第六章植物离体培养育种讲述案例优秀PPT.ppt

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1、 第六章第六章 植物离体培育育种植物离体培育育种 Tissue culture and breeding1 植物离体培育发展简史、意义和生物学原理组织培育的概念组织培育的概念组组织织培培育育（Tissue culture）是是指指用用无无菌菌方方法法使使植植物物体体的的离离体体器器官官、组组织织和和细细胞胞在在人人为为供供应应的的条条件件下下生生长长和和发发育育的的全全部部培培育育技技术术的的总总称称，也也称称之之为为离离体培育（体培育（In vitro culture）。）。利利用用植植物物体体的的器器官官、组组织织或或细细胞胞，通通过过无无菌菌操操作作接接种种于于人人工工配配制制的的培培育

2、育基基上上，在在确确定定的的光光照照和和温温度度条条件件下下进进行行培培育育，使使之之生生长长发育的技术称为组织培育发育的技术称为组织培育按培育材料分为（按培育材料分为（Gamborg等等)：组织培育的类型组织培育的类型愈伤组织培育愈伤组织培育细细胞胞培培养养器器官官培培养养原生质体培育原生质体培育最为常见的组织培育最为常见的组织培育悬浮细胞培育悬浮细胞培育单细胞培育单细胞培育胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培育叶、花和幼果的部分组织的培育类别 依外植体的不同划分 胚胎培育（embryo culture）未成熟或成熟了的胚器官培育（organ

3、 culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶原基、花原基、或花果的未熟部分组 织 培 育 或 愈 伤 组 织 培 育（狭 义，tissue culture）维管束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等细胞培育 单个游离细胞 （分别出的体细胞/花粉细胞/卵细胞）原生质体培育 除去细胞壁的原生质体 植物组织培育是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培育基础理论探讨的深化，发展极为快速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为探讨对象的各个分支学科都在广泛进行组织培育。发展简史发展简史1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培育的理论基础。1902年，德

4、国植物学家Haberlandt 依据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning 最先成功地培育了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 接受胚培育法获得大量兰花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培育首先获得成功。1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培育，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证明，而且为组织培育的技术程序奠定了基础。1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培育中筛选出至今仍被广泛运用的MS培

5、育基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培育中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培育，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。发展简史发展简史植物组织培育在技术上的发展植物组织培育在技术上的发展q探讨材料范围逐步扩大q培育方法逐步完善q培育基不断改进q试验手段逐步完备胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等；动物细胞+植物细胞/微生物原生质体固体培育发展到液体振荡或旋转培育悬浮培育、液滴培育、双层培育、包埋培育White培育基、培育基、MS培育基、培育基、MT培育基等培育基等植物组织培育在农业上的应用植物组织

6、培育在农业上的应用q倍性育种：花药培育、胚乳培育倍性育种：花药培育、胚乳培育q突变体筛选：愈伤组织培育突变体筛选：愈伤组织培育q创建新种质：细胞融合创建新种质：细胞融合克服胚败育：胚培育克服胚败育：胚培育q植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产组织培育的意义组织培育的意义 胚胎培育 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发育而早期败育的问题。胚珠和子房培育 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，以克服不育性和不亲和性等障碍。细胞及组织培育 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分别及种质的保存和运输等方面。花药及花粉培育 单倍体育种，加速获得纯二倍体

7、。原生质体培育 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工作。愈伤组织培育是最为常见的组织培育方式？愈伤组织培育是最为常见的组织培育方式？愈伤组织（愈伤组织（Callus）：）：原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培育中，指在人工培育基上由外植体长出来的在组织培育中，指在人工培育基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。一团无序生长的薄壁细胞。缘由：缘由：大部分组织培育经验大部分组织培育经验callus再生途径长出植株；再生途径长出植株；callus可以用于悬浮培育和原生质体培育。可以用于悬浮培育和原生质体培育。按培育方法：固体培育、

