连接接酶酶：T4DNA连连接接酶酶由由一一条条多多肽肽链

20、链组组成成，相相对对分分子子量量为为6800Da，通通常常催催化化粘粘性性末末端端间间的的连连接接效效率率要要比比催催化化平平末末端端连连接接效效率率为为高高。催催化化反反应应需需要要Mg2+和和ATP，ATP作作为为反反应应的的能能量量来来源源。T4DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。连接酶在基因工程操作中被广泛应用。另另一一种种是是大大肠肠杆杆菌菌DNA连连接接酶酶：大大肠肠杆杆菌菌DNA连连接接酶酶的的相相对对分分子子量量为为7500Da，连连接接反反应应的的能能量量来来源源是是NAD+，此此酶酶催催化化DNA连连接接反反应应与与T4DNA连连接接酶酶大致相同，但不能催化大致相同，但

21、不能催化DNA分子的平端连接。分子的平端连接。体外体外DNA连接方法目前常用的三种：连接方法目前常用的三种：（1）用）用T4或或E.coliDNA连接酶可连连接酶可连接具有互补粘性末端的接具有互补粘性末端的DNA片段；片段；（2）用）用T4DNA连接酶连接具有平末连接酶连接具有平末端端DNA片段；片段；（3）先在）先在DNA片段末端加上人工接片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。连接。三、微生物作为克隆载体的宿主为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，必须选择合适的克隆载体宿主。一个理想的克隆载体宿主。宿主基本要求是：能够高效吸收外源DNA；

22、具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；便于进行基因操作和筛选；具有安全性。原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有生长迅速、极易培养，能在廉价培养基上生长，遗传学和分子生物学背景十分清楚等突出优点，已成为当前被广泛应用的重要克隆载体宿主。另外还有枯草杆菌和昆虫细胞系等。第二节基因工程的基本过程基因工程操作主要步骤为：分离或合成基因（切），通过体外重组将基因插入载体（接），将重组DNA导入细胞（转），扩增克隆基因（增），筛选

23、重组体克隆（检），对克隆的基因进行鉴定或测序，控制外源基因的表达，得到基因产物或转基因动物、转基因植物、工程菌（利用基因工程技术获得的具有新功能的微生物称为工程菌）。一、目的基因的分离或合成1，从基因文库中筛选基因文库是指生物染色体基因组各DNA片断的克隆总体（即某一特定生物体全基因组的克隆集合）。人们可以根据目的基因的性质和序列从中筛选。2，cDNA法目的DNA可用反转录酶以mRNA为模板来合成。（以该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗脱下编码该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆。）cDNA文库是指生物 体 全 部 mRNA的 cDNA克 隆 总 体。cDNA文

24、库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。根据目的基因的特性可从中筛选。3，化学合成法如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。2kb的基因序列。二、体外重组目的基因用酶切下来，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子。三、重组DNA导入细胞DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合、受体细胞的电穿孔和显微注射等等。1，外源DNA导入原核细胞（1）转化或转染如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转

25、化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌体质粒，则可通过转染方式进入细胞。（2）噬菌体的体外包装和感染如果外源DNA被包装成噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入细胞。体外包装是将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整的具有感染力的噬菌体粒子。2，外源DNA导入真核细胞（1）外源DNA导入酵母细胞重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体。（2）外源DNA导入哺乳动物细胞微量注射和电穿孔法为主，还有磷酸钙共沉淀转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法等等。（3）外源DNA导入植物细胞有微量注射、电穿孔法、共培养法、叶片培养法、基因枪法等等。

26、共培养法：共培养法是指将含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养。叶片培养法是指含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物叶片共培养。基因枪法是利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞、组织或幼苗。四、转化细胞的扩增转化细胞的扩增是指受体细胞经转化后立即进行短时间的培养。如原生质体转化后的细胞壁再生等。五、转化子的筛选和重组子的鉴定在制备目的基因时对染色体进行了切割，产生大量的DNA小片断，故进入受体细胞的克隆不仅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所获得的是含有不同克隆子的细胞群体。在DNA体外重组中，外源DNA片断与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，由于

