第14章高效液相色谱优秀PPT.ppt

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1、第第1414章章 高效液相色谱高效液相色谱High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography(HPLC)(HPLC)14.1 概述概述14.2 HPLC仪器仪器 包括：高压输液装置；进样系统；包括：高压输液装置；进样系统；分别系分别系统；统；检测系统；协助系统。检测系统；协助系统。14.3 流淌相和固定相简介流淌相和固定相简介14.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 安排色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺安排色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排寸排 阻色谱和亲和色谱阻色谱和亲和色谱14

2、.1 概述概述 高效液相色谱是以液体为流淌相的色谱方法。高效液相色谱是以液体为流淌相的色谱方法。依依据据固固定定相相不不同同分分为为：液液液液安安排排色色谱谱；液液固固吸吸附附色色谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱薄层色谱)等。等。早早期期液液相相色色谱谱，包包括括Tswett的的工工作作，都都是是在在直直径径15cm,长长50500cm的的玻玻璃璃柱柱中中进进行行的的。为为保保证证有有确确定定的的柱柱流流速速，填填充充的的固固定定相相颗颗粒粒直直径径多多在在150200m

3、范范围围内内。即即使使这这样样，流流速速仍旧很低仍旧很低(7时时，该该检检测测器器不够灵敏。不够灵敏。其其它它检检测测器器还还包包括括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光散射光散射)、极谱等。、极谱等。14.3 HPLC流淌相和固定相简介流淌相和固定相简介一、流淌相一、流淌相 与与GC流流淌淌相相不不同同，HPLC流流淌淌相相为为溶溶剂剂，它它既既有有运运载载作作用用，又又和和固固定定相相一一样样，参参予予对对组组分分的的竞竞争争，因因此此溶溶剂剂的的选选择择对对分分别别特别重要。志向的溶剂应有下列特性：特别重要。志向的溶剂应有下列特性：

4、1）对待测物具确定极性和选择性；）对待测物具确定极性和选择性；2）运运用用UV检检测测器器时时，溶溶剂剂截截止止波波长长要要小小于于测测量量波波长长(为为什什么么？)；运运用用折折光光率率检检测测器器，溶溶剂剂的的折折光光率率要要与与待待测测物物的的折折光光率率有有较较大差别；大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时使截止波长增加；）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时使截止波长增加；4）化学稳定性好；）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。1.按承受压力分按承受压力分刚性固体：刚性固体：SiO2为基质，

5、耐压为为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形态。可制成直径、形态 和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、安排和键合色谱；和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、安排和键合色谱；硬硬 胶：以聚合物为基质胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为，耐压上限为 3.5108 Pa,主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。2.按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如如 硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚

6、酰胺等硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔。表面多孔 型固定相的颗粒大型固定相的颗粒大(易装柱易装柱)、多孔层厚度小且孔浅、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，渗透性好，出峰快出峰快)；但交换容量小。适于常规分别分析。；但交换容量小。适于常规分别分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、传质快、柱效高。特殊适于困难混合物的分别。柱效高。特殊适于困难混合物的分别。二、固定相载体二、固定相载体 由于各种由于各种HPLC分别方法的流淌相均为液体，因此，分别方法的流淌相均为液体，因此，H

7、PLC通常是依据固定相载体或固定液的不同来分类的。通常是依据固定相载体或固定液的不同来分类的。14.4 高效液相色谱方法各论高效液相色谱方法各论 一、安排色谱一、安排色谱 1.原理：原理：依依据据各各待待测测物物在在互互不不相相溶溶的的两两溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度不不同同，因因而而具具不不同同的的安安排排系系数数。在在色色谱谱柱柱中中，随随着着流流淌淌相相的的移移动动，这这种种安安排排平平衡衡需需进进行行多多次次，造造成成各各待测物的迁移速率不同，从而实现分别的过程。待测物的迁移速率不同，从而实现分别的过程。2.流淌相流淌相:HPLC分分析析中中，为为防防止止固固定定相相的的流流失失，流流

8、淌淌相相与与固固定定液液应应尽尽量量不不互互溶溶，或或者者说说二二者者的的极极性性相相差差越越大大越越好好。因因此此，依依据据流流淌淌相相与与固固定定相相极极性性的的差差别别程程度度，可可将将液液液液色色谱谱分分为为正正相相安安排排色色谱谱（流流淌淌相相极极性性小小于于固固定定相相极极性性，极极性性小小的的先先流流出出，适适于于极极性性组组分分分分别别）和和反反相相安安排排色色谱谱（流流淌淌相相极极性性大大于于固固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分别）。定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分别）。3.固定相固定相 原原则则上上用用于于GC的的固固定定相相也也可可用用于于HPLC作作

