长链非编码RNA在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变中的表达_杨慧.docx

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1、 论著 长链非编码 RNA 在宫颈癌及宫颈上皮 内瘤样病变中的表达 杨 慧 余 敏 敏 陆 晓 媛 【摘要】 目的探讨长链非编码 RNA(LncRNA)在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变 （ CIN)中的 表达。方法 60 例宫颈组织标本按病理诊断分为宫颈癌组、 CIN 组和正常组，每组 20 例。通过 LncRNA 数据库筛选在宫颈组织中可能异常表达的 LncRNAs， 采用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR) 进行验证。结果通过 NONCODE 科学数据库筛选出与宫颈组织相关的 LncRNA H19、 MALAT1、 HOTAlR、 BCYRNl、ANRIL、 SRA 和 UCA1。 qRT-

2、PCR 结果： 60 例标本中 LncRNA H19 在宫颈癌 组、 CIN 组标本中的表达量低于正常组 （ P0.05)。 结论 H19 在宫颈癌和 CIN 发生 中起抑制作用； SRA 可抑制宫颈癌发生，但对 CIN 的发生有促进作用； HOTAIR、 UCAl 和 MALAT1 促 进 CIN 发生。 LncRNAs 可能成为宫颈癌及 CIN 早期诊断和治疗的新监测指标。 【关键词】 长链非编码 RNA;宫颈癌；宫颈上皮内瘤样病变 【中图分类号】 R711 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-3685(2014)22-2685-04 Expressions of long non

3、-coding RNA in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia YANG Hui, YU Minmin , LU Xiaoyuan. Xuzhou Medical College , Xuzhou 221006 , CHINA 【 Abstract】 Objective To investigate the expressions of long non-coding RNA (LncRNA) in cervical cancer (CC) and cervical intraepithelial neoplasia

4、(CIN). Methods According to pathological diagnosis, 60 cases were equally divided into 3 groups of CC,CIN and NC(normal cervical tissues). The possible abnormal expression of LncRNAs was screened by LncRNA database. Quantitative real time-PCR(qRT-PCR) was used to confirm the expression of LncRNAs in

5、 60 samples. Results The LncRNAs screened by NONCODE were H19, MALAT1, HOTAIR, BCYRN1, ANRIL, SRA and UCA1. The results reported by qRT-PCR showed that LncRNA HI9 expression was lower in groups of CC and CIN than that in group NC(P0. 05 ). Conclusion LncRNA H19 has an inhibitory effects on CC and CI

6、N. SRA may suppress the occurrence of CC,but promote the occurrence of CIN. HOTAIR,UCA1 and MALAT1 may promote the occurrence of CIN. The LncRNAs could be new indicators for early diagnosis and gene therapy for CC and CIN. 【 Key words】 Long non-coding RNA;Cervical cancer;Cervical intraepithelial neo

7、plasia _Jiangsu Med J ,November 2014,40(22) ： 2685-2688. 作者单位 ： 221000 江苏省，徐州医学院附属医院妇产科（杨慧、陆晓媛 ）； 南京市第二医院妇产科（余 敏敏 通讯作者：陆晓緩 E-mail: x 广 lu68aliyun. com 余敏敏 E-mail: yuminmin324 126. com 9 Niitsu T， Iyo M， Hashimoto K. Sigma-1 receptor agonists as therapeutic drugs for cognitive impairment in neuropsyc

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10、08-17)(供稿编辑：张国楼 ） 长链非编码 RNA(LncRNA)是一类转录本长 度超过 200 nt 的 RNA 分子。近年来的研宄表明， LncRNA参与基因组印记、染色质修饰、转录激活、 转录后调控等多层面调控，且其转录和功能失调参 与肿瘤的发生 1。文献报道肿瘤细胞中某些特定的 LncRNAs 的表达水平发生改变，或某些癌症类型特 异型 LncRNAs的表达，可作为肿瘤诊断和治疗新 的监测指标 2。本研宄探讨 LncRNA 在宫颈癌及 宫颈上皮内瘤样病变(CIN)中的表达，现报道如下。 资料与方法 一、 一般资料 收集 2013 年 5 月 -2014 年 5 月南京市第二医院 妇