8、液体培育、看护培育、微室培按培育方法：固体培育、液体培育、看护培育、微室培育、包埋培育等育、包埋培育等按培育过程：初代培育、继代培育按培育过程：初代培育、继代培育组织培育的类型组织培育的类型q外植体外植体（Explants）由活植物体上切取下来的可以用于组织培育的组织或器官由活植物体上切取下来的可以用于组织培育的组织或器官q初代培育（初代培育（Primaryculture）q继代培育（继代培育（Subculture）指外植体的最初培育指外植体的最初培育将初代培育得到的培育体移植于簇新培育基中，这种反将初代培育得到的培育体移植于簇新培育基中，这种反复多次移植的培育，称为继代培育复多次移植的培育，

9、称为继代培育生物学原理生物学原理 植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞都具有再生成完整植株的实力。其是无性繁殖的基础，它是受内源激素调控的。人工限制和调整培育基成分，可使其发育成完整的植株。细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和功能方面的变更，从而在植物个体发育过程中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都 具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的实力。原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从遗传物

10、质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应当具有全能性。理论上讲，生物体的每一个活细胞都应当具有全能性。差异：（差异：（1）受精卵的全能性最高受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的缘由：基因表达的选择性潜在全能性的缘由：基因表达的选择性 科学探讨表明，处于离体状态的植物活细胞，在确定科学探讨表明，处于离体状态的植物活细胞，在确定的养分物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现的养分物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工

11、条件下实现的这一过出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培育。程，就是植物组织培育。生物学原理生物学原理 植物细胞全能性的表达 脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，复原细胞的分裂活性。再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在确定的培育条件下可有转变为各种不同细胞类型的实力。离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体植物植物组织组织培育培育过程过程植物组织培育特点植物组织培育特点培育条件可以人

12、为限制培育条件可以人为限制 组组织织培培育育摆摆脱脱了了大大自自然然中中四四季季、昼昼夜夜的的变变更更以以及及灾灾难难性性气气候候的的不不利利影影响响，且且条条件件均均一一，对对植植物物生生长长极极为为有有利利，便便于于稳定地进行周年培育生产。稳定地进行周年培育生产。生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高 植植物物组组织织培培育育是是由由于于人人为为限限制制培培育育条条件件，依依据据不不同同植植物物不不同同部部位位的的不不同同要要求求而而供供应应不不同同的的培培育育条条件件，因因此此生生长长较较快快。总总体体来来说说成成本本低低廉廉，且且能能刚刚好好供供应应规规格格一一样样的的优优质质种种苗

13、苗或或脱脱病毒种苗。病毒种苗。管理便利，利于工厂化生产和自动化限制管理便利，利于工厂化生产和自动化限制 植植物物组组织织培培育育是是在在确确定定的的场场所所和和环环境境下下，人人为为供供应应确确定定的的温温度度、光光照照、湿湿度度、养养分分、激激素素等等条条件件，既既利利于于高高度度集集约约化化和高密度工厂化生产，也利于自动化限制生产。和高密度工厂化生产，也利于自动化限制生产。技术用途技术用途q快繁：人工种子、茎尖培育快繁：人工种子、茎尖培育q脱毒：微芽嫁接、茎尖培育脱毒：微芽嫁接、茎尖培育q克服杂交不亲和：花药培育、细胞克服杂交不亲和：花药培育、细胞融合融合q种质资源保存和交换：愈伤组织培育

14、、茎尖培育种质资源保存和交换：愈伤组织培育、茎尖培育MSMS培培育育基基 它它是是19621962年年由由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为为培培育育烟烟草草细细胞胞而而设设计计的的。特特点点是是无无机机盐盐和和离离子子浓浓度度较较高高，为为较较稳稳定定的的平平衡衡溶溶液液。其其养养分分的的数数量量和和比比例例较较合合适适，可可满满足足植植物物的的养养分分和和生生理理须须要要。它它的的硝硝酸酸盐盐含含量量较较其其他他培培育育基基为为高高，广广泛泛地地用用于于植植物物的的器器官官、花花药药、细细胞胞和和原原生生质质体体培培育育，效效果果良良好好。有些培育基是由它演化而