9、固固定定相相。但但HPLC固固定定液液易易流流失失，因因此此常常用用的的只只有有几几种种，极极性性由由高高到到低低为为：,-氧氧二二丙丙腈腈(ODPN)、聚乙二醇聚乙二醇(PEG)、三甲撑二醇、三甲撑二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)。依依据据涂涂渍渍方方法法的的不不同同，可可将将固固定定相相分分为为机机械械涂涂渍渍型型和和化化学学键键合合型型，后后者者应用更为广泛。应用更为广泛。1）机机械械涂涂渍渍固固定定相相：将将固固定定液液通通过过机机械械混混合合的的方方法法涂涂渍渍到到表表面面多多孔孔型型(0.5-1.5%涂涂布布量量)或或全全多多孔孔型型载载体体(5-1

10、0%涂涂布布量量)上上形形成成的的液液液液色色谱谱固固定定相相。该该种种固固定定相相最最大大的的不不足足是是固固定定液液易易流流失失、分分别别稳稳定定性性及及重重现现性性差差，不不适合梯度淋洗。适合梯度淋洗。为为削削减减固固定定液液的的流流失失，通通常常在在柱柱前前加加一一根根很很短短的的前前置置柱柱，该该柱柱涂涂有有与与分分析析柱柱相相同同但但有有更更高高含含量量的的固固定定液液，使使流流淌淌相相进进入入分分析析柱柱之之前前，预预先先被被固固定液饱和。定液饱和。2）化学键合固定相）化学键合固定相 化化学学键键合合固固定定相相是是通通过过化化学学反反应应将将有有机机分分子子键键合合在在载载体体

11、表表面面所所形形成成的的柱柱填填充充剂剂，具具有有稳稳定定、流流失失小小、适适于于梯梯度度淋淋洗洗等等特特点点。这这种种固固定定相相分分别别机机理理既既不不是是简简洁洁的的吸吸附附，也也不不是是单单一一的的液液液液安安排排，而而是是二二者者兼兼而而有有之之。化化学学键键合合的的表表面面覆覆盖盖度度确确定定哪哪种种机机理理起起主主要要作作用用。对对多多数数键键合相来说，以安排机理为主。合相来说，以安排机理为主。通通常常，化化学学键键合合相相的的载载体体主主要要是是硅硅胶胶（表表面面有有硅硅醇醇基）：基）：Si-O-R：对对热热不不稳稳定定、遇遇水水、乙乙醇醇等等强强极极性性会会水水解解，使使酯链

12、断裂，因此只适于以不含水或醇的流淌相。酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流淌相。Si-R(或或Si-N)：不不水水解解，热热稳稳定定性性比比硅硅酸酸脂脂好好。但但所所用用的的格格氏氏反反应应不不便便利利。运运用用水水溶溶液液作作流流淌淌相相时时，其其pH应应在在4-8之间。之间。Si-O-Si-R：不不水水解解，热热稳稳定定性性好好，在在pH2-8范范围围内内对对水水稳定。稳定。3）.正相和反相键合色谱法正相和反相键合色谱法 在在HPLC分分析析中中，有有时时要要在在流流淌淌相相中中加加入入适适量的盐量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？或酸，为什么？答答：都都是是为为防

13、防止止峰峰形形拖拖尾尾。加加入入盐盐类类是是为为了了削削减减待待测测物物与与键键合合相相表表面面的的残残留留硅硅醇醇基基作作用用；加加入入酸酸是是抑抑制制酸酸类类待待测测物物的的离离解解，使使其其以以游游离酸在柱内分别。离酸在柱内分别。何为正相色谱，何为反相色谱？何为正相色谱，何为反相色谱？正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系时间，时间，min固定相：固定相：C1固定

14、相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。将将离离子子交交换换原原理理和和液液相相色色谱谱技技术术相相结结合合，测测定定各各类类阴阴、阳阳离离子子的的分分别别分分析析方方法法。它它既既适适于于无无机机离离子子，也适于有机物分别，如蛋白质、氨基酸、核酸等。也适于有机物分别，如蛋白质、氨基酸、核酸

15、等。1.原原理理：利利用用不不同同离离子子对对固固定定相相的的亲亲和和实实力力（离离子子交交换换实实力力）的的差差别别实实现现分分别别。待待测测离离子子与与离离子子交交换换树树脂脂固定相上带电荷基团或游离离子发生可逆交换反应：固定相上带电荷基团或游离离子发生可逆交换反应：二、离子交换色谱二、离子交换色谱 对对阳阳离离子子，滞滞留留依依次次为为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+对对阴阴离离子子，滞滞留留依依次次为为：柠柠檬檬酸酸根根,SO4

