第3章-高效液相色谱优秀PPT.ppt

《第3章-高效液相色谱优秀PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第3章-高效液相色谱优秀PPT.ppt（64页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 1 1高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，最高输送压力可达4.9107Pa.例如分别苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分别，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流淌相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分别出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，接受梯度

2、洗脱，可在不到0.5h内分别出尿中104个组分.2 2高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要接受高效液相色谱法进行分别和分析。(2)气相色谱接受流淌相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流淌相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生确定亲和力，并参与固定相对组分作用的猛烈竞争。因此，流淌相对分别起很大作用，相当于增加了一个限制和改进分别条件的参数，这为选择最佳分别条件

3、供应了极大便利。(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则常常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分别和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。2-2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示看法图3-1，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分别系统和检测系统。此外还配有协助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。

4、其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流淌相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从限制器的出口流出。当注入欲分别的样品时，流经进样器贮液器的流淌相将样品同时带入色谱柱进行分别，然后依先后依次进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。1高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流淌相阻力很大，为使流淌相较快流淌，必需配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于快速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分

5、为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在确定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变更无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变更，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正渐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。2进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。3 分别系

6、统色谱柱 梯度洗提 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分别前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分别柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分别柱时不再洗脱其中固定相，保证分别的性能不受影响。4检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分别组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。

7、另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:(1)紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器参比池样品池光线硅光电池板（2）荧光检测器）荧光检测器 (3)示差折光率检测器示差折光率检测器 几乎全部物质都有各自不同的折射率，几乎全部物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度。主要缺点是对温度变更敏感，并且不能用于梯度淋洗。变更敏感，并且不能用于梯度淋洗。（4）电导检测器）电导检测器 (5)附属系统附

8、属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置附属装置.2-3高效液相色谱的固定相和流淌相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压实力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形态、孔隙度不同的颗粒。假如在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛运用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，

9、它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。1.表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰快速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱简洁，梯度淋洗时能快速达平衡，较适合做常规分析

10、。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。2全多孔型固定相 它由直径为10nm的硅胶微粒凝合而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的积累硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝合成全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍旧较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特殊适合困难混合物分别及痕量分析.（二）流淌相 由于高效液相色谱中流淌相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流淌相干脆影响组分的分别度。对流淌相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测

11、样品，必需具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸取检测器，应留意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生猛烈吸取，此时溶剂被看作是光学不透亮的，它严峻干扰组分的吸取测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流淌相，以达最高灵敏度。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流淌相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50IOOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶

12、剂。(5)低粘度。若运用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分别。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜接受，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分别.2-4高效液相色谱法的主要类型及选择（）液一液安排色谱法（LLPC）在液-液色谱中,流淌相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分别和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1分别原理 液液安排色谱的分别原理基本与液液萃取相同，都是依据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的安排系数。所不同的是液液色谱的安排是在柱中进行的，使这种安排平衡可反复多次进行，造成

13、各组分的差速迁移，提高了分别效率，从而能分别各种困难组分。2固定相 由于液液色谱中流淌相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简洁。只需运用几种极性不同的固定液即可解决分别问题。例如，最常用的强极性固定液，一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法快速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分别问题是在化学键合固定相上进行的。3流淌相 在液液色谱中

14、为了避开固定液的流失。对流淌相的一个基本要求是流淌相尽可能不与固定相互溶，而且流淌相与固定相的极性差别越显著越好。依据所运用的流淌相和固定相的极性程度，将其分为正相安排色谱和反相安排色谱。假如接受流淌相的极性小于固定相的极性，称为正相安排色谱，它适用于极性化合物的分别。其流出依次是极性小的先流出，极性大的后流出。假如接受流淌相的极性大于固定相的极性，称为反相安排色谱。它适用于非极性化合物的分别，其流出依次与正相色谱恰好相反。（二）化学键合相色谱法（CBPC）接受化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相特别稳定，在运用中不易流失，适用于梯度淋洗，特殊适用于分别容量

15、因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分别。1键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.2键合固定相的制备（l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：Si0HROHSiORH20由于这类键合固定相的有机表面

