第六节-药物的抗病毒实验---安徽医科大学.优秀PPT.ppt

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1、第六节第六节 药物的抗病毒试验药物的抗病毒试验一、目的和要求一、目的和要求1.驾驭药物体外抗病毒的试验方法和操作步驾驭药物体外抗病毒的试验方法和操作步骤。骤。2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。二、内容二、内容（一）原理（一）原理 病毒是一类结构简洁、非细胞形态的专性细病毒是一类结构简洁、非细胞形态的专性细胞内寄生的微生物，必需在易感的活的动物、胞内寄生的微生物，必需在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培育和药物的动物、鸡胚或细胞来进行病毒培育和药物的抗病毒试验。可通过视

2、察细胞培育液酸碱度抗病毒试验。可通过视察细胞培育液酸碱度的变更、病毒致细胞病变效应（的变更、病毒致细胞病变效应（CPE）、病）、病毒滴度（毒滴度（PFU）变更、病毒基因组）变更、病毒基因组mRNA水水平变更、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标平变更、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的变更，来推断药物的抗病毒试验效果。的变更，来推断药物的抗病毒试验效果。（二）材料（二）材料1.910 d日龄鸡胚，壳白净且厚薄匀整的鸡日龄鸡胚，壳白净且厚薄匀整的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选）过程中便于检查，为首选）2.Hep-2细胞或细胞或MDCK细胞

3、细胞3.病毒：如病毒：如IFV（FM1株）、株）、RSV（Long株）株）4.药物：试验药物，阳性比照药药物：试验药物，阳性比照药5.动物：小鼠等动物：小鼠等（三）操作方法（三）操作方法鸡胚培育为常用的病毒培育法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分别、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。1.接种方法病毒的鸡胚培育法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并依据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。一）鸡胚法一）鸡胚法表6-1鸡胚孵育日龄及接种途径选择接种病毒名称接种病毒名称接种部位接种部位鸡胚日龄鸡胚日龄收

4、获材料收获材料痘类病毒、单纯疱疹病毒绒毛尿囊膜9-10绒毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分离羊膜腔12-14羊水某些嗜神经性病毒卵黄囊5-6卵黄液2.IFV-FM1的的50%鸡胚感染量（鸡胚感染量（EID50）测定）测定 用生理盐水将病毒作用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别倍系列稀释，分别接种鸡胚，接种鸡胚，0.1ml/胚，同时设正常比照，胚，同时设正常比照，共共6组，每组组，每组5胚。胚。35孵育孵育72 h，置，置4冰冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算法计算FM1的的EID50。3.药物对鸡胚的毒性

5、作用药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的选用健康的911日龄鸡胚，消毒备用。将日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和比照药作受试药和比照药作10倍系列稀释倍系列稀释56个浓度，个浓度，如如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每个浓度接种，每个浓度接种5胚，胚，0.25ml/胚。胚。35培育培育5 d后视察结果（死后视察结果（死亡亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（毒剂量（TC0），用于正式试验。），用于正式试验。4.药物对药物对FM1的抑制作用的抑制作用 鸡胚随机分为鸡胚随机分为14组，每组组，每组5胚，即试验药胚，即试

6、验药的六个剂量组（从的六个剂量组（从TC0起先作起先作10倍系列稀倍系列稀释）、阳性比照药六个剂量组（同前）、释）、阳性比照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒比照组。将不同浓度的药生理盐水和病毒比照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中，液注入鸡胚中，0.25ml/胚，胚，30 min后经相后经相同途径注入同途径注入100 EID50病毒病毒0.1ml，比照组，比照组以生理盐水代替。以生理盐水代替。35温箱孵育温箱孵育5 d。收获。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（剂量（MIC）。