15、来的。有些培育基是由它演化而来的。B5B5培培育育基基 是是19681968年年由由GalmborgGalmborg等等为为培培育育大大豆豆根根细细胞胞而而设设计计的的。其其主主要要特特点点是是含含有有较较低低的的铵铵，这这可可能能对对不不少少培培育育物物的的生生长长有有抑抑制制作作用用。从从实实践践得得知知有有些些植植物物在在B5B5培培育育基基上上生生长长更适宜，如双子叶植物特殊是木本植物。更适宜，如双子叶植物特殊是木本植物。一、目前国际上流行的培育基及特点一、目前国际上流行的培育基及特点2 2 植物离体培育须要的基本条件植物离体培育须要的基本条件White培育基培育基 是是1943年由年

16、由White为培育番茄根尖而设计的。为培育番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作年又作了改良，称作White改良培育基，提高了改良培育基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培育。适于生根培育。N6培育基培育基 是是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培育年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培育而设计的。其特点是成分较简洁，而设计的。其特点是成分较简洁，KNO3和（和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培育和其他组织培育。培

17、育和其他组织培育。KM8P培育基培育基 它是它是1974年为原生质体培育而设计的。其年为原生质体培育而设计的。其特点是有机成分较困难，它包括了全部的单糖和维生素，广特点是有机成分较困难，它包括了全部的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培育。泛用于原生质融合的培育。包包括括无无机机成成分分和和有有机机成成分分。无无机机成成分分包包括括大大量量元元素素和和微微量量元元素素。有有机机成成分分主主要要包包括括糖糖类类、维维生生素素、氨氨基基酸酸和和酰酰胺胺类类、含含氮氮碱碱基基、生生长长调调整整剂剂、自自然然复复合合物物（如如水水解解蛋蛋白白、酵酵母母提提取取物物、果果肉肉和和果果汁汁等等）以以及及其

18、其他成分如琼脂等。他成分如琼脂等。培育基的基本成分培育基的基本成分 植植物物对对无无机机盐盐类类的的需需求求具具有有广广泛泛的的一一样样性性，偶偶然然加加以以变变动动。一一般般多多接接受受蔗蔗糖糖。维维生生素素中中最最关关键键的的是是B1，一一般般用用量量为为0.1-0.4毫毫克克/升升。氨氨基基酸酸和和酰酰胺胺只只用用于于某某些些组组织织培培育育，而而在在器器官官增增殖殖阶阶段段加加入入腺腺嘌嘌呤呤也也可可能能是是须须要要的的。关关键键的的有有机机成成分分主主要要是是激激素和细胞分裂素。素和细胞分裂素。培育基成分的性质培育基成分的性质 可可以以接接受受固固体体或或者者液液体体培培育育基基，依

19、依据据不不同同植植物物和和不不同同培培育育阶阶段段而而定定。固固体体培培育育基基中中以以琼琼脂脂质质量量好好，配配制制时时可可以以通通过过调调整整pH值值来来达达到到适适合合的的凝凝胶胶状状态态即即可可。液液体体培培育育基基养时也有固定和搅动两种。养时也有固定和搅动两种。培育基的物理性质培育基的物理性质大量元素大量元素N、P、S、K、Ca、MgN：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分Ca：细胞壁稳定细胞壁稳定Mg：酶及辅酶的成分酶及辅酶的成分微量元素微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo用量少，过多简洁导致中毒用量少，过多简洁导致中毒激素激素v

20、细胞分裂素细胞分裂素v赤霉素赤霉素v生长素生长素促进促进细胞分裂和分化不定芽细胞分裂和分化不定芽6-BA6-BA、KTKT、ZAZA、2iP2iP诱导细胞的分裂和根的分化诱导细胞的分裂和根的分化IBAIBA、IAAIAA、NAANAA、2,4-D2,4-DIBAIBA、IAAIAA和和IAAIAA诱导生根，诱导生根，2,4-D2,4-D诱导愈伤组织诱导愈伤组织抑制愈伤组织形成，促进芽的形成抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GAGA3 3 几种激素的配制方法几种激素的配制方法生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素赤霉素赤霉素95%95%的酒精或的酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH或