27、重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组子的转化细胞）与非转化子，重组子（含有重组DNA分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体的转化子），以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。方法：将转化扩增物稀释一定的倍数后，均匀涂布在用于筛选的特殊培养基上，使之长出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克隆）。然后进行新一轮的筛选鉴定。1、载体遗传标记法（重组体表型特征的鉴定）原理是利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。抗药性筛选（抗生素平板法）营养缺陷性筛选显性模型筛选噬菌斑法探针重组

28、筛选抗生素平板法：如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素基因之外，将转化的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上，仍可长成菌落。插入失活性：是一种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象。如，pBR322质粒上具有一个四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），已知有24种主要的限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶的切点位于四环素抗性基因之内，3种限制酶的切点位于氨苄青霉素抗性基因（Ampr）之内，外源DNA片段插入这些位点之中的任一位点将导致相应的抗性基因失活。插入表达法：在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使

29、负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。-半乳糖苷酶显色反应法：许多大肠杆菌的载体质粒上含有lacZ/标记基因，它包括大肠杆菌-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列以及氨基端146个氨基酸残基的编码序列，其表达产物是无活性的不完全酶，称为受体；而许多大肠杆菌的受体细胞在染色体DNA上含有-半乳糖苷酶羧基端的部分编码序列，由其产生的蛋白质也无活性，但可作为供体。受体和供体一旦结合，便可恢复-半乳糖苷酶的活性，将5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）底物水解成篮色产物。当外源DNA片段插入到位于lacZ/标记基因内部的多克隆位点上时，生长在含有X-gal的平板上的重组

30、子因lacZ/基因的灭活而成白色，非重组子则显蓝色。异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导物。2、重组DNA分子结构特征的鉴定菌落或噬菌斑原位杂交法又称探针原位杂交法，前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交的原理，探针序列特异地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。方法步骤：醋酸纤维素滤膜覆盖在菌落上，用针扎不对称的三个孔（标记），37OC培养1-2h滤膜NaOH裂解细菌中性缓冲液中和NaOH清洗缓冲液浸泡3min洗去菌体碎片和蛋白晾干后800C下干燥12h固定DNA单链高温高离子强度下（降低本底）与探针杂交稍低离子浓度溶液清洗膜三遍（除去未特异杂

31、交的探针），晾干X-光胶片暗箱内曝光。根据胶片上感光点的位置，在原始平板上挑取相应菌落。内切酶图谱鉴定在外源DNA片断大小以及限制性酶切图谱已知的情况下，对重组子进行酶切鉴定，不仅能区分重组分子与非重组分子，有时还能初步确定期望重组子与非期望重组子。将初步筛选的阳性克隆即转化子小量培养后，提取重组质粒或者重组噬菌体的DNA。用内切酶酶切，然后进行电泳。检测插入DNA片段大小。分子量大于载体质粒的为重组子，最终利用载体上的已知酶切位点，建立重组质粒插入片段的酶切图谱，并与已知数据进行比较，进而确定期望重组子。全酶解法：用一种或两种限制性内切酶切开质粒DNA上所有相应的酶切位点，形成全酶切图谱。部

32、分酶解法：通过限制酶量或限制反应的时间使酶切位点发生切割反应，产生相应的部分限制性片段，显然这些片段大于全酶片段，因此能确定同种酶多个切点的准确位置。重组子快速搜寻法：（EcoRI-Hind联合酶切BamHI酶切PstI酶切）。PCR鉴定用与插入片段两侧互补序列作为引物，以重组质粒DNA作为模板，进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组的DNA进行序列测定。（以便最终获得目的基因的编码序列和基因调控序列，精确界定基因的边界）a.DNA的的化学降解测序法降解测序法b.DNA的的双双脱脱氧氧末末端端终终止止测测序序法法（