16、是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流淌相。（2）SiC或Si一N共价键合固定相 制备反应如下 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不便利；当运用水溶液时，必需限制pH在48范围内.（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应如下：这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛.3反相健合相色谱法 此法的固定相是接受极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等；流淌相是接受极性较强的溶剂，如甲醇一水、乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶液等。

17、它多用于分别多环芳烃等低极性化合物；若接受含确定比例的甲醇或乙睛的水溶液为流淌相，也可用于分别极性化合物；若接受水和无机盐的缓冲液为流淌相，则可分别一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。关于反相键合相色谱的分别机理，可用所谓疏溶剂作用理论来说明。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的流水特性。当用极性溶剂为流淌相来分别含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分别物的极性部分受到极性流淌相的

18、作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用（见图20-4）。明显，两种作用力之差，确定了分子在色谱中的保留行为。一般地，固定相的烷基协作基或分别分子中非极性部分的表面积越大，或者流淌相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，安排比也越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。4.正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团，CN、NH2 双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流淌相，分别极性化合物。一般认为正相色谱的分别机制属于安排色谱。组分的安排比K值，随其极性的增加而增大，但随流淌相中极

19、性调整剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。这种色谱方法主要用于分别异构体、极性不同的化合物，特殊适用于分别不同类型的化合物。5.离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3）等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流淌相一般接受缓冲溶液。其分别原理与离子交换色谱类同。以上探讨了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：(1)通过变更流淌相的组成和种类，可有效地分别各种类型化合物（非极性、极性和离子型）(2)由于键合到载体上的基团不易流失，特殊适

20、用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有8O的分别问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流淌相的体系。如何依据样品极性种类来选择化学键合的固定相，请参看表20-3。（三）液一固吸附色谱法(LSAC)液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是依据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分别的。1分别原理 当流淌相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流淌相分子。同时，当试样分子（X）被流淌相带入柱内，只要它们在固定相有确定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流淌

21、相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS 达平衡时,有 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分别。Kad值可通过吸附等温线数据求出。2固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料匀整、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前

22、最广泛运用的还是全多孔型微粒填料。3流淌相 一般把吸附色谱中流淌相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往接受极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0）来衡量。0越大，表示洗脱剂的极性越强。表20-4列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的依次相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。(四）离子交换色谱法（IEC）此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分别分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分别。它不仅适用无机离子混合物的分别，亦可用于有机物的分别，例如氨基酸、

23、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。1离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分别的。其固定相接受离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：一般形式：R一AB RBA达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换实

24、力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下依次：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的依次为：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性依次为：ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再依据官能基的离解度大小

25、还有强弱之分（见表20-5）常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：（l）多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分见图20-6中（a）和（b）。（2）薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对30m的固体情性核上，凝合12m厚的树脂层，如图20-6中（c）。（3）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂，如图20-6中（d）所示。（4）离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多

26、孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可运用小粒度固定相和高柱压来实现快速分别。3流淌相 离子交换色谱法所用流淌相大都是确定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过变更流淌相中盐离子的种类、浓度和pH值可限制k值，变更选择性。假如增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附实力，从而降低其在固定相上的保留值。一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2

27、+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不同状况而定。例如，分别有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过变更流淌相的pH值来限制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度削减；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种状况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。（五）离子色谱法（IC）离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分别方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能接受紫外检测器的被测离子，如接受电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流淌相的高背景电导信号掩没而无法检

28、测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分别柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分别柱电荷相反的离子交换树脂。通过分别柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流淌相转变成低背景电导的流淌相，从而用电导检测器可干脆检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流淌相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分别往后，随流淌相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：R+OHH+Cl-R+Cl十H2OR+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的

29、水，消退了流淌相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相像的作用机理。在分别柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分别度。后来，Frits等人提出不接受抑制柱的离子色谱体系，而接受了电导率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流淌相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。（六）离子对色谱法（IPC）离子对色谱法是分别分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。它是离子

30、对技术与色谱法相结合的产物。在20世纪7O年头中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到特别快速的发展。1离子对色谱法原理 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流淌相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而限制溶质离子保留行为的一种色谱法。关于离子对色谱机理，至今仍不特别明确，已提出三种机理：离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流淌相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分别子A-相反的离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的人组分别子生成离子对化