7、）。4.1鸡胚接种鸡胚接种（1）孵育）孵育910 d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。标出气室和胎位。（2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在气室中心磨一小孔，再用碘酒擦拭。）用磨蛋器在气室中心磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入刺入，沿胚胎的长轴刺入0.51.0cm深度；此时深度；此时针头已在尿囊腔中，注入针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。病毒悬液。（5）拔

8、出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于封闭，置于3536温箱内培育二天，每天翻动温箱内培育二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培育二天后。置两次，用照蛋灯检视一次。培育二天后。置-20冰箱冰箱2 h后，无菌操作收获尿囊液。后，无菌操作收获尿囊液。4.2尿囊液的收获尿囊液的收获（1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。气室部位。（2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳。卵壳。（3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（

9、避开血管裂开），置于无菌试取尿囊液（避开血管裂开），置于无菌试管中。管中。（4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），推断病毒的增殖状况并制试验（定性），推断病毒的增殖状况并对病毒进行鉴定；同时做无菌试验。对病毒进行鉴定；同时做无菌试验。4.3血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验（1）血凝试验）血凝试验血凝试验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内血凝试验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分别培育鉴定和血清学检测。容：病毒的分别培育鉴定和血清学检测。结果推断结果推断 以以“+”号多少表示血凝程度：号多少表示血凝程度：+100

10、的的RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层匀整铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状；呈薄层匀整铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状；+75的的RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势；状，但边缘不整有下沉趋势；+50的的RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块；周有小凝集块；+25的的RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，四周有小凝集块；边缘不光滑，四周有小凝集块；-100的的RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘沉

11、积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。光滑整齐，无凝集现象。以使以使50的的RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的凝效价。计算药物的MIC。（2）病毒血凝抑制试验依据血凝试验滴定的病毒血凝效价，以“2”的凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液配制成含4个血凝单位时，应稀释成1:（1604），即1:40稀释。在做血凝抑制试验时用4个血凝单位。将病毒液配成4个血凝单位。血凝抑制试验的方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒

12、的分别培育鉴定和血清学检测。主要依据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感，因此，探讨人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培育的方法中以单层细胞培育是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培育、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本试验仅介绍对传代细胞的操作方法。二）细胞培育法二）细胞培育法1.病毒病毒TCID50滴定滴定（1）原理）原理 多数病毒感染体外培育的细胞后，常引起细胞多数病毒感染体外培育的细胞后，常引起细胞形态学变更，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，形态学变更，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种变更称为病毒致病变效应（这种变更称为病毒致病变效应（cyt

13、opathic effect，CPE），可以干脆通过显微镜视察，亦），可以干脆通过显微镜视察，亦可通过染色得以识别和推断。可通过染色得以识别和推断。CPE的程度可间接的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培育板孔或试管定病毒的毒力。即能在半数细胞培育板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒的的50组织细胞感染指数（组织细胞感染指数（50tissue culture infectious dose，TCID50）。在从事药物的抗）。在从事药物的抗病毒试验中，

14、常用病毒试验中，常用100 TCID50的病毒感染量进行。的病毒感染量进行。测定时，首先在微量细胞板上培育敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日视察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间依据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖快速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也较快，因此4872h也可以视察、染色、计算。（2）试验材料细胞：MDCK细胞或Hep-2细胞，或其它敏感细胞。病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。试剂：DMEM细胞培育基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、链霉素100U

15、/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，结晶紫染液等。材料：细胞培育板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/组），酒精缸，镊子（2个/组），1ml注射器，毛细吸管等。（3）操作步骤1）制备细胞将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培育液，用PBS当心洗涤2次，留意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。用上述吸管吸取1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约35min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，接着利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞

16、瓶表面脱落下来为止。加入适量养分液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞匀整，吹打时动作要温顺不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为106/ml时即可。一瓶细胞消化后加入适量养分液制成所需细胞悬液，浓度约为1106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培育24h，形成单层后，做病毒滴定用。2）50%组织细胞感染量（TCID50）测定稀释病毒液：取无菌青霉