11、科采集临床宫颈组织标本，按病理检查分为三组： 宫颈癌组、 CIN 组、正常组，每组 20 例。所有患者均 未行术前放化疗，留取活检或手术切除标本立即放 入液氮保存，而后转入一 8 0 C 冰箱冻存。按照国际 妇产科联盟 （ FIGO, 2009 年）的宫颈癌临床分期标 准进行临床分期。 二、 方法 1. 试剂与仪器 LncRNA 引物、 GAPDH 引物及 RNA 抽提试剂 Trizol、逆转录酶 MMLV(Invitrogen) 由美国 Invitrgen 公司提供。 ABI7700实时荧光 定量 PCR仪购自美国 AB 公司。 2. 数据筛选 2014 年 3 月 1 日通过 NONCOD

12、E 科学数据库 （ http : /www. Noncode, org/ )筛选与 宫颈组织相关的 LncRNAs。 在宫颈组织中可能异 常表达的 LncRNAs 为：母系印记基因转录本 H19、 肺腺癌转移相关转录本 1(MALAT1)、 H0X 基因 的反义 基 因 间 RNA( HOTAIR) 、 脑 细 胞 质 RNA1 (BCYRN1)、 INK4 位点反义非编码 RN A (ANRIL)、 类固醇受体 RNA 激活因子转录本 （ SRA)、 尿路上 皮癌抗原 l(UCAl)。 3. RNA 提取及实时荧光定量 PCR(qRT-PCR) 设计并合成 qRT-PCR 引物，引物列表见表

13、 1。紫 外吸收测定法测定 RNA在分光光度计 260 nm和 280 nm处的吸收值，以计算其浓度并评估 RNA 纯 度。使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电 泳，检测 RNA纯度及完整性。按照逆转录酶使用 说明将样品 RNA逆转录为 cDNA。 先将样品的目 的基因以及管家基因进行 PCR 扩增，其产物进行梯 度稀释用于做标准曲线。样品分别加入到含 SG 的 qRT-PCR 反应液中，进行 qRT-PCR 扩增和检测。 检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的 基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的 目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差， 所得结果代表样品的目的基因相对含量

14、。得出 qRT-PCR 实验结果及相关图表。 三、统计学处理 采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析。定量资料 采用单因素方差分析，双侧检验， ? . 05 为差异有 统计学意义。 结 果 通过 NONCODE 科 学 数 据 库 筛 选 出 的 7 个 LncRNAs 在宫颈癌组、 CIN 组、正常组宫颈组织标 本中的表达平均值见表 2。 统计分析筛选出的 7 个 LncRNAs 在宫颈癌 组、CIN 组、正常组标本中的表达值，结果见表 3。 讨 论 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重危 及妇女健康和生命。据统计，全球每年约有 46. 60 万宫颈癌新发病例，中国约有近 10 万新发

15、病例，约 占世界新发病例总数的 1/53。 CIN 是一组与宫颈 浸润癌密切相关的癌前病变的统称，包括宫颈上皮 不典型增生和宫颈原位癌。宫颈癌的发生发展过程 为：不典型增生（轻 中 重 ） 原位癌 早期浸润 癌 浸润癌，大约需要十几年时间。大量的流行病 学和分子生物学研宄证明：高致病基因型人乳头瘤 病毒 （ HPV)感染是宫颈癌及癌前病变发生的主要 原因 1。 LncRNA 直被视作转录过程的 “ 暗物质 ” 未 受到重视 5。近年来的研宄表明 LncRNA 参与基 因组印记、染色质修饰、转录激活、转录后调控等多 种重要的信号转导 调控过程 6。 LncRNA 的这些 调控作用逐渐引起人们广泛

16、的关注，在生理及疾病 过程中扮演重要角色 7。目前 LncRNA 的研宄尚 在初级阶段，研宄发现 LncRNA 在人类疾病上具有 重要价值，尤其是在肿瘤学研宄中， LncRNA 的意 义挖掘潜力 E 大。目前 LncRNA在宫颈癌发生中 所扮演的角色和所起的特异性功能尚未明了。 NONCODE 科学数据库是中国科学院计算技 术研宄所生物信息学研宄组和中国科学院生物物理 研宄所生物信息学实验室共同开发和维护的一个提 供给科研人员分析非编码 RNA 基因的综合数据平 台。通 过 该 基 因 数 据 库 筛 选 出 与 宫 颈 组 织 相 关 的 LncRNAs 有 H19、 MALAT1、 HOT