31、合物A-B+。离子对生成反应式 由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分别子的性质不同，它与反离子形成离子对的实力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分别子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分别的基本原理。2键合相反相离子对色谱法 离子对色谱法类型很多，依据流淌相和固定相的极性可分为反相离子对和正相离于对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重要。这种色谱法的固定相接受非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（ODS）等，流淌相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。依据离子对生成反应式，平衡常数 KAB可表示为

32、依据定义，溶质的安排系数 依据上两式，有依据上两式，有式中为相比率。容量因子k随KAB和B+水相的增大而增大。键合相反相离子对色谱法操作简便，只要变更流淌相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内变更分别的选择性，能较好解决难分别混合物的分别问题。此法发展快速，应用较广泛.（七）尺寸排阻色谱法（SEC）尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分别。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、安排和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形态不同来实现分别的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时

33、间是分子尺寸的函数，有可能供应分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可接受灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能辨别分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必需大于10才能得以分别。1分别原理 尺寸排阻色谱是按分子大小依次进行分别的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有确定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最终洗精彩谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗

34、透过程模型见图20-7。2固定相 排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。表20-6列出了常用的一些固定相。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的松软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的很多倍。它们适用以水溶性溶剂作流淌相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流淌相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。（3）刚性凝胶

35、如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流淌相，可在较高压强和较高流速下操作。一般限制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分别。3 3流淌相流淌相 排阻色谱所选用的流淌相必需能溶解样品，并必排阻色谱所选用的流淌相必需能溶解样品，并必需与凝胶本身特别相像，这样才能润湿凝胶。当接需与凝胶本身特别相像，这样才能润湿凝胶。当接受软性凝胶时，溶剂也必需能溶胀凝胶。另外，溶受软性凝胶时，溶剂也必需能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分别效果。这对于具有低扩散系数的大作用而影响

36、分别效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分别，尤需留意。选择溶剂还必需与检定分子物质分别，尤需留意。选择溶剂还必需与检定器相匹配。常用的流淌相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、器相匹配。常用的流淌相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。二甲基酸胺和水等。以水溶液为流淌相的凝胶色谱适用于水溶性样以水溶液为流淌相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流淌相的凝胶色谱适用于非水溶品，以有机溶剂为流淌相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。性样品。(八)亲和色谱法（AC）简介 亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分别的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一

37、般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。（九）分别类型的选择 1依据相对分子质量选择 相对分子质量特别低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。2依据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。假如样品可溶于水并属于能离解物质，以接受离子交换色谱为佳

38、；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采 表 20-7液相色谱分别类型选择参考表 溶于水排阻色谱，水为流淌相 相对分子质量 2000 不溶于水排阻色谱，非水流淌相 同系物安排色谱 不溶于水 异构体吸附色谱样品 分子大小差异排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流淌相 碱阳离子交换色谱 溶于水，可离解 酸阴离子交换色谱 溶于水，离子与非离子反相离子对色谱 用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多接受常规的安排和吸附色谱分别；如样品既溶于水多接受常规的安排和吸附色谱分别；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和

39、异丙醇的混合液作液一液又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液安排色谱的流淌相，以憎水性化合物作固定相。安排色谱的流淌相，以憎水性化合物作固定相。3依据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简洁地推断样品中存在什么官能团。然后，确定接受什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液安排色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液安排色谱。现列出表20-7作为选择分别类型的参考。思索题1现需分别分析一氨基酸试样，拟接受哪种色谱？2提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？3.何谓反相液相色谱？何谓正相液相色谱？4.在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分别何种试样？5.在液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽 略不计？6.对下列试样，用液相色谱分析，应接受何种检测器：（l）长链饱和烷烃的混合物 （2）水源中多环芳烃化合物。7.对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析，应接受哪一种液相色谱法？8什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？9什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？10.指出下列各种色谱法，最适宜分别的物质。（l）气液色谱；(2)正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交换色谱;（5）凝胶色谱；(6）气固色谱；(7）液固色谱。