17、素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入其次管内，反复混合三次，从其次管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-310-9。病毒接种：将长好单层细胞的培育板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的IFV病毒从低浓度起先依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100l。细胞比照孔不加病毒液，只加维持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。结果视察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下视察CPE，病毒可引

18、起细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“-”表示细胞正常；“+”表示有25%细胞产生病变、圆缩、裂开脱落；“2+”有50%细胞产生病变；“3+”有75%细胞产生病变；“4+”有75%以上细胞产生病变（试验时，有的视察24h48h即可染色计算；或逐日视察CPE，直至病毒产生的CPE不再进展为止）。3）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累积数（孔）累积数（孔）病变细胞孔病变细胞孔病毒稀释度病毒稀释度 病变

19、孔病变孔数数/接种孔数接种孔数有病变有病变无病变无病变比例比例百分比百分比%按表中可见，10-3稀释的病变高于50%；10-4稀释的病变低于50%；50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式如下：高于50%病变率-（50%）距离比例=-高于50%的病变率-低于50%的病变率lg稀释倍数100-50=-100-25lg10=-0.67lgTCID50=高于50%病变的低稀释度对数+距离比=-3+(-0.67)=-3.67即1个TCID50=10-3.67，查0.67的反对数为4.68，即病毒做4.68103倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50%细胞产生病变。附录：如何计算200个TCID

20、50？4.68103200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。按计算结果，用100个TCID50病毒进行药物的体外抗病毒试验。2.病毒增殖及病毒感染单位量测定病毒增殖及病毒感染单位量测定2.1病毒增殖病毒增殖 将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细胞将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细胞进行增殖，进行增殖，23 d后出现典型细胞病变，待后出现典型细胞病变，待病变达病变达8090时收获病毒。反复冻融时收获病毒。反复冻融3次次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位试验（位试验（plaque forming unit,PFU）测定）测定病毒的感染量

21、，保存于病毒的感染量，保存于-80备用。在进行备用。在进行药物的抗病毒试验中，亦可用该试验测定药物的抗病毒试验中，亦可用该试验测定药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更精确、牢靠。精确、牢靠。2.2病毒感染单位量测定病毒感染单位量测定用用 PFU 表示。表示。以以5.0105/ml的密度接种敏感细胞于的密度接种敏感细胞于6孔细孔细胞板中。置胞板中。置37、5CO2细胞培育箱中培细胞培育箱中培育，使其育，使其24 h内长成单层；内长成单层；在冰盘上操作，用维持液将病毒作在冰盘上操作，用维持液将病毒作10倍连倍连续系列稀释（续系列稀释（10-110-8）（操作如下

22、图）（操作如下图所示）；所示）；注：即在一系列注：即在一系列2ml2ml的的EpEp管中先加入管中先加入1.8ml1.8ml维持液，取维持液，取0.2ml0.2ml病毒加入第一只病毒加入第一只EpEp管中，充分混匀后病毒稀管中，充分混匀后病毒稀释度为释度为10-110-1，取混合后的，取混合后的0.2ml0.2ml病毒悬液加入其次只病毒悬液加入其次只EpEp管中作为稀释度管中作为稀释度10-210-2，依此类推作系列稀释，则得到，依此类推作系列稀释，则得到连续连续1010倍稀释的病毒悬液。倍稀释的病毒悬液。弃去细胞培育板中各孔中的养分液，每孔接种相应稀释度的病毒悬液0.5ml，每个稀释度重复3

23、孔。37吸附2h，每15min摇动数下以保证病毒吸附分布匀整；弃去各孔中的病毒液，PBS轻轻洗涤一次。每孔加入2ml覆盖层（含6新生牛血清的DMEM与1.5琼脂糖等体积混匀，配好后马上运用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；33，5CO2细胞培育箱中培育3d。剔除覆盖层，每孔加入1ml0.5结晶紫染色10min，自来水冲洗后选择空斑数清晰且易于辨别的稀释度计数空斑，依据空斑数计算病毒的PFU。下图显示的是RSV的空斑形成试验结果。PFU的计算方法：abPFUv（PFU：空斑形成形成单位/ml；a：空斑均数；b：病毒稀释度的倒数；v：病毒量/ml）1：正常比照；：正常比照；26：病毒稀：病