21、或KOHKOH0.50.5或或1mol/L1mol/L的的HCl+HCl+微热微热溶于水，溶于水，pH5.7pH5.7但不稳定，用但不稳定，用95%95%的酒精的酒精IAAIAA母液（母液（stock solutionstock solution）每周制备簇新备用，简洁见光分解（几天内），）每周制备簇新备用，简洁见光分解（几天内），也简洁被植株组织在几小时到几天内分解。生长素也简洁被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120110-120C C稳定保存稳定保存1 1小时，小时，但但IAAIAA可以被低可以被低pHpH、光、氧和过氧化物破坏。、光、氧和过氧化物破坏。NAANAA和和2,4

22、-D2,4-D比比IAAIAA稳定。稳定。CTKCTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的试验中，也可能被分解。母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的试验中，也可能被分解。KTKT和和ZTZT在在120120C C处理处理1 1小时仍能稳定存在，小时仍能稳定存在，BA100BA100C C时时2020分钟。分钟。在碱性条件下，在碱性条件下，GAGA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GAGA也变也变成无活性的形式。成无活性的形式。GAGA热不稳定，热不稳定，114114C C处理处理2020分钟降低其活性达分钟降低其活性达90%90%，母液，母

23、液需制备簇新的，并且接受过滤灭菌。需制备簇新的，并且接受过滤灭菌。激素配比模式生生长长素素与与细细胞胞分分裂裂素素的的比比例例确确定定着着发发育育的的方方向向，是是愈愈伤伤组组织织、长长根根还还是是长长芽芽。如如为为了了促促进进芽芽器器官官的的分分化化，应应除除去去或或降降低低生生长长素素的的浓浓度度，或或者者调调整整培培育育基基中中生生长长素与细胞分裂素的比例。素与细胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈伤组织的形成;适中 有利于根芽的分化;低 有利于芽的形成;生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素生长调整物质的运用甚微，一般用生长调整物质的运用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织表示浓度。在组织

24、培育中生长调整物质的运用浓度，因植物的种类、部位、时培育中生长调整物质的运用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的运用为期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的运用为0.05-5mgL，细胞分裂素，细胞分裂素0.0510mgL。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%The explant is completely covered with green shoots,and roots are dev

25、eloping on the lower surface Very few shoots have developed on the explant.No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface,and some root development has occuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmediumt

26、issuecultureintheAfricanVioletNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoor shoot development and no roots.Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAAreducedto0.1mg.l-1More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explantP

27、rofuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoor shoot development and no roots.Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAAreducedto0.1mg.l-1More balanced development

28、of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant有机物质有机物质(Vitaminsandaminoacids)VitB1VitB6VitB3VitB5肌醇肌醇CHLHMEYE硫胺素硫胺素盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇烟酸烟

29、酸泛酸钙泛酸钙水解酪蛋白水解酪蛋白(caseinhydrolysate)水解乳蛋白水解乳蛋白(lactoalbuminhydrolysate)麦芽提取物麦芽提取物(maltextract)酵母浸出物酵母浸出物(yeastextract)促进细胞对培养基的反应固化剂（固化剂（gellingagent）v琼脂琼脂v来于来于seaweedv对植物组织有确定的生理作用对植物组织有确定的生理作用v用量一般为用量一般为7-10g/L，即，即0.7-1%（W/V）v太大，培育基过硬；太大，培育基过硬；v太小，培育基不易凝固太小，培育基不易凝固v不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。不同品牌的琼脂对外植体的反