16、2-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-思思索索：待待测测阳阳离离子子电电荷荷越越小小、其其水水合合离离子子的的半半径径越越大大，则越先出峰？对吗？则越先出峰？对吗？2.固定相固定相按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种：按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)；表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。离子交换键合型。1）多多孔孔型型：聚聚苯苯乙乙烯烯+二二乙乙烯烯苯

17、苯交交联联，分分微微孔孔型型和和大大孔孔型型。交交换换基基团团多多交交换换容容量量大大，稳稳定定。但但易易溶溶胀胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。传质慢、柱效低、分析速度慢。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆2）表表面面多多孔孔型型：薄薄膜膜型型=惰惰性性核核+树树脂脂薄薄层层(1-2 m);多多孔孔型型=惰惰性性核核+硅硅胶胶微微球球+树树脂脂薄薄层层。克克服服了了多多孔孔型型离离子子交交换换树树脂脂的的不不足足，但但交交换换容容量量低低，柱柱子易超负荷。子易超负荷。3

18、）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。运用载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。运用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子3.流淌相流淌相 离离子子交交换换色色谱谱流流淌淌相相为为盐盐类类缓缓冲冲溶溶液液(有有确确定定pH和和离离子子强强度度)，通通过过变变更更pH、缓缓冲冲剂剂类类型型、离离子子强强度度、加加入入有有机机试试剂剂和和配配位位剂剂等等条条件件来来限限制制安安排排比比k，变变更更交交换剂的选择

19、性，进而影响样品待测物的分别。换剂的选择性，进而影响样品待测物的分别。pH值值：影影响响酸酸或或碱碱的的离离解解平平衡衡，限限制制组组分分别别子子形形式式所所占占的的分分数数。当当组组分分以以分分子子形形式式存存在在时时，则则不不被被保保留留；离离子子分分数数越越高高，保保留留值值越越大大。常常用用的的有有柠柠檬檬酸酸盐盐、磷磷酸酸盐盐、甲甲酸酸盐盐、乙乙酸酸盐盐和和氨水等。氨水等。离离子子强强度度I：对对保保留留值值的的影影响响比比pH更更大大。组组分分保保留留值值受受流流淌淌相相中中盐盐类类总总浓浓度度限限制制。增增加加外外加加阴阴或或阳阳离离子子将将增增加加它它们们对对R+或或R-的的竞

20、竞争争实实力力，使使组组分分保保留留值值减减小小。加加入入不不同同种种类类的的盐盐，可可影影响响柱柱的的选选择择性性，因因为为不不同同物物质对交换剂的亲和实力不同。质对交换剂的亲和实力不同。有有机机溶溶剂剂：外外加加有有机机溶溶剂剂通通常常减减小小组组分分的的保保留留值值。其其极极性性越越小小，保保留留值值越越小小。常常用用的的有有机机溶溶剂剂有有甲甲醇醇、乙乙醇醇、乙乙腈腈和和二二氧氧杂环已烷等。杂环已烷等。配配离离子子L：当当大大量量L、组组分分X随随流流淌淌相相进进入入柱柱后后，发发生生配位剂交换：配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分别各种氨基酸或碱类。该法用于分别各种氨基酸

21、或碱类。思思索索：离离子子交交换换色色谱谱法法中中，流流淌淌相相常常以以无无机机盐盐的的缓缓冲冲液液为为流流淌淌相。请问缓冲液的相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分别各有何影响？值及离子强度对分别各有何影响？三、离子色谱三、离子色谱 离离子子色色谱谱(IC)是是70年年头头发发展展的的新新方方法法。其其分分别别原原理理与与离离子子交交换换色色谱谱原原理理一一样样，只只是是流流出出的的各各种种离离子子用用电电导导检检测测器器检检测测。但但由由于于流流淌淌相相都都是是强强电电解解质质，其其电电导导率率比比待待测测离离子子约约高高2个个数数量量级级，这这种种强强背背景景电电导导会会完完全全掩掩盖盖待

22、待测离子信号。测离子信号。为为解解决决此此问问题题，1975年年Small提提出出，在在离离子子交交换换柱柱之之后后，再再串串结结一一根根抑抑制制柱柱。该该柱柱装装填填与与分分别别柱柱电电荷荷完完全全相相反反的的离离子子交交换换树树脂脂。通通过过分分别别柱柱后后的的样样品品再再经经过过抑抑制制柱柱，使使具具有有高高背背景景电电导导的的流流淌淌相相转转变变为为低低背背景景电电导导的的流流淌淌相相，从从而可用电导检测器检测各种离子的含量。而可用电导检测器检测各种离子的含量。例例如如：分分析析阳阳离离子子时时，以以无无机机酸酸为为流流淌淌相相，抑抑制制柱柱为为高高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下