24、毒稀释释度分度分别为别为104，105，106，107，108病毒的空斑形成病毒的空斑形成试验结试验结果示意果示意图图3216542.药物对细胞的毒性测定药物对细胞的毒性测定 已长成单层的细胞（已长成单层的细胞（96孔板），倾去培孔板），倾去培育液，用育液，用PBS洗涤洗涤2次，加入用无血清次，加入用无血清1640作连续作连续10倍系列稀释的受试药物，倍系列稀释的受试药物，100l/孔，孔，每个浓度重复每个浓度重复4孔，并设正常细胞比照。整孔，并设正常细胞比照。整个试验重复个试验重复3次。次。37、5%CO2孵箱中培孵箱中培育育3 d，视察细胞病变效应（，视察细胞病变效应（CPE），按），按R

25、eed-Muench法计算药物的半数中毒浓度法计算药物的半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（）和最大无毒浓度（TD0）。阳性）。阳性比照药的毒性测定，与受试药物同法同步比照药的毒性测定，与受试药物同法同步在同一板中进行。在同一板中进行。4.药物的抗病毒试验药物的抗病毒试验4.1微量细胞病变抑制法微量细胞病变抑制法 已长成单层的细胞（已长成单层的细胞（96孔板），倾去培育液，孔板），倾去培育液，用用PBS洗洗2次，加入次，加入100 TCID50病毒，病毒，100l/孔，孔，375%CO2下吸附下吸附2h，使病毒进入细胞内。弃，使病毒进入细胞内。弃病毒液，用病毒液，用DMEM液洗液洗2次，洗

26、去游离病毒。加入次，洗去游离病毒。加入受试药的受试药的TD0浓度作连续浓度作连续2倍系列稀释的倍系列稀释的6个浓度，个浓度，每个浓度均重复每个浓度均重复3孔，并分别设立细胞比照、病毒孔，并分别设立细胞比照、病毒比照和空白比照孔，阳性比照药同上。比照和空白比照孔，阳性比照药同上。37、5%CO2下培育下培育3 d，记录，记录CPE，按，按Reed-Muench法计算能抑制法计算能抑制50%CPE产生的药物有效浓度产生的药物有效浓度（EC50）。整个试验重复）。整个试验重复3次。次。4.2中性红染色法中性红染色法 基本步骤同上，加入药物培育基本步骤同上，加入药物培育3 d后待后待CPE不不再进展时

27、，弃维持液，用再进展时，弃维持液，用PBS洗洗2次，每孔加入次，每孔加入0.2ml中性红染液（中性红染液（0.04%），避光，），避光，37、5%CO2孵育孵育1.5 h。弃染色液，用。弃染色液，用PBS洗洗2次，控次，控干，每孔加入干，每孔加入0.2ml的的90%乙醇（无水乙醇：乙醇（无水乙醇：0.2M，pH4.2枸橼酸缓冲液枸橼酸缓冲液=9：1），室温放置），室温放置23 h，摇匀，以空白比照孔调零，在酶标仪，摇匀，以空白比照孔调零，在酶标仪546nm处比色，测定其吸光度处比色，测定其吸光度A值。依据各组的值。依据各组的平均平均A值，计算药物的抑制百分率，再按值，计算药物的抑制百分率，再按