30、应也不一样。v其它其它gellingagent：vGelrite（脱乙酰吉兰糖胶）：（脱乙酰吉兰糖胶）：v透亮，透亮，Pseudomanas种发酵产物（多糖）种发酵产物（多糖）v成分稳定。成分稳定。碳源碳源养分物质养分物质渗透压稳定剂渗透压稳定剂类型类型蔗糖蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等浓度浓度2-5%2-5%（W/VW/V）低浓度适合于原生质体培育低浓度适合于原生质体培育高浓度适合于胚和花药培育高浓度适合于胚和花药培育作用作用蔗糖长时间高温处理睬发生焦糖化，形成蔗糖长时间高温处理睬发生焦糖化，形成 蛋白黑素，抑蛋白黑素，抑制细胞生长制细胞生长p

31、HpH计计培育基的培育基的pHpH值：值：5.566：thegelmaybetoofirm培育材料降低培育材料降低pH：产生有机酸，：产生有机酸，N利用利用测定方法测定方法vpH试纸试纸vpH计计pH调整方法调整方法v1N的的HCl和和NaOHv在加入在加入agar前调前调pH培育基的选择和配制培育基的选择和配制选择选择择材料和种类而异择材料和种类而异参考前人的探讨参考前人的探讨MS培育基最为基本：培育基最为基本：高浓度的高浓度的N、K和和NH4+自己试验自己试验配制配制配母液（配母液（Stocksolution)取样取样加成分加成分测测pHok母液的配制母液的配制大量元素大量元素微量元素微量

32、元素v浓缩浓缩1010倍（量加大倍（量加大1010倍）倍）v在配制在配制1L1L培育培育基时，只取培育培育基时，只取100ml100mlv浓缩浓缩100100倍（量加大倍（量加大100100倍）倍）v在配制在配制1L1L培育培育基时，只取培育培育基时，只取10ml10ml以以KNO3为例为例1L培育基须要量为培育基须要量为19g。在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。在母液。在母液中的浓度为中的浓度为190g/L，即，即0.19g/ml在配制培育基时，取在配制培育基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g无菌室无菌室培育室和接种室培育室和接种室室内灭菌可用室

33、内灭菌可用2%2%新洁尔敏擦洗新洁尔敏擦洗75%75%乙醇喷雾乙醇喷雾UVUV照射照射2020分钟分钟培育基培育基灭菌方法灭菌方法v高温高压蒸气灭菌高温高压蒸气灭菌v过滤灭菌过滤灭菌121C121C，1.1kg/cm2,15-201.1kg/cm2,15-20分钟，时间过长，培育基成分钟，时间过长，培育基成分易变性失效分易变性失效在高温高压下易分解的培育基和激素类在高温高压下易分解的培育基和激素类器皿和接种工具的灭菌器皿和接种工具的灭菌解剖刀、镊子、剪刀等工具接受干热灭菌法，解剖刀、镊子、剪刀等工具接受干热灭菌法，用烘箱灭菌，用烘箱灭菌，120 C120 C时时1 1小时小时外植体的灭菌原则外

34、植体的灭菌原则充分灭菌，但不能损伤外植体充分灭菌，但不能损伤外植体不同外植体，灭菌要求不一样不同外植体，灭菌要求不一样常用方法常用方法v75%乙醇乙醇v氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）v次氯酸钠次氯酸钠表面杀菌，具潮湿和杀菌作用，浸表面杀菌，具潮湿和杀菌作用，浸3030秒秒常用浓度常用浓度0.1%0.1%处理处理5-105-10分钟，有残毒分钟，有残毒浓度浓度2-10%2-10%，时间，时间15-3015-30分钟，对植物无害分钟，对植物无害培育所需环境条件培育所需环境条件光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不须光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不须要光照；要光照；培育培育前期前期1000-40