23、列反应：容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：R+OH+HCl(流淌相流淌相)R+Cl-+H2O R+OH+MCl(待测物待测物)R+Cl+M+OH-可可见见，不不仅仅大大量量酸酸转转化化为为低低电电导导的的水水，而而且且待待测测离离子子转转化为具有更大淌度的碱。化为具有更大淌度的碱。该该法法的的不不足足之之处处在在于于：抑抑制制柱柱要要定定期期再再生生、谱谱峰峰在在经经过过抑抑制制柱柱后后会会展展宽宽，降降低低分分别别度度。因因此此有有人人提提出出访访用用电导率很低的溶液电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液如苯甲酸盐稀溶液)作流淌相。作流淌相。思思索索：IC分分别别中中，何何为为抑抑制制

24、柱柱？分分析析阴阴离离子子时时，抑抑制制柱柱中应填充何种离子交换树脂？中应填充何种离子交换树脂？四、离子对色谱法（四、离子对色谱法（IPC）离子对色谱主要用来分别强极性有机酸和有机碱。离子对色谱主要用来分别强极性有机酸和有机碱。1.原原理理：将将与与待待测测物物离离子子A、电电荷荷相相反反的的离离子子B（称称为为对对离离子子或或反反离离子子）加加入入到到流流淌淌相相中中，使使待待测测离离子子与与对对离离子子形形成成离离子子对对AB，该该AB离离子子对对与与A离离子子或或B离离子子的的性性质质不不同同，即即间间接接变变更更了了待待测离子的保留特性。测离子的保留特性。例例如如：固固定定相相为为非非

25、极极性性键键合合相相，流流淌淌相相为为水水溶溶液液，于于流流淌淌相相中中加加入入与与待待测测离离子子A-有有相相反反电电荷荷的的离离子子B+：思思索索：有有一一强强极极性性有有机机酸酸混混合合物物，若若用用离离子子对对色色谱谱法法分分别别，请请问问在在流流淌淌相相中中应应加加入入阴阴离离子子还还是是阳阳离离子子来来形形成离子对？成离子对？由于离子对由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与因与B离子间离子间的成对实力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得的成对实力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物

26、在柱内的保留值不同，从而达到分别的目的。各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分别的目的。五、尺寸排阻色谱法五、尺寸排阻色谱法 尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱又又称称凝凝胶胶(渗渗透透)色色谱谱，主主要要用用于于大大分分子子的的分分子子分分别别。它它是是基基于于待待测测物物分分子子的的尺尺寸寸和和形形态态不同来实现分别的。不同来实现分别的。1.分分别别原原理理：固固定定相相为为化化学学惰惰性性的的多多孔孔凝凝胶胶，它它类类似似于于分分子子筛筛，但但孔孔径径更更大大。凝凝胶胶内内有有确确定定大大小小的的空空穴穴，分分子子体体积积大大的的待待测测物物不不能能渗渗入入孔孔穴穴中中而而被被排排阻阻，较较早早地

27、地被被淋淋洗洗出出来来，中中等等的的部部分分渗渗透透，小小分分子子则则完完全全渗渗透透，最最终终流流精精彩彩谱谱柱柱。即即待待测测物物分分子子按按分分子子大大小小(分分子子量量大大小小)先先后后从从柱中流出。柱中流出。2.固定相固定相3.流淌相的要求：流淌相的要求：能能溶溶解解样样品品且且与与凝凝胶胶相相像像(润润湿湿凝凝胶胶)、粘粘度度小小(增加扩散速度增加扩散速度)。六、亲合色谱六、亲合色谱 主主要要用用于于生生物物大大分分子子与与固固定定相相之之间间的的特特异异亲亲合合力进行选择性分别及纯化的方法。力进行选择性分别及纯化的方法。分分别别原原理理：于于载载体体表表面面先先键键合合具具有有一

28、一般般反反应应性性能能的的环环氧氧或或联联氨氨（称称为为间间隔隔臂臂），然然后后再再连连接接上上配配基基，如如酶酶、抗抗原原或或激激素素。当当含含有有困困难难混混合合试试样样的的流流淌淌相相流流经经这这种种经经固固定定化化的的配配基基时时，其其中中具具有有亲亲合合力力特特性性的的生生物物大大分分子子与与配配基基相相互互作作用用而而被被保保留留，无无此此作作用用的的则则被被洗洗出出；随随后后，变变更更流流淌淌相相pH或或组组成成，再再将将被被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：特点：选择性过滤、纯化效果好。选择性过滤、纯化效果好。七、色谱分别方法的选择七、色谱分别方法的选择