28、Reed-Muench法计算法计算50%抑制浓度（抑制浓度（IC50）等各项结）等各项结果。整个试验重复果。整个试验重复3次。次。试验组平均试验组平均A值值-病毒比照组平均病毒比照组平均A值值抑制百分率抑制百分率=细胞比照组平均细胞比照组平均A值值-病毒比照组平均病毒比照组平均A值值 100%4.3 MTT法法 基本步骤同上，当病毒比照组细胞基本步骤同上，当病毒比照组细胞CPE在在(+)(+)时弃培育液上清，每孔加入含时弃培育液上清，每孔加入含5gL MTT的培育液的培育液50l，接着培育，接着培育23 h后弃去后弃去MTT上清，每孔加上清，每孔加DMSO 100l，混匀，混匀5min后，用酶

29、后，用酶标仪测标仪测570nm波特长的吸光度波特长的吸光度A值。按下述公式值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率：计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率病毒抑制率(%)=(药物处理组药物处理组A均值均值-病毒比照组病毒比照组A均均值值)/(细胞比照组细胞比照组A均值均值-病毒比照组病毒比照组A均值均值)100%，结合细胞毒性试验的结果，用统计软件，结合细胞毒性试验的结果，用统计软件SPSS13.0的的Probit回来法，或按回来法，或按Reed-Muench法，计算受试药的半数中毒浓度法，计算受试药的半数中毒浓度TD50和半数有效和半数有效浓度浓度EC50，并计算药物的治疗指数（，并计算药物的治疗指

30、数（TI）。）。4.4空斑抑制法空斑抑制法 参照上述方法进行（略），与病毒比照组比较，计算参照上述方法进行（略），与病毒比照组比较，计算药物的药物的50%抑制浓度抑制浓度IC50。4.4药物对药物对RSV侵入细胞的阻断作用侵入细胞的阻断作用 依据药物毒性试验的结果，从药物的最大无毒浓度起依据药物毒性试验的结果，从药物的最大无毒浓度起先，将不同浓度受试药先，将不同浓度受试药100l预先处理细胞预先处理细胞2 h,以以PBS洗洗涤涤2次后用次后用100 TCID50 的病毒每孔的病毒每孔100l攻击攻击,吸附吸附2 h，每隔每隔15min摇摆摇摆 1次，使病毒匀整吸附。弃病毒液次，使病毒匀整吸附。

31、弃病毒液,加加100l细胞维持液，置细胞维持液，置37、5%CO2培育，每日视察并记培育，每日视察并记录录CPE。试验设正常细胞比照组、病毒比照组、阳性比照。试验设正常细胞比照组、病毒比照组、阳性比照组和药物组。当病毒比照组组和药物组。当病毒比照组CPE在在75%100%时弃培育液时弃培育液上清，每孔加入含上清，每孔加入含5gL MTT的培育液的培育液50l，接着培育，接着培育23h后弃去后弃去MTT上清，每孔加上清，每孔加100l DMSO，混匀，混匀5min后，后，用酶标仪测用酶标仪测490nm波特长的波特长的A值。按值。按Reed-Muench法计法计算药物的半数中毒浓度算药物的半数中毒

32、浓度TD50和半数有效浓度和半数有效浓度EC50。4.5药物对药物对RSV的干脆杀伤作用的干脆杀伤作用 依据药物毒性试验的结果，从药物的最大无毒浓度起依据药物毒性试验的结果，从药物的最大无毒浓度起先，将不同浓度的含药维持液与先，将不同浓度的含药维持液与100l的的100 TCID50病毒病毒等体积混合，等体积混合，37、5%CO2条件下作用条件下作用2 h后，再将其后，再将其感染感染Hep-2细胞，细胞，100l/孔，吸附孔，吸附2 h后用后用PBS洗涤洗涤2次，次，每日视察并记录细胞病变效应（每日视察并记录细胞病变效应（CPE）。试验设正常细胞）。试验设正常细胞比照组、病毒比照组、阳性比照组