35、00lx，后期，后期10000lx。光照时数：不同培育的组织其光照时间不同，光照时数：不同培育的组织其光照时间不同，如烟如烟草愈伤组织接受草愈伤组织接受1000lx16小时小时/日日培育；培育；而花椰菜组织培育则以而花椰菜组织培育则以4000lx9小时小时/日日光照为宜。光照为宜。光质：一般接受日光灯作为光源。组织培光质：一般接受日光灯作为光源。组织培育中关键育中关键的器官形成作用，是种光形态发的器官形成作用，是种光形态发生现象，生现象，是受光敏色素限制的。是受光敏色素限制的。温度：一般习惯将培育物置于恒温下，通常应温度：一般习惯将培育物置于恒温下，通常应用的温度用的温度为为25OC左右。左右

36、。光光3 通过花药及花粉培育的单倍体育种单倍体植物在育种上的意义单倍体植物在育种上的意义 概概念念：凡凡是是具具有有配配子子体体的的染染色色体体数数的的植植物物称称为为单单倍倍体体植植物物。单单倍倍体体一一倍倍体体，是是一一个个“半半倍倍体体”。单单倍倍体体在在自自然然界界普普遍遍存存在在，1922年年发发觉觉了了曼曼陀陀罗罗的的 单单 倍倍 体体 植植 株株，但但 自自 然然 发发 生生 率率 很很 低低（0.0020.02%）。）。人工诱导单倍体在育种上的用途人工诱导单倍体在育种上的用途从从单单倍倍体体的的染染色色体体加加倍倍即即可可获获得得纯纯合合的的二二倍倍体体，也也可获得纯合的多倍体

37、，育种途径快速。可获得纯合的多倍体，育种途径快速。有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。单单倍倍体体植植物物与与诱诱变变育育种种相相结结合合，可可以以加加速速诱诱变变育育种的进程。种的进程。花药及花粉培养工作的进展花药及花粉培养工作的进展起始于20世纪40年头，最初探讨目的是调整和限制从花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世纪的发展，通过花药和花粉培育诱导形成单倍体植物，目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科、十字花科蔬菜作物探讨居多。在曼陀罗、番茄、麝香百合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单倍

38、体植物。花药和花粉培育技术花药和花粉培育技术 1.花药培育技术流程图切下花蕾切下花蕾消毒消毒1010分钟分钟冲洗两次冲洗两次花药接种培育花药接种培育愈伤组织或胚状体愈伤组织或胚状体再生培育再生培育完整植株完整植株 花花药药和和花花粉粉培培育育技技术术花粉培育 的花粉分别和培育方法机械分别培育法（包括液体培育基培育法和固体培育基培育法）；散落花粉（shed pollen）培育法。花药培育和花粉培育之比较花药培育和花粉培育之比较 统统计计表表明明，通通过过花花药药培培育育获获得得单单倍倍体体的的植植物物种种类类或或品品种种较较多多；设设备备上上要要求求简简洁洁。花花粉粉培培育育有有花花药药培培育育

39、不不能能比比拟拟的的优优点点完完全全解解除除了了花花药药组组织织的的干干扰扰，避避开开花花粉粉与与花花药药组组织织的的体体细细胞胞形形成成分分裂裂和和增增殖殖的的竞竞争争，更更有有利利于于花花粉粉植植株株的的形形成成，所所诱诱导导形形成成的的胚胚状状体体、愈愈伤伤组组织织及及植植株株均均来来自自花花粉粉，可可省省略略对对其其鉴鉴定定的的程程序序；在在诱诱导导形形成成单单倍倍体体的的同同时时，若若结结合合突突变变体体筛筛选选和和进进行行基基因因操操作作探探讨讨时时，花花粉粉培培育育更更具具优势。优势。花药培育技术花药培育技术1964年年Guha&Maheshwari南洋金花花药培育发育成胚；南洋

40、金花花药培育发育成胚；1967年年Bourgin&Nitsch花药培育获得烟草植株；花药培育获得烟草植株；花药培育方法：花药培育方法：接种了花药的培育基一般在接种了花药的培育基一般在24-27OC，光照为，光照为2000lx，每天每天14小时培育。大约经过小时培育。大约经过20-30天，即可发觉花药开裂，天，即可发觉花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织转移至分化培长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织转移至分化培育基上培育，便可以进一步分化再生出完整植株来。育基上培育，便可以进一步分化再生出完整植株来。花药材料的选取花药材料的选取 选材关键在于选取花粉处于合适发选材关键在于选取花粉