33、国国际际目目前常规测序方法）前常规测序方法）c.其其它它：如如DNA全全自自动动序序列列分分析析系系统统，超超薄薄水水平平凝凝胶胶电电泳泳技技术术，基基因因芯芯片片杂杂交交测测序，扫描隧穿显微镜测序等等。序，扫描隧穿显微镜测序等等。注：一般DNA序列测定前，鉴定出期望重组子后，要进行目的基因的定位。如果期望重组子中外源DNA比目的基因长，则目的基因在DNA片段上所处的位置必须确定。以便删除非目的基因的DNA片段，简化目的基因的进一步分析。3、外源基因表达产物的鉴定如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子。这种方法应用的前提是重

34、组分子必须含有能在受体细胞中发挥功能的表达元件。也就是说外源基因必须表达其编码产物，并且受体细胞不能合成这种蛋白质。表达产物免疫活性测定（又称放射免疫原位检测法）如果（前提条件）表达产物是一种蛋白或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法操作类似于菌落原位杂交：硝酸纤维素薄膜印膜处理滤膜裂解菌落释放蛋白固定处理后与第一抗体反应洗膜后再与标记的第二抗体反应检测。第二抗体可以用同位素标记也可以用生物素或酶标记。表达产物生物活性检查若表达产物是一种酶，可测定其酶活性。若表达产物是一种酶抑制剂，可测定其抑制酶活性能力的大小。蛋白质凝胶电泳检测法：从重组克隆中分别制备蛋白质粗提液，以

35、非重组子作对照；走蛋白凝胶电泳。新谱带-期望重组子（应剔除载体基因表达的产物）。表达产物氨基酸序列测定测定表达产物“N”端氨基酸序列。探针获取的方法：A：目的基因的同源序列B：cDNAC：人工合成一般最佳探针长度范围为100-1000bp，另外探针内部不能含有大面积的互补序列。3、基因文库与、基因文库与cDNA文库的构建文库的构建l利利用用重重组组DNA技技术术，可可将将某某一一原原核核微微生生物物或或真真核核微微生生物物染染色色体体基基因因组组的的全全部部遗遗传传信信息息贮贮存存在在由由重重组组体体群群体体（如如重重组组噬噬菌菌体体群群体体）构构成成的的基基因因文文库库（genomic li

36、brary）或或cDNA文文库库（cDNAlibrary）之之中中，犹犹如如将将文文献献资资料料贮贮存存于于图图书书库库一一样样，以供，以供长长期期贮贮存和随存和随时调时调取克隆基因使用。取克隆基因使用。基因文库和基因文库和cDNA文库的构建文库的构建l（1）、基因文）、基因文库库的构建的构建所所谓谓基基因因文文库库是是指指生生物物染染色色体体基基因因组组各各DNA片片段段的的克克隆隆总总体体。文文库库中中的的每每一一个个克克隆隆只只含含基基因因组组中中某某一一特特定定的的DNA片片段段。一一个个理理想想的的基基因因文文库库应应包包括括该该生生物物染染色色体体基基因因组组全部全部遗传遗传信息即

37、全部信息即全部DNA序列。序列。l（2）、）、cDNA文文库库的构建的构建所所谓谓cDNA文文库库是是指指生生物物体体全全部部mRNA的的cDNA克克隆隆总总体体。cDNA文文库库中的每一个克隆只含一种中的每一个克隆只含一种mRNA信息。信息。由由于于真真核核生生物物基基因因组组十十分分庞庞大大，因因此此要要求求构构建建基基因因文文库库的的库库容容量量要要足足够够大大，才才能能筛筛选选到到某某一一目目的的基基因因。但但由由于于细细胞胞中中的的mRNA分分子子数数要要比比基基因因组组的的基基因因数数小小得得多多（通通常常大大约约仅仅有有15%左左右右基基因因被被表表达达），因因而而若若由由mRNA逆逆转转录录为为cDNA，那那么么所所构建的构建的cDNA文文库库的的库库容量相容量相应较应较基因文基因文库库小。小。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！77