33、和药物组。当病毒比照比照组、病毒比照组、阳性比照组和药物组。当病毒比照组细胞组细胞CPE在在75%100%时弃培育液上清，每孔加入含时弃培育液上清，每孔加入含5gL MTT的培育液的培育液50l，接着培育，接着培育23h后弃去后弃去MTT上清，上清，每孔加每孔加DMSO100l，混匀，混匀5min后，用酶标仪测后，用酶标仪测490 nm波特长的波特长的A值。按值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓法计算药物的半数中毒浓度度TD50和半数有效浓度和半数有效浓度EC50。5.治疗指数（治疗指数（TI）按按TI=TD50/EC50 或或TD50/IC50进行计算。药理学试进行计算。药理学

34、试验规定，验规定，TI4表示药物有效。表示药物有效。三）体内抗病毒试验三）体内抗病毒试验1.试验动物的选择试验动物的选择 试验动物在病毒学探讨中的用途主要有：分别试验动物在病毒学探讨中的用途主要有：分别与鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血与鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血清、探讨病毒的致病性、免疫性、发病机理及有清、探讨病毒的致病性、免疫性、发病机理及有效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的种类和试验探讨种接种途径，主要取决于病毒的种类和试验探讨的目的。应依据试验须要选择最敏感动物作为试的目的。应依据试验须

35、要选择最敏感动物作为试验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要依据病毒对动物及组织乳鼠和猴子等，接种时要依据病毒对动物及组织细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行相应指标的检测。为削减个体差异

36、，一般试验选择成年动物，动物体重尽可能一样；如无特殊要求，试验动物的性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜接受。此外，依据试验探讨不同的精确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传限制方法和微生物限制标准培育而成的动物。按遗传学限制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学限制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按确定级别的动物饲养标准饲养，比照组与试验组分笼饲养。2.病毒接种方法病毒接种方法2.1鼻腔接种法鼻腔接种法 试验组小鼠先用乙醚浅麻后，将小鼠头试验组小鼠先用乙醚浅麻后，将小鼠头部仰起，向

37、鼻腔内缓慢滴入确定感染量的部仰起，向鼻腔内缓慢滴入确定感染量的病毒悬液病毒悬液100l左右，正常比照组鼻腔滴入左右，正常比照组鼻腔滴入等量不含病毒的等量不含病毒的PBS或生理盐水，要驾驭或生理盐水，要驾驭麻醉的深浅度。麻醉太深，小鼠能将病毒麻醉的深浅度。麻醉太深，小鼠能将病毒悬液干脆吸入肺中，引起肺水肿，往往于悬液干脆吸入肺中，引起肺水肿，往往于接种后接种后1d内死亡；麻醉太浅，小鼠又试图内死亡；麻醉太浅，小鼠又试图将接种物咳出。将接种物咳出。2.2小白鼠腹腔接种小白鼠腹腔接种（1）用无菌注射器以无菌操作法吸取病毒悬液，解）用无菌注射器以无菌操作法吸取病毒悬液，解除气泡（将注射器针头朝上，使气

38、泡上升，在针除气泡（将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻将气泡推出）。头上裹以消毒棉球，然后轻轻将气泡推出）。（2）右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，快）右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，快速以左手拇指和食指抓紧小白鼠耳颈部皮肤，以速以左手拇指和食指抓紧小白鼠耳颈部皮肤，以无名指及小指将尾巴按在手掌上，使其腹部向上，无名指及小指将尾巴按在手掌上，使其腹部向上，用碘酒消毒腹部皮肤。用碘酒消毒腹部皮肤。（3）使小白鼠头部略向下垂，右手持已吸好病毒液）使小白鼠头部略向下垂，右手持已吸好病毒液的注射器，由腹股沟皮下刺穿皮肤，再沿腹壁下的注射器，由腹股沟皮下刺穿皮肤，再沿