41、处于合适发育期的花药，离体培育后才能启动花粉育期的花药，离体培育后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。大多数园艺植物的花药培育，成功大多数园艺植物的花药培育，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。率最高的时期为单核期，或单核中晚期。花药培育技术步骤花药培育技术步骤选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾取下花蕾3-5度低温冷处度低温冷处理理3-10天天取花药取花药镜检镜检消毒接消毒接种培育种培育再生再生花粉培育花粉培育50年头起先裸子植物花粉培育，获得愈伤组织；年头起先裸子植物花粉培育

42、，获得愈伤组织；50、60年头被子植物花粉培育失败；年头被子植物花粉培育失败；1974年年Nitsch等次曼陀罗和烟草花粉获得植株等次曼陀罗和烟草花粉获得植株花粉培育的优点花粉培育的优点q从少量花粉获得大量花粉植株；从少量花粉获得大量花粉植株；q避开花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，干脆视察小孢子避开花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，干脆视察小孢子发育过程；发育过程；花粉培育技术步骤花粉培育技术步骤v药壁向花粉供应养分物质；药壁向花粉供应养分物质；v通过药壁吸取、贮存和转化培育通过药壁吸取、贮存和转化培育基中的外源物质基中的外源物质选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾取下花蕾（镜检）（镜检）预培养数天

43、预培养数天取花药取花药接种接种分离分离花粉花粉低温预处理低温预处理消毒消毒过滤离心过滤离心再生再生影响花药（粉）培育的因素影响花药（粉）培育的因素q供体基因型差异和发育差异供体基因型差异和发育差异甜椒、天竺葵甜椒、天竺葵旺盛植株，早期花蕾旺盛植株，早期花蕾q花药（花粉）的生理状态花药（花粉）的生理状态q花粉发育期花粉发育期四分体期、小孢子早期、中期和四分体期、小孢子早期、中期和晚期（单核靠边期）晚期（单核靠边期）、有丝分裂期和双核花粉期有丝分裂期和双核花粉期 利用花粉和花药培育于育种时，需足量供选择单倍体植株。利用花粉和花药培育于育种时，需足量供选择单倍体植株。故如何提高诱导形成率特别重要。培

44、育条件很关键。故如何提高诱导形成率特别重要。培育条件很关键。q培育前低温预处理培育前低温预处理q培育基与培育方式的影响培育基与培育方式的影响花药、花粉培育前和培育初期的短期高温、低温、离心、花药、花粉培育前和培育初期的短期高温、低温、离心、减压等。减压等。3-5 3-5C3-10C3-10天，提高小孢子反应实力：曼陀天，提高小孢子反应实力：曼陀罗、天仙子、柑桔罗、天仙子、柑桔花药培育接受最多的培育基为花药培育接受最多的培育基为MSMS。我国科学工作者研制。我国科学工作者研制的的N6N6和马铃薯培育基；和马铃薯培育基；液体悬浮培育比固体培育基好；液体悬浮培育比固体培育基好；细胞分裂素有利于花粉胚

45、形成；细胞分裂素有利于花粉胚形成；早期要求高蔗糖浓度：早期要求高蔗糖浓度：5-10%5-10%再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍 在通过花药培育获得的再生植株中，除单倍体植株外，非单倍体出现的频率与植物种类、再生途径以及培育基的成分有关。一般来说，在通过胚状体途径获得的再生植株中，其单倍体植株占有率较高。但种类不同也存在差异。例如从烟草花药再生植株几乎全部是单倍体植株，而在大白菜和油菜上，单倍体植株则分别占74%和22%。在经过愈伤组织、器官分化途径所获得的再生植株中，倍性变更更为常见。如在水稻的花药培育中，再生植株的倍性变更为x5x。1.再生植株的倍