17、AIR、 BCYRN1、 ANRIL、 SRA、 UCA1。 本研宄发现 LncRNA H19 在宫颈癌、 CIN 宫颈组织中低表达。 SRA 在宫颈癌 中的表 达 量 低 ， 在 CIN 标 本 组 织 高 表 达 。 HOTAIR、 UCAlMALATl 在 CIN 宫颈组织中高表达。 H19 基因位于人染色体 11P15. 5， H19 是第一 个被发现与癌症有关的 LncRNA,它有抑癌和促癌 的双重作用。 H19 基因高丰度表达于胚胎发育期， 主要集中表达于内胚层及中胚层来源的组织。然 而，出生后 H19 的表达降低，仅在心肌及骨骼肌中 有一定的表达。 2011 年 HoppeSey

18、ler 等 8提出， LncRNA H19 在宫颈癌标本异常表达， LncRNA 可 能通过改变HPV 的转录调控，如降低 HPV 致癌过 程中的表达，阻断宫颈病变的进展。有研宄认为 H19 在 CIN 标本也存在异常表达 M。本研究发现 LncRNA H19 在宫颈癌、 CIN 宫颈组织中低表达。 对宫颈癌及 CIN 有抑制作用。 SRA 基因位于人染 色体 5q31. 3， SRA 是具有独立的表观遗传调控功能 的 LncRNA,他通过调节核受体的活性来调控基因 的表达。 SRA 可能参与了性激素的致癌作用，有人 通过 siRNA 降低 SRA 的表达，从而减少了细胞的侵 袭能力；该研宄还

19、发现，SRA 可以与一些基因共同作 用参与到细胞的浸润与转移过程中 1。 SRA 在宫颈 癌、 CIN 组织中的表达尚无文献报道。 HOTAIR 基 因定位于 HOXC 基因座12ql3. 1311。 HOTAIR 的 5端可招募结合多梳蛋白抑制复合物 2 (PRC2)， 借 助 PRC2 上 3 个 H3K27 甲基 化 酶 EZH2、 SUZ12 和 EEDM， 使 另 一 基 因 座HOXD 上长约 40 kb 的序 列转录沉默，从而在乳腺上皮细胞内使细胞内转录 倾向于胚胎成纤维细胞样表型。 HOTAIR 在乳腺 癌中可作为判断预后和转移独立指标 13。 2014 年 有研宄发现， HO

20、TAIR 在宫颈癌中过表达 1，在 CIN 组织中的表达尚无文献报道。UCA1 基因位 于人染色体 19pl3. 12,在膀胧癌、结肠癌、肺癌、甲 状腺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、宫颈癌高表达。 2012 年，北京大学泌尿外科的一项研宄显示， UCA1 用于膀胧癌诊断具有较高敏感性和高度特异性，且 结果稳定，有望成为一种新的更好的尿液肿瘤标志 物 15。 UCA1 在 CIN 组织中的表达尚无文献报道。 MALAT1 基因定位于染色体 llql3. 1，MALAT1 能锚定于染色质易位断裂点促进肿瘤侵袭和肿瘤细 胞转移。最早人们发现他与非小细胞肺癌患者的分 期和组织特异性相关。 MALAT

21、1 在人体多种器官 (如前列腺、脾、肾脏等）组织中表达，但在子宫、皮 肤、胃、骨髓组织中却表达缺失 lfi。近年来一些实 验证明 ， M ATL AT1 在乳腺癌、结肠癌、肝癌和前列 腺癌 等中都有异常表达 17。 MALAT1在 CIN 组 织中的表达尚无文献报道。 综上所述，通过研宄在宫颈癌、 CIN 组织异常表 达的 LncRNA， 其可能作为宫颈癌的早期诊断、治 疗的分子标志物及治疗的分子靶点，其内在致病 机制需要进一步研宄。研宄结果可通过扩大样本 量检测，进一步免疫组化、动物模型实验进行验 证。 LncRNA有希望成为新型肿瘤标志物和肿瘤 治疗的靶点，在肿瘤诊断和治疗方面显示出良好的

22、 临床应用前景。 参考文献 1 Huarte M,Rinn JL. Large non-coding RNAs： missing links in cancerj? Hum Mol Genet,2010,19(R2) ： R152-161. 2 Ozgur E， Mert U， Isin M， et al. Differential expression of long non-coding RNAs during genotoxic stress-induced apoptosis in HeLa and MCF-7 cellsJ. Clin Exp Med, 2013,13 (2)： 11

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