39、腹壁下部刺入，抽吸注射器，如无回血或尿液，即可进部刺入，抽吸注射器，如无回血或尿液，即可进行注射。注入病毒液行注射。注入病毒液0.5ml后将针头退出，用酒精后将针头退出，用酒精棉球消毒针刺部位。棉球消毒针刺部位。（4）将小白鼠标记后放回鼠笼，视察结果。）将小白鼠标记后放回鼠笼，视察结果。2.3皮内接种法皮内接种法 应选择白色动物或动物的白毛处（以背部皮肤为应选择白色动物或动物的白毛处（以背部皮肤为宜）。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用宜）。去毛消毒后，将皮肤绷紧，用1ml的注射的注射器附以最小号的针头，平刺入皮肤，针尖向上，器附以最小号的针头，平刺入皮肤，针尖向上，缓缓注入接种物，此时皮肤应出现小圆

40、丘形隆起，缓缓注入接种物，此时皮肤应出现小圆丘形隆起，否则表示不在皮内。否则表示不在皮内。2.4皮下接种法皮下接种法 多选择腹股沟、腹壁中线或背部注射。局部去毛多选择腹股沟、腹壁中线或背部注射。局部去毛消毒后，用手拇指和食指将局部皮肤提起，右手消毒后，用手拇指和食指将局部皮肤提起，右手将注射针头刺入提起的皮肤下，将接种物缓缓注将注射针头刺入提起的皮肤下，将接种物缓缓注入，些时可见注射处皮肤有轻度隆起，快速拔出入，些时可见注射处皮肤有轻度隆起，快速拔出针头，并以酒精棉球按压片刻，防止注射物外溢。针头，并以酒精棉球按压片刻，防止注射物外溢。2.5肌肉接种法肌肉接种法 多选择腿部肌肉注射。一人抓住试

41、验动物，局多选择腿部肌肉注射。一人抓住试验动物，局部去毛消毒后，另一人将针头刺入肌肉层内，缓部去毛消毒后，另一人将针头刺入肌肉层内，缓缓将接种物注入。缓将接种物注入。2.6静脉接种法静脉接种法 不同动物选择不同部位静脉注射。一般家兔选不同动物选择不同部位静脉注射。一般家兔选择耳静脉，大白鼠、小白鼠选择尾静脉。注射时择耳静脉，大白鼠、小白鼠选择尾静脉。注射时先将动物固定，然后用手指轻弹或以酒精反复涂先将动物固定，然后用手指轻弹或以酒精反复涂擦静脉所在部位，使静脉隆起，以小号针头刺入擦静脉所在部位，使静脉隆起，以小号针头刺入血管，缓缓推入注射物。在注入时，可见血管颜血管，缓缓推入注射物。在注入时，

42、可见血管颜色变白，假如局部发觉有隆起或注射物不易注入色变白，假如局部发觉有隆起或注射物不易注入时，则表示针头未进入血管，应重新注射。时，则表示针头未进入血管，应重新注射。2.7小白鼠脑内接种法小白鼠脑内接种法 本法适用于一切脑炎病毒的分别培育之用。用本法适用于一切脑炎病毒的分别培育之用。用1 ml注射器抽取病毒悬液注射器抽取病毒悬液0.1 ml，去除注射器内的，去除注射器内的气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时气泡。取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒按住小白鼠的

43、体部。右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颞部皮毛（不遇到眼）。右手拿注射小白鼠的右颞部皮毛（不遇到眼）。右手拿注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向进入颅腔，进针进入颅腔，进针23mm，不要插得太深，注射量，不要插得太深，注射量为为0.020.03 ml。注射完毕，碘酒消毒注射局部，。注射完毕，碘酒消毒注射局部，将小鼠放回笼中，室温隔离饲养。逐日视察动物将小鼠放回笼中，室温隔离饲养。逐日视察动物发病状况，动物一般在发病状况，动物一般在34 d起先发病，食欲减退，起先发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、痉挛，渐渐发展为麻痹活动迟纯、耸毛、振颤、痉挛，渐渐发展为麻痹瘫痪而死亡。瘫痪而死亡。