46、性再生植株的倍性随着培育基中植物激素浓度的增加也会降低从中再生植株的单倍体占有率。为什么有此倍性变更？单倍体植株当然来自花粉。二倍体或多倍体植株则较困难，可能是花粉的自然加倍，可能来自花药组织的体细胞及其变异。鉴定方法：视察后代遗传性状是否分别；同工酶分析；分子标记技术等。花粉培育再生的植株倍性也有变更，但由于操作上完全解除了体细胞的干扰，形成二倍体或多倍体均来自花粉的自然加倍。所以，可干脆用于育种实际。2.单倍体植株的保存和加倍 单倍体植株不能正常牢固，为了保持所获得的单倍体材料，常用的方法是将无菌苗的茎尖培育在无激素或低浓度激素的培育基上并定期转移。然而，单倍体非最终育种目标，须要染色体加

47、倍。方法有：A.单倍体植株组织培育再生 切取单倍体植株的茎、叶等组织进行培育，可获加倍植株。B.人工处理诱导加倍 常用秋水仙素处理，洗静后转移到新培育基中诱导植株再生。具体方法有培育细胞的处理；试管小苗的处理；顶芽、腋芽处理；花轴处理等。4 组织和器官培育 组织和器官培育是植物离体培育中探讨最早和比较广泛的。1904年就有十字花科的萝卜、辣根的胚培育苗问世。茎尖培育近年发展快，欣赏植物如兰花、非洲菊和经济作物如甘蔗接受组织培育进行生产性的大量繁殖。果树上利用茎尖和腋芽培育进行砧木的快速繁殖，如苹果矮化砧的1茎尖，8月可繁殖60000株。石刁柏、花椰菜、木立花椰菜等快繁，比传统方法大大提高繁殖系

48、数。自交不亲和系也可通过组织培育方式大量繁殖，可免蕾期授粉之人工和防止自交衰退。无性繁殖作物的“无病苗”生产，据此取得重大进展。马铃薯、芋、大蒜、姜、柑橘等茎尖脱毒。组织培育技术进行种质资源的保存可节约空间，方法简便，繁殖潜力大，避开田间种植的自然杂交，结合低温顺超低温的冷冻贮藏，对于保存遗传资源和运输、交换都很便利。组织培育技术的主要阶段组织培育技术的主要阶段 组织和器官培育技术包括试验室设计、建立和设备；培育基的配制；表面灭菌和接种；试管苗出瓶移栽及后期管理。整个过程分三个阶段：1.无菌培育的建立 主要考虑选择外植体、培育基和环境条件的性质。2.培育再生植株 利用诱导产生愈伤组织和利用茎尖

49、培育诱生不定新梢等途径。3.准备将再生植株移栽入土 包括新梢插条的生根、植株的熬炼和使植株由异样状态变为自养状态。是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培育，包括茎是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培育，包括茎段、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、段、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。花托、果实、种子等。此处指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种此处指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官器官 组织以及愈伤组织的培育。组织以及愈伤组织的培育。器官培育（器官培育（Organculture）组织培育（组织培育（Tissu

50、eculture）茎尖培育茎尖培育1、类型、类型q小茎尖：小茎尖：q大茎尖：大茎尖：材料体积小，不带叶原基的培育难，成苗所需时间长，体材料体积小，不带叶原基的培育难，成苗所需时间长，体积大的则易于成功。积大的则易于成功。2、作用、作用无性系快速繁殖；无性系快速繁殖；培育无病毒苗，品种改良；培育无病毒苗，品种改良；理论基础探讨理论基础探讨10-100 m的茎尖分生组织（脱毒）的茎尖分生组织（脱毒）几十几十mm茎尖或更大的芽（快繁）茎尖或更大的芽（快繁）3、建立无菌材料及培育、建立无菌材料及培育健康植株上选健壮的枝梢健康植株上选健壮的枝梢去叶片用自来水冲洗去叶片用自来水冲洗再生再生培养培养MS培养